随着人们对蛋白质需求的增加,植物蛋白因其原料易得、经济效率高和健康效益好等优点,在替代动物蛋白方面发挥重要作用。豌豆是植物蛋白重要的作物来源之一,其中的蛋白质含量可达到20%～25%。与大豆蛋白、小麦蛋白相比,豌豆蛋白因其低致敏性、丰富氨基酸含量和良好功能特性等特点,在食品领域具有巨大的发展潜力[1]。因此,它的价值逐渐被人们发现并挖掘。豌豆蛋白中,除了限制性氨基酸蛋氨酸含量较低外,其他氨基酸含量都接近联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)/世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的标准模式[2],是一种良好的必需氨基酸来源。在健康效益方面,豌豆蛋白水解的活性肽具有抗氧化、降糖、调节菌群等多种生理功能。豌豆蛋白的溶解性、起泡性、乳化性和乳液稳定性等功能特性可以在食品和饮料加工、保健食品等多个领域发挥作用[3]。然而,豌豆蛋白还存在豆腥味严重、限制性氨基酸含量低和功能特性达不到加工要求等问题,限制了它的实际应用[4]。
近年来,通过各种改性处理来弥补缺陷并提高蛋白功能特性已经成为提升蛋白价值的重要手段之一。豌豆蛋白常用的改性方式有物理改性、化学改性等[5]。然而,物理改性中热处理能提高液滴絮凝和乳液稳定性,但会对豌豆蛋白结构造成不可逆的破坏,使豌豆蛋白营养价值大打折扣[6]。挤压处理可提高产物的硬度、咀嚼性,多应用在模拟动物肉产品中。但挤压需要对温度和水分严格把控,控制程序较多[7]。化学改性中的pH偏移处理可通过调节pH达到改善乳化性和溶解性目的。添加胆碱类离子改性也具有类似的效果[8]。但这些处理方式安全性尚不能保证。目前也有许多其他新颖的改性技术,如微波、超声波处理、发酵处理等。微波、超声波处理对豌豆蛋白功能特性影响较弱,但需要大量资金投入。而通过发酵处理则耗费时间过长,需要进一步优化。与之对比,酶法改性具有安全、高效和成本低等优势,在当前是比较受欢迎的改性方式之一。
酶法改性可以通过选择不同酶制剂达到不同的修饰效果,如在营养健康方面,通过酶解可以释放丰富的氨基酸和活性肽,提高豌豆蛋白中营养价值[9-11]。还有一些酶水解豌豆蛋白得到的产物具有治疗阿尔兹海默症的功能[12]。在功能特性方面,LIN等[13]用谷氨酰胺转氨酶可以降低豌豆蛋白乳液脱水收缩率,同时保持凝胶硬度来改善豌豆蛋白乳液相的稳定性,以改善豌豆蛋白酸奶的口感。豌豆/乳清蛋白通过谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)诱导交联,产生二硫键,增加表面疏水性从而达到提高乳化稳定性的效果[14]。本文概述了豌豆蛋白的组成,总结了酶法改性豌豆蛋白的作用类型,并归纳综述了酶法改性后豌豆蛋白在食品工业中的应用,为豌豆蛋白的利用与发展提供理论参考。
1 豌豆蛋白组成概述
豌豆的蛋白组成如表1所示[15]。豌豆蛋白中主要发挥作用的是球蛋白和白蛋白。球蛋白含量约占55%～65%,是主要的储存蛋白。球蛋白在极端pH和离子条件下分解为亚基,包括豆球蛋白Legumin(11S)和豌豆球蛋白Vicilin(7S),两者比例约为2∶1。Legumin是六聚体蛋白,6个亚基中的每个亚基由酸性多肽和碱性多肽通过二硫键进行连接。Legumin的疏水键一般位于蛋白内部,最大程度减少了与水的接触。Vicilin是三聚体蛋白(150～180 kDa),包括多晶型豌豆球蛋白Convicilin(8S)。Vicilin中由于缺乏半胱氨酸残基,而不能形成二硫键。Vicilin亚基是糖基化的,其表面具有比Legumin更高的亲水性,可以被裂解成各种低分子质量片段。因为Legumin比Vicilin含有更多的二硫键和更强的疏水相互作用,所以结构更稳固。
表1 豌豆蛋白组成
Table 1 Composition of pea protein
蛋白组分相对占比/%组成沉降系数溶解性分子质量/kDa球蛋白55～65LeguminVicilinConvicilin11S7S8S溶于盐溶液320～410150180～210白蛋白18～25Albumin2S溶于水68.5醇溶蛋白4～5Prolamin/溶于乙醇/谷蛋白3～4Glutelin///
注:/表示无相关信息。
白蛋白(2S)占蛋白总量的18%～25%,是发挥代谢和酶促作用的蛋白质,主要在豌豆种子萌发过程中发挥功能作用。蛋白中有2种小分子质量白蛋白PA1a和PA1b,都具有较高的半胱氨酸含量(7.5% 和16.2%)。此外,豌豆蛋白中还存在少量的醇溶蛋白和谷蛋白,醇溶蛋白可能在一些个体中诱导乳糜泻。谷蛋白是一类不溶性蛋白,其中富含疏水性氨基酸,是构成蛋白复合物的主要成分。豌豆蛋白中各组分蛋白间的比例可能会因不同的生长环境、基因型或加工方法而出现变化,尤其是球蛋白和白蛋白的变化,这会影响豌豆蛋白整体的功能及营养价值。随着人们对豌豆蛋白的深入了解和加工技术的开发创新,豌豆蛋白的应用领域越来越广泛。豌豆蛋白已经不仅仅是作为提供优质蛋白原料,目前在植物基肉制品、乳制饮品、可食用薄膜等新产品开发中都可以看到豌豆蛋白的应用[16]。
2 酶法改性豌豆蛋白的作用类型
通过酶制剂来改性豌豆蛋白是目前常用的改性技术之一,酶一般来源于动物、植物、微生物等,具有较高的安全性。酶法改性豌豆蛋白常用的酶作用类型包括酶水解、酶交联等。通过改变豌豆蛋白分子间作用力及结构改善豌豆蛋白的功能特性和营养特性等。
2.1 酶法水解
酶法水解是利用酶来识别蛋白质中的氨基酸基团,使其发生水解断裂成肽和氨基酸,从而达到改善蛋白质功能的目的。相比于传统的酸水解,碱水解法更加安全、高效,不会对豌豆蛋白中的氨基酸造成破坏。豌豆蛋白中常用的水解酶多数为特异性蛋白酶,识别特定的肽序列结构进行水解。常见的有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等[17]。
不同的水解酶的作用部位和条件不同,如碱性蛋白酶一般在中性至碱性条件下具有水解活性,水解部位为疏水氨基酸的羧基。胃蛋白酶则在酸性条件下活性较高,其优先水解芳香族氨基酸的氨基端肽键,但对羧基端肽键也能发挥作用。酶水解多应用于改善豌豆蛋白的功能特性上。KLOST等[18]在豌豆蛋白乳液中通过胰蛋白酶在特定pH下进行水解,提高溶解度并促进聚集体形成,同时ζ电位的低绝对值引起的缺乏排斥力,导致形成更坚固、有弹性的膜。提高了豌豆蛋白乳液的整体稳定性。XIA等[19]用碱性蛋白酶在pH 8.0、55.4 ℃下水解豌豆蛋白,结果豌豆蛋白水解产物的起泡性和泡沫稳定性分别提高了130%和38%。除了功能特性上的改性外,酶水解还可以降低致敏性。有研究使用11种酶水解豌豆蛋白,用以探究其功能特性及致敏性的改善,结果显示大多数酶改善了豌豆蛋白的溶解度和发泡能力,此外,Alcalase酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶被证明有潜在的降低过敏原的能力[20]。DING等[21]进一步探究证实了Alcalase酶可以调节致敏位点,降低豌豆蛋白的致敏性。
2.2 酶法交联
酶法交联是指在酶的作用下,蛋白质分子内或分子间进行共价交联,从而改变蛋白质结构,提升蛋白质的相对分子质量,有效改善蛋白的持水性、凝胶性等功能特性,且可以提高蛋白的营养价值。目前在改性豌豆蛋白中主要应用的交联酶为TG酶,TG酶在自然界分布广泛且改性豌豆蛋白效果良好,其可以通过3种方式来改变蛋白结构,主要利用蛋白质谷氨酰胺残基上的γ-甲酰胺基作供体与其他肽链上的ɛ-氨基或伯胺基团进行共价交联,来引入其他氨基酸或改变蛋白结构[22],其作用机理如图1所示。
图1 TG酶作用原理
Fig.1 Action mechanism of trans glutaminase TGase
注:Q,提供酰基的肽链或氨基酸;K,提供伯胺的肽链或氨基酸。
TG酶改性豌豆蛋白可涉及到多个方面的应用。ZHANG等[23]通过TG酶催化交联可使豌豆蛋白形成高分子网络结构,在用豌豆蛋白进行高水分挤压制作植物基肉制品的过程中,加入TG酶使挤压过程中蛋白分层的层结构间相互作用得到加强,挤出物有更好的层状纤维结构和质构特性。除在模拟肉制品中的应用外,TG酶还可以用来改善蛋白凝胶强度。LIU等[24]用阴离子诱导微生物谷氨酰胺转氨酶(microbial transglutaminase,MTGase )来交联豌豆蛋白,来改善分子结构的折叠,增加蛋白质-蛋白质的相互作用,结果提高了豌豆蛋白泡沫能力和稳定性并降低了凝胶化温度。此外,蛋白质谷氨酰胺酶交联豌豆蛋白进行脱酰胺作用也得到应用,LUO等[25]通过用蛋白质谷氨酰胺酶对豌豆分离蛋白进行修饰,使蛋白质空间结构展开和延伸,从而暴露出更多的疏水基团。当脱酰胺程度大于20%时,蛋白质解折叠,增强与水的相互作用,减少蛋白质聚集,提高乳液稳定性。多酚氧化酶类改性蛋白也逐渐引起人们重视,如酪氨酸酶和漆酶。酪氨酸酶是含铜的氧化还原酶,其具有独特的双重催化功能,既能催化一元酚氧化成二元酚,也能将二元酚氧化成邻苯醌。因此,酪氨酸酶可将蛋白质侧链中的酪氨酸氧化成醌,从而进一步与蛋白质中的赖氨酸、酪氨酸和半胱氨酸残基交联。酪氨酸酶使豌豆蛋白与玉米醇溶蛋白混合交联,可延长乳液的稳定性,并导致明显的凝胶状结构。而漆酶通过与绿原酸协同作用促进豌豆蛋白聚集体形成,显著提高豌豆分离蛋白(pea protein isolate,PPI)的乳化活性、乳化能力、凝胶强度和持水性[26-27]。
2.3 酶法脱酰胺
脱酰胺是一种改性蛋白质的重要手段,用来脱去蛋白侧链的基团,转化为羧基,以此来改善蛋白质的特性。脱酰胺可分为水解反应和β-转变2种机制进行。酸性条件下(pH<5),蛋白质或肽可直接水解脱去酰胺基团;pH偏中性或碱性条件下(pH>5)发生β-转变机制,酰胺基团在—OH或酶催化下,以水为介质,酰胺键断裂,形成羧基。豌豆蛋白通过脱酰胺处理,可以减轻豆腥味,提高豌豆蛋白的整体风味特征和加工特性。
常用的脱酰胺方法可分为酶法、非酶法和混合脱酰胺3种。酶法脱酰胺与非酶法相比,具有可选择酶系丰富、作用效果明显、条件温和等优点,更受到科研人员的认可。目前可用在食品加工中脱酰胺处理的酶制剂包括转谷氨酰胺酶、蛋白酶、肽谷氨酰胺酶和蛋白质谷氨酰胺酶等。与其他酶相比,蛋白质谷氨酰胺酶可诱导谷氨酰胺残基水解生成谷氨酰胺和氨,而谷氨酰胺酶可特异性地使蛋白质和肽中的谷氨酰胺和天冬氨酸残基脱酰胺,并且2种酶作用并不会伴随其他反应发生[28]。WANG等[29]使用谷氨酰胺酶对豌豆蛋白进行脱酰胺处理探究对风味物质的影响。结果表明,脱酰胺改善了豌豆蛋白的风味成分,去除了不良的豆类风味,并且蛋白结构没有显著变化。FANG等[30]通过研究谷氨酰胺酶脱酰胺,来探究改善豌豆分离蛋白结构和感官特性的可行性,结果表明,脱酰胺处理没有改变碱性蛋白质亚基组成,但在一定程度上改变了蛋白质二级结构组成,降低了砂砾感等。综上,酶法脱酰胺是提高豌豆蛋白结构和风味的可行方法之一。
2.4 酶法脱植酸
植酸是豌豆蛋白中普遍存在的一种抗营养因子。在豌豆蛋白提取加工过程中,植酸会与蛋白质、金属离子等形成不溶物,从而影响矿物质吸收及蛋白质消化,降低豌豆蛋白营养价值。降低蛋白质中植酸含量的方法有pH调节、超滤、植酸酶处理等,其中植酸酶处理是一种简单高效的方法。
植酸酶是一种特殊的磷酸单酯水解酶,有很强地水解植酸的能力。作用机理是通过将植酸中的磷酸残基水解,破坏了植酸对矿物质的亲和力,而释放出来的Ca2+可参与蛋白交联或其他反应,改善蛋白质结构。有研究表明通过植酸酶脱去植酸可提高蛋白质的利用率,同时还能提高蛋白的乳化稳定性和凝胶硬度等[31]。URBANO等[32]使用植酸酶有温水条件下对豌豆蛋白进行处理,使植酸含量下降,并且蛋白质和碳水化合物的代谢利用率得到提升。目前虽然有研究证明植酸酶处理可提高豌豆蛋白代谢利用率,但植酸酶处理对于食品原料功能特性的影响也需要进一步研究,以扩大其在食品工业中的应用。
2.5 其他酶改性作用
除以上酶作用机理外,目前也有研究使用其他酶作用改性蛋白质的方法,如酶法磷酸化作用、酶法糖基化作用。酶法磷酸化通过在蛋白质侧链活性氨基酸基团上接入磷酸达到改善蛋白质的目的。此法因作用条件温和、反应位点高度专一、营养价值无损失等优点曾经是食品改性的热点。但当前酶法磷酸化存在的效率较低、成本太高等缺陷,限制了其在食品工业中的大规模应用[33]。酶法糖基化是利用TG酶来催化蛋白质中谷氨酰胺残基与酰基供体共价结合,产生糖蛋白。在TG酶催化下,蛋白质与氨基糖发生共价结合反应,产物糖蛋白兼具蛋白质的大分子特性和糖类的亲水特性,使蛋白质的功能性质有不同程度的改善,尤其是对溶解度低的植物蛋白具有更好的效果。YANG等[34]使用TG酶诱导壳聚糖糖基化,研究其对豌豆蛋白结构和功能特性的影响,壳聚糖糖基化可改变豌豆球蛋白的结构,从而提高其乳化性、热稳定性和体外消化稳定性等特性。关于糖基化的研究还比较少,存在效率低、反应体系复杂等问题,当前并不适用于食品加工,还需进一步探索。
3 酶法改性豌豆蛋白在食品工业中的应用
豌豆蛋白经酶法改性后具有更良好的功能特性,在食品工业中有很大的发展空间,当前酶法改性在豌豆蛋白的工业化应用种类上得到了巨大补充,可以用酶法改性达到强化或包埋活性物质、增强营养和改善稳定性等作用。目前豌豆蛋白主要应用于肉类替代品、风味物质的包埋、营养强化剂、功能性饮品等[35]方面。而在应用的过程中通过酶法改性作用可以弥补或消除存在的功能缺陷,提高豌豆蛋白的使用价值。
3.1 植物基肉制品中的应用
相比于传统动物肉,植物基肉制品具有低胆固醇含量、丰富氨基酸等优势。高水分挤压技术是当前研究较多的植物基肉制品加工方法,其通过将植物蛋白原料在机体内混合,高温高压下破坏蛋白质中的二硫键、氢键等作用力,使蛋白质处于熔融状态,在高剪切力下产生定向蛋白结构,通过冷却阶段重新形成蛋白三、四级空间结构,挤出后得到具有类似动物肉纤维的植物基肉制品。
豌豆蛋白氨基酸均衡、抗营养因子少,可作为植物基肉制品的主要原材料之一[36]。在使用高水分挤压技术制备植物基肉制品的技术应用中,豌豆蛋白含有较高的疏水性氨基酸,使得挤出物有很好的持油能力,赋予挤出物更好的口感。但由于凝胶性差,形成的蛋白纤维结构不如大豆蛋白[37]。通过添加TG酶交联豌豆蛋白,得到的蛋白挤出物纤维结构可以得到明显的提升,且没有其他安全隐患[38]。作用机理见图2。此外,SAKAI等[39]利用漆酶和果胶处理豌豆蛋白,可以提高植物肉饼的质构特性和保水能力,减少蒸煮损失。KALEDA等[40]通过植酸酶处理豌豆蛋白,使得挤出物中的抗营养因子减少,增加挤出物的营养价值,同时对理化、感官质地的影响很小。ZHOU等[41]使用木瓜蛋白酶处理豌豆蛋白后进行挤压,可使挤出物酶解产物的DPPH自由基清除能力高达97%以上,显著提高了挤出物的抗氧化能力。
图2 TG酶在高水分挤压中交联豌豆蛋白作用原理
Fig.2 Mechanism of TGase in high moisture extrusion
3.2 风味物质的包埋
健康安全、可持续的生物材料作为包埋剂是未来发展趋势,改性处理可以改善豌豆蛋白的乳化性、稳定性等功能特性,改性后的产物可作为生物活性物质的包封材料。ACQUAH等[42]使用酶法改性后的豌豆蛋白作为生物材料,以甘油为增塑剂加工得到的蛋白质薄膜具有良好的物理机械性能。WANG等[43]通过微生物转谷氨酰胺酶MTGase与苹果果胶联合使用,对豌豆蛋白进行修饰,增强其胶凝特性,复合凝胶表现出优异的保护能力,益生菌的存活率可达90%以上,可作为有效的递送系统。为了在食品系统中引入活性物质成分,目标物质的稳定性和可控释放是非常重要的因素。作用方式见图3。除了使用豌豆蛋白作为单一载体包埋外,与其他生物材料结合作为聚合物递送体系成为实现这一问题的可行方法。GUO等[44]用豌豆蛋白和鼠李糖脂得到的复合物在体外消化过程中具有姜黄素的可控释放和胃液中更高的酸稳定性。
图3 TG酶交联豌豆蛋白颗粒包裹姜黄素在胃肠道中的释放
Fig.3 The release of curcumin encapsulated by TGase cross-linking pea protein in gastrointestinal tract
3.3 蛋白乳液中的应用
豌豆蛋白的乳化特性主要取决于豌豆蛋白的两亲性。需要平衡亲水性和疏水性才能很好地将蛋白吸附在水包油(oil/water,O/W)界面[45]。亲水性使豌豆蛋白吸附向O/W界面移动,当附着在界面上时,蛋白质的疏水性基团促进了吸附,然后蛋白结构发生重排使疏水性部分保持在油相中,蛋白质分子能够在界面形成黏弹性薄膜并通过空间位阻和静电排斥分散作用稳定薄膜[46-47]。豌豆蛋白的乳化性很大程度上取决于提取方法,如超声波辅助碱法能显著提高豌豆蛋白的乳化性和乳化稳定性[48]。提取后的豌豆蛋白通过酶处理可进一步改善其特性,以满足在食品工业中的实际应用需求,水解酶作用机理如图4所示。TAMM等[49]用胰蛋白酶处理的豌豆蛋白乳液具有优越的物理化学和抗氧化性能。获得的肽段形成具有增强黏弹性的界面薄膜,可减少喷雾干燥乳液中菜籽油脂质氧化。ZHAN等[50]用TG酶来诱导豌豆蛋白共价交联,油滴可以形成致密团簇,以此证明使用豌豆蛋白稳定的酶固定化乳液凝胶的形成,并可用作营养输送的载体。
图4 酶水解豌豆蛋白提高乳液稳定性
Fig.4 Hydrolase enzymes improve pea protein emulsion stability
3.4 功能性食品的应用
蛋白质通过酶水解产生小分子肽或氨基酸等,其中一些肽链具有生物活性,包括抗氧化、抗菌、抗高血压和抗糖尿病等,这些成分可用作功能性食品的主要原料。KIM等[51]通过乳酸菌发酵产生的酶来改性豌豆蛋白,结果经过体外消化后蛋白相对分子质量降低了98.79%,生物利用度提高了38.40%;有效的提高了豌豆蛋白的吸收利用效率。血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)能将血管收缩性血管紧张素Ⅱ降解为血管紧张素,对心血管系统产生保护作用。LIAO等[52]使用胰蛋白酶水解豌豆蛋白,对水解产物进行色谱分离后鉴定出具有AKSLSDRFSY序列的ACE2上调肽。CHANG等[53]以多种酶水解豌豆蛋白,水解产物中的小分子肽具有保护过氧自由基诱导的细胞氧化损伤能力。作用原理如图5所示。此外,人体肠道微生物的特征和状态与人体肥胖、2型糖尿病、癌症和心血管疾病等病理状态有很大关系[54-55]。已有研究证实豌豆蛋白酶水解产生的多肽与肠道微生物群调节之间存在密切联系[56]。如RATHI等[57]进行随机、临床试验评估食用补充有酶-益生菌混合物的豌豆蛋白后氨基酸吸收和微生物菌群的变化,经过大量研究分析,揭示了定期食用补充酶-益生菌复合物对蛋白质消化率、氨基酸吸收和肠道微生物有积极改变。
图5 抗氧化多肽保护细胞中过氧自由基导致的氧化损伤
Fig.5 Antioxidant peptides protect cells from oxidative damage caused by peroxyl radicals
注:MDA为丙二醛;ROS为活性氧;Nrf2为一种转录因子,Keap1为一种底物衔接蛋白;ARE为抗氧化应激元件;NQO1、GCLM、HMOX1为抗氧化酶基因。
3.5 其他方面应用
酶法改性的豌豆蛋白除以上应用外,目前也有开发豌豆蛋白饮品,豌豆蛋白饮料需要解决溶解度、泡沫稳定性的问题。溶解性受到蛋白质表面电荷和疏水作用力的相互影响。酶解通过特定位置氨基酸发生断裂,产生更多的点电荷氨基酸,进而减弱蛋白质间聚集倾向,从而增加了蛋白质的溶解性,使豌豆蛋白饮料具有更好的风味和稳定性[58]。近年来,预制菜的研究也非常热门,通过酶法改性的豌豆蛋白可以作为原辅料应用在预制菜中,来达到一些营养健康的需求[59]。
4 总结
随着人们对健康饮食和可持续发展的关注不断增加,利用酶法改性技术作用于豌豆蛋白取得了一定的研究成果,并且极大地增加了豌豆蛋白的应用范围。特别是针对豌豆蛋白功能特性上存在的不足,酶法改性不仅不会影响营养健康,而且对功能特性作用效果明显。对比传统的物理、化学改性,其在安全、健康方面等具有很大的优势。并且随着研究的不断深入,改性豌豆蛋白可选择的酶种类,作用效果等将会迎来巨大的进步。
然而,酶法改性豌豆蛋白目前仍然存在着巨大的挑战。首先,酶法改性技术目前多在实验室研究水平上,实际应用较少,后续需要与工业化应用方面更全面的整合,着力解决生产应用问题;其次,酶法改性豌豆蛋白因其相互接触面积有限和反应速度慢的限制,在改性效率上与物理、化学改性等方法还存在一些差距,目前有酶固定化技术和复合改性技术可用来减少酶作用时间、提高改性效率,但方法尚不成熟,后续研究需要对其操作方案进行更全面的探索以及开发新的安全高效的方法;最后,酶法改性豌豆蛋白的安全性问题仍然是人们关注的重点,虽然有研究证明一些酶制剂不会带来安全性等问题,但在实际应用中,酶改性产物对人体的肠道菌群和消化吸收效果引起的变化是十分复杂的,还需要对酶法改性技术构建更全面的评估方法和评价体系,加强蛋白质改性研究与人体营养健康研究的相互联系,以实现酶法改性技术在豌豆蛋白中真正安全、健康的应用。相信随着科技的不断进步和科研人员对研究的深入,酶法改性技术会逐步发展、完善,成为让人们放心且有效的方法。
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