作为世界肉类生产与消费第一大国,我国生鲜肉占比80%,然而肉类加工、贮藏、流通环节损耗高达8%～10%,远高于发达国家1%～3%的水平,生鲜肉保鲜减损亟待解决。低温保鲜是生鲜肉产品最常见的物理保鲜方法之一,按贮藏温度可分为冷藏保鲜(0～4 ℃)、冰温保鲜(-2～0 ℃)、微冻保鲜(-4～-2 ℃)及冷冻保鲜(-40～-18 ℃)[1]。冷藏和冰温保鲜产品的货架期较短[2],冷冻保鲜虽然可以显著延长货架期,但冷冻过程中冰晶的形成和解冻会使肉的品质下降[3-4]。微冻技术是指在低于冰点1～2 ℃的温度下进行贮藏[5-6]。研究表明,微冻保鲜能够在保持较好产品品质的同时,将产品货架期较冷藏延长1.5～4.0倍[7],是目前较为理想的生鲜肉贮藏方式[8]。
在贮藏过程中,控制温度波动是保证生鲜肉品质的关键。目前,很多研究聚焦于冷藏或冷冻过程的温度波动对鲜肉品质的影响[9]。魏里朋等[10]发现冷藏温度的波动会造成猪肉背最长肌不易流动水含量下降,结合水和自由水含量上升,进而导致持水力下降。同样地,在冷冻贮藏过程中,强烈的温度波动会加速蛋白质和脂肪的氧化,使微生物数量显著增加[11]。孙志利等[12]提出在南美白对虾冷冻贮藏过程中,降低温度波动幅度可有效抑制冰晶的形成,延缓其劣变速度。然而,很少有研究关注微冻贮藏过程中温度波动对鲜肉品质的影响,这使得确定可接受的微冻温度波动水平以有效维持鲜肉品质具有挑战性。DENG等[13]探究了不同程度的微冻处理(-1、-2、-3 ℃)对猪肉品质的影响,结果发现-3 ℃微冻处理可以延长猪肉货架期,且保持较好的猪肉品质。
因此,本研究选取-3 ℃为目标温度,在不同温度波动条件下[-3 ℃、(-3±2) ℃、(-3±4) ℃]对猪背最长肌进行贮藏,系统探究微冻贮藏过程中温度波动对猪肉品质变化的影响,并从水分分布、微观结构及氧化反应的角度,阐释微冻技术下温度波动对猪肉品质的作用机理,以期发掘可适用于猪肉的低温保鲜技术,为微冻贮藏技术在生鲜肉类产业中的应用提供理论依据。本研究也为进一步从生理生化方面改善猪肉品质,挖掘更好的生鲜猪肉保鲜技术奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪背最长肌购买于江苏扬州生平生鲜贸易有限公司,选取活重(110±5) kg的6月龄三元猪(杜洛克×长白猪×约克夏)进行屠宰,取15条新鲜猪最长肌,每条(2±0.2) kg,45 min内运至实验室。将背最长肌切成9 cm×6 cm×4 cm的块状,平均分成3组,真空包装后进行不同贮藏处理。
主要试剂:三氯乙酸、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA),南京巴斯特生物科技有限公司;5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB],上海麦克林有限公司。以上试剂均为分析纯。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒,南京建成生物研究所。
1.2 仪器与设备
CR-400色差仪,日本Minolta公司;Testo205插入式pH计,上海德图仪器有限公司;CR2032插入式温度计,得力集团有限公司;FC5515R台式高速冷冻离心机,美国 OHAUS 公司;FSH-2A匀浆机,国旺仪器有限公司;低场核磁共振仪(low field-nuclear magnetic resonance,LF-NMR),上海纽迈电子有限公司;CM1900冷冻切片机,德国Leica公司;Nikon ECLIPSE CI正置荧光显微镜,日本NIKON公司;BCD-238S冰柜,青岛海尔股份有限公司;C-LM3B数显式肌肉嫩度仪,东北农业大学工程学院。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备
将样品平均分成3组,进行以下贮藏处理:-3 ℃微冻恒温保存(对照组);(-3±2) ℃(-3 ℃贮存4 h,按-3 ℃～-1 ℃～-3 ℃～-5 ℃～-3 ℃循环波动),每12 h调整一次温度(低波动组);(-3±4) ℃(-3 ℃贮存4 h,按-3 ℃～1 ℃～-3 ℃～-7 ℃～-3 ℃循环波动),每12 h调整一次温度(高波动组)。在贮藏的第0、7、14、21天取样,测定相关指标,剩余样品液氮速冻后于-80 ℃贮藏,进行相关生化指标的测定。
1.3.2 肉色
参考程玉平等[14]的方法,使用色差仪对肉色进行测定。将肌肉顺着肌纤维方向切出断面,并于4 ℃空气中暴露20 min。在每个样品的3个不同位置测量L*、a*、b*值,取其平均值进行统计分析。
1.3.3 pH
参考王艺娇等[15]的方法,使用插入式pH计对猪肉样品的pH值进行测定。
1.3.4 真空贮藏损失
将肌肉切成9 cm×6 cm×4 cm的块状,称质量为m1,真空包装储存后,将肉表面的水分擦干并称质量m2。按照公式(1)计算:
真空贮藏损失率
(1)
1.3.5 蒸煮损失
参考袁佳艺等[16]的方法,并适当修改。把肉切成2 cm×3 cm×5 cm,称质量为m3,并放入自封袋中,放入72 ℃中水浴。等待样品的中心温度达到70 ℃,取出用流水冷却,滤纸擦干表面水分,并再次称质量m4。按照公式(2)计算:
蒸煮损失率
(2)
1.3.6 剪切力
参考扶庆权等[17]的方法,蒸煮损失测定后,将样品沿肌肉纤维的方向切成1 cm×1 cm×3 cm的条状。使用肌肉嫩度分析仪垂直肌纤维方向剪切肉条,并记录剪切力值(N)。每组样品平行测定5次。
1.3.7 水分分布
核磁共振的测定参考CHEN等[18]的方法,沿肌纤维方向取1 cm×1 cm×2 cm的样品,封口膜封口后放入核磁管中进行分析。LF-NMR测量参数:90°脉冲与180°脉冲间时间为150 μs。重复采样12次,重复间隔时间为3 500 ms,回波数为4 000。每个样品重复5次。
1.3.8 微观结构观察
取液氮处理后的猪肉样品(0.5 cm×0.5 cm×1 cm),置于冷冻切片机垂直于肌纤维进行切片。将8 μm切片固定在载玻片上,采用HE试剂盒染色,使用显微镜观察猪肉的组织结构并拍照。
1.3.9 肌原纤维蛋白提取
根据HOU等[19]的方法,取1 g肌肉样品切碎后加入10 mL预冷的磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L KCl,10 mmol/L K2HPO4,2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L乙二醇双四乙酸 ,pH 7.0),以8 000 r/min在冰浴中匀浆2次,每次15 s,中间间隔15 s。将匀浆液以1 000×g、4 ℃离心10 min,取沉淀,用8倍体积缓冲液洗涤4次,离心后再次取沉淀。然后用8倍体积0.1 mol/L KCl洗涤沉淀2次,最终的沉淀即为肌原纤维蛋白。将其溶解在8倍体积的孵育缓冲液(0.1 mol/L NaCl,0.1% 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)和5 mmol/L N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES),pH 6.5)中,以备后续指标的测定。
1.3.10 总巯基含量
参考YONGSAWATDIGUL等[20]的方法对猪肉样品的巯基含量进行测定。将0.5 mL肌原纤维蛋白(2 mg/mL)溶解于9倍体积的提取液(50 mmol/L磷酸盐缓冲液,pH 7.0,10 mmol/L EDTA、0.6 mol/L KCl、8 mol/L尿素),充分混匀后,取4 mL混合溶液加入400 μL的1 mg/mL DTNB,混匀后40 ℃水浴25 min。水浴完成后,在412 nm下读取其吸光值。按照公式(3)计算:
总巯基含量
(3)
式中:A,吸光度值;e,消光系数,13 600 L/(mol·cm);D,水浴前稀释倍数。
1.3.11 TBARS
参考李君珂等[21]的方法测定TBARS值。称取2 g猪肉,加入10 mL体积分数7.5%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)和0.1% EDTA进行均质(10 000 r/min,3×20 s,冰浴)。均质后进行离心(10 000 r/min,5 min,4 ℃)。将样品上清液与同体积0.02 mol/L TBA混合均匀,在95 ℃水浴锅中加热30 min。室温冷却后,在532 nm处进行吸光度值测定。TCA溶液和同体积 TBA溶液的混合液作为空白对照,以1,1,3,3-四乙氧基丙烷溶液绘制标准曲线,TBARS值的结果以每千克猪肉样品中丙二醛的质量(mg)表示。
1.4 数据处理
试验数据采用”平均值±标准误差”的形式进行呈现。利用SPSS统计软件,进行单因素方差分析,并做Duncan多重比较,将显著性差异水平设定为P<0.05。运用Origin 2024软件完成图表绘制。
2 结果与分析
2.1 色泽
如图1所示,贮藏期间,对照组猪肉表面的亮度值(L*)无显著变化(P>0.05),而波动组L*值在贮藏后期均显著增加(P<0.05),这表明微冻贮藏中温度波动会影响猪肉的亮度值。此外,在贮藏第21天时,与对照组相比,低波动组的L*值无显著变化(P>0.05),而高波动组L*值显著增加(P<0.05),这可能是由于高温度波动条件下水分大量流失至猪肉表面,光的反射导致猪肉表面L*值增加[22]。类似地,对照组猪肉在贮藏过程中红度值(a*)保持稳定(P>0.05),而低波动组和高波动组猪肉的a*值均显著下降(P<0.05)。贮藏7 d和21 d,3组a*值差异显著,其中高波动组的a*值最低(P<0.05),这说明温度波动程度增加会导致a*值降低,肉色变暗。该结果和PIETRASIK等[23]、WANG等[24]的研究报道一致,温度波动会加速牛肉中肌红蛋白的氧化,使其从鲜红色的氧合肌红蛋白转变为棕色的高铁肌红蛋白。此外,猪肉黄度值(b*)在贮藏过程中升高,在贮藏7 d时,波动组b*值均显著高于对照组,延长至21 d时,高波动组的b*值显著高于对照组和低波动组(P<0.05),这可能是由于较高幅度的温度波动会使肌肉蛋白氧化程度增加,导致黄色色素积累[25]。以上结果表明,微冻贮藏过程中温度波动会导致肉色劣变,且波动幅度增加会加速肉色发生劣变。
a-亮度值;b-红度值;c-黄度值
图1 微冻贮藏中温度波动对猪肉肉色的影响
Fig.1 Effect of temperature fluctuation on the color of pork during superchilling storage
注:不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理组差异显著,不同大写字母表示同一处理组不同贮藏时间之间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 pH
由图2可看出,在贮藏过程中,对照组和低波动组pH值略微上升,但无显著变化(P>0.05),而高波动组猪肉pH值显著上升(P<0.05),并在贮藏第14和21天时,高波动组显著高于另外两组(P<0.05)。以上结果表明,(-3±2) ℃波动处理不会造成肉的pH值发生变化,而温度波动水平进一步提高至(-3±4) ℃,会使猪肉样品反复冻融,在内源酶和微生物的作用下,猪肉内部的蛋白质和氨基酸被分解为氨等碱性物质[26-28],进而导致pH值的上升。
图2 微冻贮藏中温度波动对猪肉pH值的影响
Fig.2 Effect of temperature fluctuation on the pH value of pork during superchilling storage
2.3 保水性
通过测定真空贮藏损失和蒸煮损失来评估微冻猪肉的保水性。从图3可知,各组真空贮藏损失及蒸煮损失均呈上升趋势(P<0.05)。贮藏初期,在钙激活酶等内源酶的作用下,肌原纤维蛋白发生降解,大大减弱了肌原纤维蛋白束缚水分的能力,使得水分从肌纤维内部向外部迁移,造成水分流失。此外,贮藏时间增加,会造成猪肉中的不易流动水逐渐向自由水迁移,使得水分更容易从肉中流失,导致保水性下降[29]。贮藏7、14、21 d时,温度波动组的真空贮藏损失均显著高于对照组,其中高波动组真空贮藏损失最高(P<0.05)。KAALE等[30]的研究报道了类似的结果,温度波动会引起肉中冰晶的反复冻融,细胞内冰晶的反复形成会造成组织结构变化,进而降低肉的保水能力,加剧真空贮藏损失。另外,贮藏7 d和14 d,与对照组相比,低波动组的蒸煮损失无显著变化(P>0.05),而高波动组显著增加(P<0.05),延长至21 d时,3组蒸煮损失差异显著(P<0.05)。以上结果表明,微冻贮藏时间及温度波动均会导致猪肉的保水性下降。
a-真空贮藏损失;b-蒸煮损失
图3 微冻贮藏中温度波动对猪肉保水性的影响
Fig.3 Effect of temperature fluctuation on water-holding capacity of pork during superchilling storage
2.4 嫩度
由图4可知,对照组和低波动组的剪切力值在微冻贮藏14 d时显著下降(P<0.05)。在微冻贮藏过程中,冰晶的形成会对肌肉组织细胞膜的强度造成破坏[31],导致肌肉剪切力降低,嫩度增加。高温度波动组的剪切力值显著高于另外两组(P<0.05),这表明较大的温度波动会使微冻处理的猪肉样品嫩度下降。研究表明,温度波动加剧可能导致肌纤维的无序降解,这会使肌纤维的断面变得不规则和粗糙[5],进而使剪切力增大、嫩度显著下降。另外,较大的温度波动会使猪肉经历反复冻融,导致其保水性显著下降[32],水分流失增加,肉质变得干硬,嫩度也随之降低。
图4 微冻贮藏中温度波动对猪肉嫩度的影响
Fig.4 Effect of temperature fluctuation on the tenderness of pork during superchilling storage
2.5 水分分布
为进一步探究微冻贮藏中温度波动对猪肉品质的影响机理,采用LF-NMR检测猪肉中水分状态和水分含量。在猪肉样品中检测到T2b结合水(1～10 ms)、T21不易流动水(10～100 ms)和T22自由水(>100 ms),反映了不同状态水的自由度。随着贮藏时间的增加,各组样品的弛豫时间T2b无显著变化(P<0.05),表明T2b迁移率较低,结合水与大分子保持紧密结合的状态,因此温度波动对猪肉内部结合水流动性的影响较小。而T21、T22均呈现上升趋势(P<0.05),表明不易流动水和自由水的流动性增加,这与肌肉的保水性变化高度相关[22]。图5-d中,M2b、M21、M22分别代表结合水、不易流动水和自由水的相对含量。随着贮藏时间的增加,微冻猪肉中结合水含量无明显变化,而不易流动水含量降低,自由水含量上升(P<0.05),这是由于肌原纤维结构发生变化,使得肌原纤维网络中的内部水分不断流出细胞膜外,自由水含量增加[30]。贮藏21 d,温度波动组不易流动水含量显著低于对照组(P<0.05),而自由水含量显著升高(P<0.05)。微冻贮藏的猪肉在温度波动处理后发生冰晶重结晶,影响了肌原纤维结构,并促进肌原纤维蛋白网络中的部分不易流动水转变成自由水,进而导致了猪肉的持水力下降[22]。以上结果表明,温度波动会影响微冻贮藏猪肉的水分分布,导致水分的束缚能力减弱,流动性增强,部分不易流动水向自由水转变,导致猪肉的保水性降低。
a-T2b;b-T21;c-T22;d-水分含量
图5 微冻贮藏中不同温度波动条件下水分分布变化
Fig.5 Water distribution change of pork under different temperature fluctuation conditions during superchilling storage
注:图5-d横坐标0、7、14、21为贮藏时间(d), M2b、M21、M22分别代表结合水、不易流动水和自由水的相对含量(%)。
2.6 组织微观结构分析
HE染色结果显示,微冻贮藏过程中温度波动对猪肉组织微观结构的影响主要表现在肌细胞间隙的变化,通常情况下,肌细胞排列致密,肌细胞间隙小,肌肉的保水性越好[33]。如图6所示,贮藏0 d时,肌细胞排列均匀而紧密,随着微冻贮藏时间延长,肌细胞间隙逐渐增大,其中对照组(未经温度波动)的肌细胞间隙最小,表明其肌肉组织学特性更为紧密,这也解释了对照组具有更优的保水性。相较于对照组而言,波动组的肌细胞间隙变化较大,这与李桢桢等[32]的研究结果一致。温度变化会引发冰晶的重结晶现象,冰晶在反复冻结过程中通过小冰晶的聚集、位移及表面渗透等方式生长,导致其体积增大、形状不规则化。这种变化会对肌肉组织产生挤压作用,进而影响持水性、质构等品质特性下降[32]。与(-3±2) ℃组相比,(-3±4) ℃组样品中肌细胞间隙变化更为明显,特别是贮藏14 d和21 d时,肌肉细胞外空间明显变大(红色圆圈所示)。研究表明,肌细胞间隙与汁液流失率呈正相关[34],细胞间隙增加会加剧猪肉样品的汁液流失,导致保水性下降,这也解释了高波动组猪肉样品更低的保水性。综上,微冻贮藏中温度波动能够通过影响猪肉组织结构的紧密状态,进而影响猪肉的保水性。
图6 微冻贮藏中不同温度波动条件下猪肉组织形态学变化
Fig.6 Morphological changes of pork tissue under different temperature fluctuation conditions during superchilling storage
2.7 总巯基含量
如图7所示,贮藏期间,各组的总巯基含量均显著下降(P<0.05),表明微冻贮藏过程中猪肉的蛋白氧化程度升高,这与卢骁等[22]的研究结果一致。微冻猪肉中部分水分形成冰晶后,会破坏肌球蛋白的构象,从而使分子内部的活性巯基暴露,进而氧化形成二硫键。贮藏0 d和7 d时,各组总巯基含量无显著差异(P<0.05),而延长至14 d时,与对照组相比,低波动组总巯基含量无显著变化,而高波动组显著降低(P<0.05)。贮藏21 d时,3组的总巯基含量差异显著,其中高波动组总巯基含量最低。较高的温度波动会造成猪肉反复冻融,冰晶的生长和重结晶可能造成细胞结构发生机械损伤,使蛋白质的空间结构发生变化,导致巯基暴露并更容易被氧化[30]。
图7 微冻贮藏中温度波动对总巯基含量的影响
Fig.7 Effect of temperature fluctuation on total sulfhydryl content of pork during superchilling storage
2.8 脂肪氧化
由图8可知,贮藏时间增加,猪肉的TBARS值显著上升(P<0.05)。冰晶的形成会对肌肉细胞造成机械损伤,从而使肌细胞中更多的氧化酶被释放出来,导致脂肪氧化程度上升[12]。此外,贮藏14 d、21 d时,与对照组相比,高和低波动组TBARS水平显著上升(P<0.05),这是因为波动组中大部分水分未被完全冻结就融化,加剧了氧化反应的发生。另外,贮藏后期,高波动组的TBARS值明显高于另外两组(P<0.05),这与LEYGONIE等[35]的研究结果相符,温度波动程度增加会加剧脂肪氧化,进而导致更高的TBARS水平。
图8 微冻贮藏中温度波动对猪肉TBARS值的影响
Fig.8 Effect of temperature fluctuation on the TBARS value of pork during superchilling storage
3 结论
本文通过设置微冻贮藏过程中不同温度波动范围,探究其对猪肉品质的作用机理。结果表明,±2 ℃温度波动对微冻贮藏猪肉的L*值、b*值、pH和剪切力无显著影响,但会造成a*值降低,真空贮藏损失和蒸煮损失增加。较高幅度的温度波动会加速肉色发生劣变,保水性和嫩度进一步下降。LF-NMR结果表明,温度波动通过影响猪肉内部的水分分布,使部分不易流动水转变成自由水,造成猪肉保水性的降低。另外,微冻贮藏期间温度波动会影响肌肉组织结构,并加剧猪肉蛋白质和脂肪氧化,引起猪肉品质下降。因此,为有效维持较好的猪肉品质,应尽量降低微冻贮藏中的温度波动,并控制在±2 ℃以下。本文研究结果可进一步推动微冻技术在生鲜猪肉保鲜中的应用,并从生理生化方面改善猪肉品质,为生鲜肉保鲜减损奠定理论基础。
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