大曲是浓香型白酒酿造过程中酶系、菌系与物系最重要的提供源之一,具有糖化、发酵及生香等功能,对基酒品质起着至关重要的作用[1-2]。在制曲过程中,存在于自然界的酿酒功能微生物如酿酒酵母、芽孢杆菌及曲霉等被富集于大曲上,在其中繁殖代谢为后续酿酒活动提供重要的酶、微生物、风味物质与营养成分[3]。于生态角度而言,该过程中富集的功能菌群结构与种类十分关键,将进一步决定其产生的酶系及代谢产生的风味物质群组成结构并影响基酒品质[4]。
大曲功能菌群最终的富集效果与原料小麦中营养物质的存在形式与组成密切相关[5]。依据类型划分,小麦可分为硬质小麦与软质小麦,两者在外观及营养结构上存在明显差异。硬质小麦颗粒粗圆、角质状多、细粉率高、玻璃质高且蛋白质含量高;软质小麦皱缩狭细、角质少、细粉率低且淀粉含量高(支链淀粉)[6]。上述营养物质及性状的差异是导致软质麦曲与硬质麦曲所富集微生物组成结构及代谢状态不同的主要原因[5]。作为制曲的主要原料,现有大曲用粮多关注小麦品种及小麦硬度对其品质的研究,而关于不同大曲投窖后对酿造效果的影响研究甚少[7]。
现代社会飞速发展,消费者对优质白酒需求更为迫切,从各个角度改进升级酿造工艺,提升优质白酒产量与品质是传统工艺发展的长远方向。本研究对白酒酿造重要要素之一的大曲原料硬质麦曲、软质麦曲进行了多轮次实际生产试验,通过从理化指标、微生物、温度变化、基酒产量、感官品质及基酒风味物质等方面,来探究硬质麦曲与软质麦曲对酿造生产的影响,为制曲工艺小麦类型的选择提供策略,同时也为浓香型白酒工艺的改进提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
材料:实验酒醅源于四川省某酒厂质量相近、窖龄相同的老窖池。所用大曲(硬质麦曲与软质麦曲)除原材料不同外,其余制曲工艺、储存期都相同,均来源于该酒厂制曲车间。
试剂:可溶性淀粉、葡糖糖、乙酸、乙酸钠、无水乙酸钠、NaOH、CuSO4、酒石酸钾纳等,以上均为分析纯,成都市科龙化工试剂厂;乙醇(50%)、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯等标准物质,均为色谱纯,坛墨质检科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
2 m3蒸馏燃气灶,四川华宇瑞得科技有限公司;GC 78890气相色谱检测仪,安捷伦科技有限公司;DME35 Ex便携式密度计,奥地利安东帕公司;ZWYR-D240恒温培养振荡器,上海精宏实验设备有限公司;MIX 2000涡旋混匀仪,杭州瑞诚仪器有限公司;ME4001E分析天平,梅特勒—托利多称重设备系统有限公司;艾本德-移液器,南京伊若达仪器设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大曲理化指标检测
对同步投窖的硬质麦曲与软质麦曲理化性质展开分析,包括酸度、水分、糖化力及液化力等,具体参照轻工行业标准 QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》。
1.3.2 大曲微生物基因组DNA提取、PCR扩增和高通量测序
DNA的提取采用改良的CTAB法。使用引物338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌核糖体16S rRNA基因V3～V4高变区进行扩增,使用引物ITS5F/ITS1R(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′/5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对真菌的内部转录间隔区进行扩增。PCR产物用于构建微生物多样性测序文库,在上海派森诺生物科技有限公司使用Illumina MiSeq 2500高通量测序平台进行双端测序。测序原始序列采用FLASH和Trimmomatic软件进行拼接及质控过滤,序列的质检标准为:a)去除序列尾部质量值20以下的碱基,去除质控后50 bp以下的序列;b)引物最大错配数为2,barcode允许的错配数为0,去除模糊碱基;c)最小overlap序列长度为10 bp,且拼接序列的overlap区允许最大错配比率为0.2。采用Uchime软件去除嵌合体序列。使用Usearch(vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/)将序列按照97%相似度聚类,进行操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)划分,提取代表序列,得到OTU表。将细菌OTU代表序列与Silva(Release132,http://www.arb-silva.de)数据库比对,进行分类学注释。
1.3.3 糟醅理化指标检测
参照戴诗皎等[8] 对近红外光谱仪在酒醅中总酯检测的应用,本研究基于GB/T 10345—2022《白酒分析方法》中水分、酸度、淀粉和残糖的检测方法,结合近红外光谱构建快检模型来检测糟醅的理化指标。
1.3.4 感官质量评定
本研究尝评酒样为同种类型用曲窖池每5口单窖酒样混合为一个尝评样本,且所有尝评酒样约由10名(国家级或省级)白酒评委根据GB/T 10781.1—2021《白酒质量要求 第1部分:浓香型白酒》和GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》对酒样进行感官尝评,并对酒样的风味特征进行评价。
1.3.5 色谱分析方法
酒样的风味物质分析采用气相色谱-火焰离子化检测器(gas chromatograph-flame ionization detector,GC-FID)。标准溶液的配制:按照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》的方法精确量取2 mL内标标准品置于100 mL容量瓶中,用体积分数60%的乙醇溶液定容,得到内标溶液。
a)色谱条件:检测温度250 ℃,载气(高纯N2):流速1 mL/min,O2流量150 mL/min,H2流量30 mL/min,尾吹气流量30 mL/min,进样口温度250 ℃,进样量1 μL,分流比30∶1,升温程序:初温30 ℃,保持20 min,以3 ℃/min升至120 ℃,保持0 min,再以6 ℃/min升至230 ℃,保持20 min。
b)定性分析:依据待测物与标准品的保留时间确定。
c)定量分析:将己酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸、己酸共4种目标化合物的纯标准品以一定浓度梯度,分别配制成混合标准溶液,最后将混合内标加入上述标准溶液中进行GC-FID分析,并绘制标准曲线以计算样品中目标化合物的浓度。
1.4 数据处理及分析
采用Excel 2016对所有数据进行初步整理和分析;采用Origin 2021绘制箱线图、雷达图、柱状图等来展示指标间的差异性及优势微生物可视化;采用R 4.3.1语言vegan包对微生物的α多样性进行计算;采用SPSS 22软件对数据进行方差分析(单因素分析,P<0.05视为差异显著),本实验软质麦曲的理化及酿造数据均是以硬质麦曲为对照的相对值。
2 结果与分析
2.1 大曲理化指标及微生物组成差异分析
2.1.1 主要理化指标
大曲理化指标可在一定程度上反映大曲质量的优劣,酸度主要由微生物代谢产生的有机酸,若酸度过高,易掩盖大曲香气,过低则不利于其呈香[8-9]。此外,液化力、糖化力等可一定程度上反映大曲酶系综合活力[10]。分析结果表明,2种麦曲理化指标存在部分差异性(图1),软质麦曲水分含量显著高于硬质麦曲(P<0.05),其增加率为7.1%,这可能由于软质小麦玻璃质含量低,结构松散,较硬质小麦更易保留水分,这与前期研究相一致[6];而软质麦曲的酸度显著低于硬质麦曲(P<0.05),其降低率为13.7%,这可能由于硬质麦曲曲坯形成的微生态环境较符合产酸菌的生长繁殖以及代谢。在糖化力和液化力方面,硬质麦曲与软质麦曲均无显著差异(P>0.05)。
a-水分;b-酸度;c-糖化力;d-液化力
图1 两种麦曲主要理化指标差异比较
Fig.1 Comparison of the differences between the main physicochemical indexes of two types of wheat Daqu
注:ns表示2种麦曲无显著差异性,*表示P<0.05差异显著;**表示P<0.01差异极显著(下同)。
2.1.2 微生物组成差异
硬质麦曲与软质麦曲曲坯中微生物组成既有相似亦有不同。就真菌组成而言,Thermoascus与Thermomyces两属在2种麦曲中均占据较大比例优势。硬质麦曲中尚有Hyphopichia、Aspergillus等优势真菌存在,然而软质麦曲中其余真菌占比不到百分之一,其中硬质麦曲与软质麦曲Shannon指数分别为2.54和1.04,且硬质麦曲中优势真菌多样性更高(图2-a)。就细菌组成而言,硬质麦曲与软质麦曲差异较大(图2-b)。Top 9属水平中仅有4种同时存在于2种麦曲曲坯中,且比例有较大差异。此外,在硬质麦曲中,Weissella、Staphylococcus、Bacillus、Leuconostoc等占据较大优势,且细菌组成的均匀度较高(Pielou均匀度指数为0.68),而软质麦曲主要是Bacillus、Thermoactinomyces及Kroppenstedtia占据较大优势(Pielou均匀度指数为0.57)。
a-真菌;b-细菌
图2 两种麦曲真菌属、细菌属水平变化
Fig.2 Changes in the levels of fungal and bacterial genera in two types of wheat Daqu
注:图中“unclassified”表示在相应分类学地位水平,无法明确这些微生物的具体分类学地位。嗜热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、曲霉菌属(Aspergillus)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉菌属(Rhizopus)、酵母属(Pichia)、帚枝霉属(Sarocladium)、南极菌属(Antarctomyces)、芽殖酵母属(Kazachstania)、小囊菌属(Microascus)、短梗蠕孢属(Trichocladium);魏斯氏菌属(Weissella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、栖热菌属(Thermus)、片球菌属(Pediococcus)、泛菌属(Pantoea)、克罗彭斯特德菌属(Kroppenstedtia)、贪铜菌(Cupriavidus)、不动杆菌(Acinetobacter)、明串球菌属(Leuconostoc)、 糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)。
2.2 理化指标
2.2.1 入窖糟醅
入窖糟醅理化指标可反映发酵的初始状态,其中酸度对发酵微生物的生长及代谢产物的形成有重要影响,是一项重要的发酵参数[11]。糟醅中的淀粉可以提供发酵过程所需的碳源,水分是细菌、霉菌和酵母菌生长代谢不可缺少的物质,环境中的物质循环、能量流动和信息传递都离不开水的直接或间接参与[12-13]。结果表明,在酸度、淀粉及水分方面(图3),使用硬质麦曲、软质麦曲投窖糟醅的初始状态在以上3种观察模式下均无显著差异,分析可能原因是虽硬质麦曲与软质麦曲的酸度、水分存在显著差异,但由于所投大曲占糟醅质量体系比例较小,且尚未经发酵,故该差异在入窖糟醅中被弱化。
a-酸度;b-淀粉;c-水分
图3 两种麦曲入窖糟醅理化指标差异比较
Fig.3 Comparison of the differences in physicochemical indexes of two types of malted grains in the cellar
2.2.2 出窖糟醅
出窖糟醅理化指标可反映窖内糟醅发酵状况,其中酸度高低在一定程度上可代表产酸过程中产酸微生物的活跃程度,酸度越高,产酸细菌越活跃。残留淀粉含量的高低可反映糟醅发酵过程中霉菌类的活跃程度,进而可反映白酒发酵前期的情况[14]。糟醅中的还原糖是由各种淀粉酶水解淀粉而生成的,然后被酵母菌等代谢利用生成乙醇或其他产物,残留还原糖含量可直接反映出糟醅发酵情况,出窖糟水分亦是观测窖池中发酵糟醅的主要控制指标之一[15]。
本研究对硬质麦曲、软质麦曲出窖糟醅的理化指标进行分析(图4),结果表明,软质麦曲出窖糟醅酸度显著低于硬质麦曲(P<0.05),其降低率为2.3%,这意味着使用硬质麦曲进行续糟发酵可能会为下轮次入窖糟的酸度调整带来更大挑战,若处理不当,续糟发酵或将对糟醅酸度产生持续甚至积累性的影响。软质麦曲出窖糟醅淀粉含量显著高于硬质麦曲(P<0.05),其增加率为1.7%,且入窖糟淀粉含量差异亦不显著。这可能由于软质小麦中淀粉(支链淀粉)含量高,而高支链淀粉会降低酶降解直链淀粉的效率,从而使得糟醅中软质麦曲未利用的淀粉含量比硬质麦曲高,这与前期研究一致[16]。在残糖及水分含量方面,硬质麦曲与软质麦曲均无显著差异。
a-酸度;b-淀粉;c-残糖;d-水分
图4 两种麦曲出窖糟醅理化指标差异比较
Fig.4 Comparison of the differences in physicochemical indexes of two types of malted grains from the cellar
2.3 窖内温度变化
糟醅温度的变化与窖内微生物的生长代谢强度存在紧密联系。在发酵前期,好氧微生物生长繁殖速度快,代谢产热更为剧烈,使得酒醅温度也偏高[17]。本研究以窖内中层温度变化来代表2种麦曲在窖内的发酵状况。2种麦曲的温度变化均呈现“前缓、中挺、后缓落、再挺、再缓落”的变化趋势,但2种麦曲窖内温度变化在整个发酵期均存在一定差异。在发酵前12 d,软质麦曲、硬质麦曲的窖内升温速度基本一致,而在发酵12～16 d,硬质麦曲的升温速度明显大于软质麦曲,且硬质麦曲的顶温高于软质麦曲约1 ℃(图5),这可能是由于硬质麦曲投窖,其投窖前期窖内耗氧微生物代谢更为活跃所致。
图5 两种麦曲窖内温度差异比较
Fig.5 Comparison of temperature differences in the cellars of two types of wheat Daqu
2.4 单窖产量差异
工艺优化的主要目的在于提高基酒的品质和产量[18]。本研究的单窖产量以8甑粮糟酒总和计,且每甑粮糟酒质量需按酒精度60%vol来折算(图6)。结果表明,软质麦曲投窖的单窖产量显著高于硬质麦曲(P<0.05),其提高率为5.1%。可能原因是硬质麦曲投窖顶温更高,表明其发酵窖池中前期好氧菌代谢活性更强,淀粉酶活性高,且更高的顶温可能使得酵母菌以外的微生物在主发酵期更为活跃,利用更多碳源,在总碳一定的情况下,酵母菌可利用碳源减少,从而使得硬质麦曲单窖产酒量更低。
图6 两种麦曲单窖产量差异比较
Fig.6 Comparison of the difference in yield of single cellar between two types of wheat Daqu
2.5 感官质量评定
感官评价是白酒质量评价的重要组成之一,专业尝评人员通过对酒样的色、香、味、格进行品评打分,从而对不同酒样进行质差排序[19]。本研究对硬质麦曲与软质麦曲所产基酒进行品评,就品评得分而言,硬质麦曲与软质麦曲所产基酒无显著差异(图7-a);就品评感官风格而言,软质麦曲与硬质麦曲基酒各有特色,其中软质麦曲所产基酒在窖香、香浓、香正、味净方面更有优势,而硬质麦曲所产基酒在醇和与味甜方面更有优势(图7-b);就品评优胜率而言,软质麦曲的尝评优胜率比硬质麦曲略高,但两者差异不显著(图7-c)。综上所述,在基酒感官质量评定方面,软质麦曲与硬质麦曲无明显差异性。
a-品评得分;b-品评风味频次;c-品评优胜率
图7 两种麦曲基酒品评结果差异比较
Fig.7 Comparison of differences in tasting results between two types of wheat-based liquor
2.6 两种麦曲对基酒风味物质含量的影响
2.6.1 主要影响基酒口感指标含量变化
白酒中总醛类、杂醇油含量极少时,可赋予酒体芳香,且还具有助香和提香的作用,但如果含量较多,就会产生“刺喉感”[20]。甲醇是酿造原辅料带来的有害物质,是在我国蒸馏酒产品中被严格控制的安全指标之一,在GB 2757—2012《食品安全国家标准 蒸馏酒及其配制酒》中限量要求为0.6 g/L。本研究对硬质麦曲与软质麦曲所产基酒中总醛、乙醛、杂醇油及甲醇含量变化进行分析(图8),在总醛含量上,软质麦曲基酒显著高于硬质麦曲(P<0.05),其增加率为2.9%,虽稍高于硬质麦曲,但鉴于品评结果并未出现不适感描述(辣喉、刺激),可判断软质麦曲所产基酒总醛含量仍处于舒适范围内。在乙醛、杂醇油及甲醇含量上,硬质麦曲与软质麦曲均无显著差异(P>0.05)。
a-总醛;b-乙醛;c-杂醇油;d-甲醇
图8 两种麦曲中影响基酒口感指标差异比较
Fig.8 Comparison of the differences in taste indicators affecting base of two types of wheat Daqu
a-己酸乙酯;b-乳酸乙酯;c-乙酸乙酯;d-丁酸乙酯
图9 两种麦曲基酒中四大酯含量差异比较
Fig.9 Comparison of the differences in the contents of the four major esters in two types of wheat-based liquor
2.6.2 基酒中四大酯含量变化
酯类物质是白酒酒体风格呈香的主体物质,主要是由发酵过程中酸和醇酯化反应或酿酒微生物作用下产生的产物。一般具有芳香性气味,多呈现果香,且可不同程度增加酒的香气[21-22]。统计表明,硬质麦曲与软质麦曲基酒中四大酯含量均无显著差异(图9)。
2.6.3 基酒中四大酯占比情况
除四大酯含量之外,基酒中酯比关系是评价基酒品质的重要指标之一。若酯比关系失调会直接导致浓香型白酒质量下滑,严重时甚至导致香型风格变化[23]。浓香型白酒除主体香气成分己酸乙酯外,尤其关注乳酸乙酯与乙酸乙酯的占比情况。其中乳酸乙酯能增加白酒的醇厚感,丰富酒体,延长白酒后味;但乳酸乙酯含量过高会导致酒香不足,后味偏涩[24]。乙酸乙酯含量偏高,会造成酒体浓香不突出,欠协调,酒体设计难度加大,生产成本增加[23]。
2种麦曲所产基酒中四大酯占比情况(图10-a),其中硬质麦曲与软质麦曲的己酸乙酯占比均最高,其值分别为40.55%和42.17%。硬质麦曲与软质麦曲所产基酒中乳酸乙酯与乙酸乙酯的比值分别1.49和1.43,由此可知,硬质麦曲、软质麦曲所产基酒的酯比协调度均无明显差异,且均符合浓香型白酒风格。
a-主要酯;b-主要酸
图10 两种麦曲基酒中酯比及酸比差异比较
Fig.10 Comparison of differences in ester and acid ratios in two types of malt-based liquor
2.6.4 基酒中主体酸占比情况
白酒中酸类物质是糖在发酵过程中的不完全产物,适量酸类物质能给酒体带来爽快感,可使酒体醇厚、丰满,同时酸类物质也作为酯类物质的前体物质,对白酒后味贡献极大,是新酒老熟的重要后备成分[25]。2种麦曲所产基酒中乙酸、己酸、丁酸及丙酸含量均依次降低(图10-b),此外在己酸、乙酸、丁酸及丙酸等四大主要酸含量上,硬质麦曲与软质麦曲均无显著差异性。
3 结论与讨论
本研究解析了硬质麦曲与软质麦曲大曲本身的差异,并结合投窖后基酒单窖产量、口感及风味物质来综合对比分析2种麦曲在正常发酵期酿造效果的差异性。结果表明,大曲酸度和水分呈负相关,其中软质麦曲的酸度显著更低。尽管如此,2种麦曲的入窖糟醅理化指标间均无显著差异,而出窖糟醅的酸度和淀粉含量呈负相关,其中软质麦曲糟醅酸度显著低于硬质麦曲,由此可知,糟醅酸度与大曲酸度同步变化。软质麦曲所产粮糟酒单窖产量显著高于硬质麦曲,这可能由于硬质麦曲发酵初期耗氧微生物较为活跃,窖内顶温更高,酵母菌之外的中温性微生物代谢更为活跃,从而使得酵母菌在主发酵期可转化为乙醇的碳源减少,最终使得硬质麦曲投窖后乙醇转化率更低。从基酒感官质量评定及风味物质含量来看,2种麦曲所产基酒均无明显差异。因此,通过对大曲理化指标与酿造效果来综合分析得出,软质麦曲的投窖效果明显优于硬质麦曲。本研究可为浓香型白酒酿造生产上选择何种制曲原料提供理论参考和数据支持。
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