中国白酒的独特魅力,与其丰富的风味成分密不可分[1],其中酸、醇、酯和醛等主要风味成分,对白酒风格的形成起到至关重要的作用[2],共同塑造了白酒独特的风格特征。然而,这些风味成分在赋予白酒独特风格的同时,也对消费者的健康有着不同程度的影响[3]。因此,深入研究白酒中不同风味成分对健康的影响,对于开发健康白酒具有重要的指导意义。

乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)和乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)是人体内乙醇代谢的关键酶。当机体摄入乙醇后,细胞质中的ADH将乙醇氧化成乙醛,随后ALDH再将乙醛氧化成乙酸,最后乙酸进入三羧酸循环,被氧化分解为CO2和水排出体外[4]。因此,提高机体ADH或ALDH活性,可减轻过量饮酒对肝脏造成的损伤。多项研究结果表明,白酒中的不同风味成分对乙醇代谢关键酶的活性具有较大影响。谢佳等[5]研究发现,异戊醇通过抑制ADH和ALDH活性引起醉酒度升高;曾礼兰等[6]进一步研究指出,除乳酸乙酯外,醇、酯类风味成分通常会抑制ADH活性,除正丙醇外,醇、酯类风味成分会不同程度地促进ALDH活性;刘嫒春等[7]研究表明,增加白酒中大多数醇类和酯类含量均能抑制ADH和ALDH活性;徐佳楠等[8]研究也表明,异戊醇、正丙醇对ALDH活性有抑制作用,过高的高级醇会抑制ADH和ALDH活性[9]。综上所述,白酒中的风味成分确实对乙醇代谢关键酶的活性具有一定影响。然而,对于浓香型白酒中的主要风味成分对ADH、ALDH活性的影响,目前仍然缺乏系统性的研究。

调香白酒,是通过添加食品添加剂调配而成的一类具有白酒风味的配制酒,在市场上广泛存在。目前,调香白酒普遍存在放香不足,浮香、味短、酒体欠协调以及容易引起“上头”等缺点[10]。因此,为满足消费者对酒类多样化的需求,提升调香白酒的品质成为当务之急。本文以浓香型白酒中主要风味成分为对象,研究不同风味成分单体在特定浓度下体外对乙醇代谢关键酶活性的影响。在此基础上,进一步通过重组和缺失,设计一款低醉酒度调香白酒,并进行志愿者测试评价,以期为调香白酒的品质提升提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氧化型辅酶I,酷尔化学科技有限公司;ALDH(25 U/mg)、ADH(100 U/mg),德国RUIBIO公司;巯基乙醇,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;吡唑,上海展云化工有限公司;甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、L-乳酸乙酯、D-乳酸乙酯、乙酸、丙酸、异戊酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、甲酸、L-乳酸、D-乳酸、正丙醇、仲丁醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、2-戊醇、活性戊醇、正己醇、正辛醇、丙三醇、糠醇、β-苯乙醇、1,2-丙二醇、3-甲硫基丙醇、2,3-丁二醇(R型)、2,3-丁二醇(S型)、2,3-丁二醇(内消旋)、乙醛、糠醛、乙缩醛、异戊醛、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、2-甲基-3-异丁基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪,均为色谱纯(纯度≥99.5%),上海麦克林生化科技股份有限公司;食用酒精(特级),安徽安特生物化学有限公司;SCM和AHG酒样,市售成品固液法白酒。

1.2 仪器与设备

GC 2010 pro气相色谱仪、紫外可见分光光度计,岛津公司;L600高速台式离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;超纯水机,合肥宏科仪器有限公司;Super Max 3100酶标仪,上海闪谱生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 浓香型白酒主要风味成分构成

选取浓香型白酒的关键风味成分,具体含量参考李正涛等[11],略作调整,以体积分数为50%的食用酒精配制单体风味成分,结果见表1。

1.3.2 ADH活性测定方法

参考SULTATOS等[12]的方法略作修改,在酶标仪96孔板中依次加入pH 8.8的Tris-HCl缓冲液70 μL,5 mmol/L的氧化型辅酶I 60 μL,3 mol/L的乙醇30 μL,待测样品20 μL,37 ℃孵育5 min后,加入5 U/mL的ADH溶液20 μL,混匀后立即测定其在340 nm处的吸光值,每隔1 min记录1次,连续记录5 min,取反应最初呈线性关系的吸光值作图,以缓冲液代替样品为空白组。ADH活性、激活率和抑制率的计算如公式(1)、公式(2)和公式(3)所示:

ADH活性

(1)

式中:ΔA,每分钟吸光度增加值;V,反应总体积;N,稀释倍数;0.1,酶溶液的体积;6.22,NADH在340 nm处的毫摩尔消光系数。

ADH激活率

(2)

ADH抑制率

(3)

式中:UP,样品组ADH活性;UC,空白组ADH活性。

1.3.3 ALDH活性测定方法

参考赵玉凤等[13]方法略作修改,在酶标仪96孔板中先加入pH值为8.8的Tris-HCl缓冲液60 μL,5 mmol/L的氧化型辅酶I 20 μL,100 mmol/L的乙醛溶液20 μL,1 mol/L的巯基乙醇溶液20 μL,1.5 mmol/L的吡唑溶液20 μL,3 mol/L的KCl溶液20 μL,待测样品20 μL,37 ℃孵育20 min后,加入5 U/mL 的ALDH溶液20 μL,混匀后立即测定其在340 nm处的吸光值,每隔1 min记录1次,连续记录5 min,取反应最初呈线性关系的吸光值作图,以缓冲液代替样品为空白组。ALDH活性、激活率和抑制率的计算如公式(4)、公式(5)和公式(6)所示:

ALDH活性

(4)

式中:ΔA,每分钟吸光度增加值;V,反应总体积;N,稀释倍数;0.1,酶溶液的体积;6.22,NADH在340 nm处的毫摩尔消光系数。

ALDH激活率

(5)

ALDH抑制率

(6)

式中:UP,样品组ALDH活性;UC,空白组ALDH活性。

1.3.4 低醉酒度调香白酒设计及风味成分测定

以表1浓香型白酒主要风味成分构成为参考,通过增加对乙醇代谢关键酶有激活作用以及减少或缺失具有抑制作用的风味成分,设计一款乙醇体积分数为42%的低醉酒度调香白酒。以市售固液法浓香型白酒SCM、AHG为对照样品。

采用气相色谱-氢火焰离子化检测器(gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID)对白酒主要风味成分进行分析。分析方法参照梁清文等[14]方法略加修改。色谱柱:DB-WAX UI 30 m×0.250 mm×0.25 μm,以叔戊醇、乙酸正戊酯和2-乙基丁酸为内标进行定量分析。

1.3.5 低醉酒度调香白酒质量评价

1.3.5.1 感官评价

感官评价参照GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》及文献[15]的方法。感官品评小组由10人组成,其中经专业培训的学生7人,一级品酒师1人,二级品酒师2人。采用9点标度描述感官特征程度,其中1～3分表示弱、短,4～6分表示中等,7～9表示强、长。香气特征描述:窖香、酯香、浮香;口感特征描述:刺激性、柔和度、丰满度、纯净度、持久度、醇甜度。

1.3.5.2 体外对乙醇代谢关键酶活性影响的测定

将设计的低醉酒度调香白酒、对照调香白酒以及成品固液法浓香型白酒调配到相同酒精度后,分别测定其对ADH和ALDH活性的影响,以相同酒精度的特级酒精为对照组。

1.3.5.3 饮后舒适度评价方法

饮后舒适度评价方法参考文献[16]并略作修改。志愿者共10名,男性、年龄18～25岁,前期通过意愿征集及问卷调查,醉酒量均为乙醇体积分数为50%的白酒200 mL以上。本试验饮酒量统一按乙醇体积分数为50%的白酒50 mL。试验前签署《知情同意书》,告知试验内容和可能存在的风险。

采用呼气式酒精含量检测仪测定饮酒后30、60、90、120 min后人体呼气中乙醇质量浓度,并转化为血液中乙醇含量(blood alcohol concentration, BAC)。以时间t为横坐标,BAC为纵坐标,绘制BAC-t图,并计算BAC曲线下面积(area under the curve, AUC)。其计算如公式(7)所示:

白酒饮后舒适度指数

(7)

式中:AUC特级酒精组,指饮用特级食用酒精后BAC-t图中乙醇曲线下面积;AUC待测样品组,指饮用待测样品后BAC-t图中乙醇曲线下面积。

1.4 数据统计与分析

数据以“平均值±标准差”表示,采用SPSS 26进行单因素方差和显著性分析,P<0.05为差异显著性水平,采用Origin 2021绘制BAC-t图,并计算乙醇AUC。

2 结果与分析

2.1 酯类风味成分体外对ADH、ALDH活性的影响

白酒中酯类风味成分能够为酒体赋予独特的香气和口感特征[17]。由图1可以看出,不同酯类成分对乙醇代谢关键酶活性的影响表现各不相同,其中己酸乙酯、乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、庚酸乙酯及甲酸乙酯对ADH具有抑制作用,而丙酸乙酯则对ADH具有激活作用,20 mg/L的丙酸乙酯对ADH的激活率达到17.3%。浓香型白酒中的主要酯类风味成分在体外对ALDH有激活作用。这一结果与曾礼兰等[6]认为酯类物质会不同程度地促进ALDH活性观点相吻合。在浓香型白酒四大酯中,己酸乙酯对ALDH的激活作用最为显著,其次是丁酸乙酯和乙酸乙酯。此外,棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯在浓香型白酒中的含量相对较低,但它们对ALDH的激活作用却十分明显,其作用机理可能与其可抑制细胞氧化应激反应有关[18]。

2.2 酸类风味成分体外对ADH、ALDH活性的影响

浓香型白酒中酸类风味成分较为丰富,是另一类重要的呈香呈味物质。由图2可以看出,浓香型白酒中酸类风味成分对ADH活性影响各异,其中大部分酸类对ADH活性影响不大,但乙酸表现出明显的抑制作用,500 mg/L的乙酸对ADH抑制率达到12.1%。

酸类成分中戊酸对ALDH有较大的抑制作用,20 mg/L的戊酸对ALDH的抑制率达到31.5%,其他酸类如丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、庚酸、辛酸、甲酸则对ALDH有激活作用,其中10 mg/L的丙酸对ALDH的激活率高达52.7%。这一结果在一定程度上解释了白酒中短链脂肪酸具有减轻酒精对肝脏损伤的潜能[19]。浓香型白酒中含有适量酸类成分有助于改善口感,但不同酸类成分对ADH和ALDH活性的影响却各不相同。因此,在低醉酒度调香白酒的酒体设计中,可以适当减少乙酸而增加丙酸含量。

2.3 醇类风味成分体外对ADH、ALDH活性的影响

醇类风味成分主要包括3个碳原子及以上的高级醇及多元醇,也是白酒中一类重要的呈香呈味物质。由图3可以看出,在醇类风味成分中,对ADH抑制作用明显的主要有糠醇、2-戊醇、异戊醇和正辛醇,其中10 mg/L的糠醇和250 mg/L的异戊醇对ADH的抑制率分别为67.9%、34.5%;大部分醇类风味成分对ALDH具有激活作用,其中20 mg/L的3-甲硫基丙醇和β-苯乙醇对ALDH激活率分别达到31.8%、37.6%。大量研究表明,高级醇含量过高是引起饮酒上头的主要原因之一[20-21]。因此,在调香白酒的酒体设计中,应减少异戊醇的含量,严格控制糠醇含量,适当增加3-甲硫基丙醇和β-苯乙醇含量,以达到降低醉酒度的效果。

2.4 手性风味成分体外对ADH、ALDH活性的影响

白酒中乳酸乙酯和乳酸均含有不对称碳原子,存在D型和L型2种构型。2,3-丁二醇存在R、S构型及2,3-丁二醇的内消旋体。研究表明,浓香型白酒中2,3-丁二醇R/S约为70[22],乳酸乙酯D/L约为2.5,不同香型白酒中乳酸的D/L比值为0.5～15[23]。由图4可以看出,D-乳酸乙酯和S-2,3-丁二醇对ADH和ALDH均有激活作用,而D-乳酸、L-乳酸及L-乳酸乙酯对ADH和ALDH均有抑制作用,L-乳酸的抑制作用弱于D-乳酸。在自然界中,天然的乳酸主要以L-乳酸的形式存在,人体血液中的乳酸也主要为L-乳酸[24]。由于人体缺乏D-乳酸脱氢酶,D-乳酸代谢较慢,容易在体内积累[25]。当体内D-乳酸过多时,可能引发嗜睡、记忆丧失、头痛等宿醉症状[26]。在白酒中,过高的D-乳酸和L-乳酸乙酯对白酒的饮后舒适度产生不利影响。因此,在低醉酒度调香白酒酒体设计中,乳酸应选用天然L-乳酸,而乳酸乙酯应选D-乳酸乙酯。

2.5 吡嗪及醛类风味成分体外对ADH、ALDH活性的影响

吡嗪及醛类风味成分在不同香型白酒中含量差异较大。其中,酱香型白酒中吡嗪类含量最高,浓香型白酒次之[27]。由图5可以看出,三甲基吡嗪和四甲基吡嗪体外对ADH和ALDH均有激活作用,尤其是四甲基吡嗪,在10 mg/L的质量浓度下,体外对ADH和ALDH的激活率分别为2.3%、17.8%;在醛类风味成分中,乙缩醛体外对ADH活性具有抑制作用,200 mg/L的乙缩醛对ADH的抑制率为16.8%,但对ALDH的激活率为19.1%。

四甲基吡嗪是一种具有生理活性的成分[28]。研究发现,四甲基吡嗪具有改善神经元损伤,可对偏头痛大鼠发挥镇痛作用[29];缩醛类风味成分除了能使酒体更加柔和协调外,还可以起到加快乙醛分解的作用,从而降低血液中乙醛的累积,达到降低醉酒度的效果。因此,在低醉酒度调香白酒酒体设计中,可适当增加乙缩醛和四甲基吡嗪的含量,以提高其饮后舒适度。

2.6 低醉酒度调香白酒主要风味成分测定结果

基于单一风味成分体外对ADH和ALDH活性影响的结果,结合浓香型白酒主体风味成分构成,设计一款低醉酒度调香白酒。酯类风味成分中,降低己酸乙酯含量,而增加丙酸乙酯含量,添加D-乳酸乙酯;酸类风味成分中,降低乙酸、己酸含量,提高丙酸含量,添加L-乳酸;醇类风味成分中,去除异戊醇、2-戊醇、活性戊醇,提高3-甲硫基丙醇含量;添加四甲基吡嗪并提高乙缩醛含量。具体风味成分见表2。

2.7 低醉酒度调香白酒质量评价

2.7.1 感官评价结果

采用感官评价方法,构建风味轮廓图。由图6可以看出,低醉酒度调香白酒与对照样品在香气和口感特征上,并无明显的差异,具备浓香型白酒典型风格。低醉酒度调香白酒在纯净度和醇甜度方面,相较于固液结合的对照酒样,具有明显的优势。

2.7.2 体外乙醇代谢关键酶活性测定及饮后舒适度测定结果

为研究设计的低醉酒度调香白酒对醉酒度的影响,通过体外酶活性及志愿者饮用评价,结果见表3。4个样品体外对ADH活性均具有一定的抑制作用,而对ALDH活性均有一定的激活作用。低醉酒度调香白酒对ADH抑制率显著低于SCM酒样(P<0.05),而对ALDH的激活率则显著高于对照调香白酒以及SCM和AHG酒样(P<0.05)。志愿者评价结果表明,低醉酒度调香白酒的饮后舒适度指数最高,和对照调香白酒以及SCM和AHG酒样相比,具有显著差异(P<0.05),饮用低醉酒度调香白酒后血液中乙醇分解更快。

3 结论

本文探究了浓香型白酒中的主要风味成分在体外对乙醇代谢关键酶活性的影响。结果表明:在浓香型白酒风味构成下,己酸乙酯、棕榈酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸乙酯及甲酸乙酯对ADH具有抑制作用,而丙酸乙酯则表现出激活作用;大多数酯类风味成分在体外对ALDH具有激活作用,浓香型白酒四大酯中激活作用由强至弱依次为:己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯;大部分酸类对ADH的活性影响不大;丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、庚酸、辛酸、甲酸则对ALDH有激活作用,其中10 mg/L的丙酸对ALDH的激活率高达52.7%,而戊酸对ALDH具有一定的抑制作用;糠醇、2-戊醇、异戊醇和正辛醇对ADH具有较高的抑制作用。大部分醇类对ALDH具有激活作用,其中20 mg/L 的3-甲硫基丙醇和β-苯乙醇对ALDH的激活率分别为31.8%、37.6%;手性风味成分中,D-乳酸乙酯对ADH和ALDH均具有激活作用,而L-乳酸乙酯则表现出抑制作用;S-2,3-丁二醇对ADH和ALDH有一定的激活作用;D-乳酸和L-乳酸对ADH和ALDH均有抑制作用,但L-乳酸抑制作用明显弱于D-乳酸;四甲基吡嗪对ADH和ALDH均有激活作用。乙缩醛对ADH具有抑制作用,但对ALDH具有激活作用。

通过风味成分的重组和缺失设计的低醉酒度调香白酒,对ALDH的激活率以及饮后舒适度指数均显著高于对照调香白酒以及SCM和AHG酒样(P<0.05)。白酒中风味成分对乙醇代谢的影响是一个复杂的过程,其具体的作用机制仍需要进一步深入研究探讨。

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Influence of major flavor components in Baijiu on activities of key enzymes of ethanol metabolism in vitro and its application

FANG Songping1,2,3, GAO Weiguang1, FENG Panpan1, ZHANG Hengfei1,3, HU Jinzhong1,3, WANG Xu1, LIU Lu1,2*

1(Department of Biology and Food Engineering, Bozhou College, Bozhou 236800, China)2(Bozhou Key Laboratory of Health-preserving Blended Alcoholic Beverage, Bozhou College, Bozhou 236800, China)3(Anhui Engineering Research Center for Development and Application of Functional Blended Liquor, Bozhou 236800, China)

ABSTRACT To further explore the effect of flavor components of Baijiu on the post-drinking comfort degree, this study detected the effect of each of the main flavor components in Nongxiangxing Baijiu at a specific concentration on the activity of key enzymes involved in ethanol metabolism through in vitro experiments.Furthermore, a flavored Nongxiangxing Baijiu with a low degree of drunkenness was designed by the recombination and removal of the flavor components.In addition, the post-drinking comfort degree was evaluated through a volunteer-based drinking experiment.According to the results, ethyl caproate and ethyl acetate could inhibit, while ethyl propionate could activate the activity of alcohol dehydrogenase (ADH), and most ester components could activate the activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH).Most acid components had no significant effect on the activity of ADH, while propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, isovaleric acid, heptanoic acid, octanoic acid and formic acid could activate the activity of ALDH. Among alcohol components, furfuryl alcohol, 2-amyl alcohol, isoamyl alcohol, and n-octyl alcohol exhibited inhibitory effects on the activity of ADH, while most alcohol components had activating effects on the activity of ALDH, especially 3-methylthiopropanol and phenylethyl alcohol.Besides, ethyl (2R)-2-hydroxypropanoate, S-2,3-butanediol, and tetramethylpyrazine had activating effects on both ADH and ALDH activities in vitro, while ethyl L(-)-lactate and D, L(+)-lactic acid could inhibit their activities.The designed flavored Nongxiangxing Baijiu with low degree of drunkenness was significantly superior to the flavored Baijiu control, SCM and AHG liquor samples in the activation rate and post-drinking comfort degree (P<0.05).The results have theoretical significance for the development of low degree of drunkenness Baijiu.

Key words Nongxiangxing Baijiu;flavor components;alcohol dehydrogenase(ADH);aldehyde dehydrogenase(ALDH);low degree of drunkenness

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.041048

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第一作者：学士,副教授(刘露讲师为通信作者,E-mail:2018110002@bzuu.edu.cn)

基金项目：安徽省高校科学研究项目(2022AH052419);安徽省大学生创新训练计划项目(S202412926020)

收稿日期：2024-09-13,改回日期:2025-01-28