红茶是世界上产量最高、消费区域最广、贸易量最大的茶类[1],以其独特丰富的风味占据了饮料届的重要地位,受到广大消费者的喜爱。我国红茶主要分工夫红茶、小种红茶和红碎茶三大类别,其中工夫红茶大多是以产地命名,主要涵盖了福建、安徽、贵州、云南等地,具有明显的地域特性和风格特点[2]。遵义红茶是贵州的名优功夫红茶,主要产于遵义市湄潭县、余庆县、凤冈县等地[3],由于其高海拔、低纬度的地理环境,造就了遵义红茶外形紧细乌润、金毫显露、汤色红亮、甜香持久、滋味甜醇等优良品质[4]。
香气是决定红茶品质的重要因子之一,对茶叶等级评定起到关键作用[5]。目前在红茶中已经鉴定出超过600种挥发性化合物,一般以酯类、醇类、酮类和醛类物质为主,其中芳樟醇、己醛、水杨酸甲酯等香气物质已被证实是红茶中的关键香气组分[6]。随着消费者对健康饮品的追求,茶饮料市场规模持续扩大[7],茶饮料新产品的开发,不仅注重口感与风味,还需追求天然、健康、绿色。然而目前市售茶饮料香气损失严重,开发高效的茶叶香气物质回收、保留技术,提升茶饮料香气品质,是茶饮料行业待解决的科学问题。茶叶香气成分的提取方法主要有同时蒸馏萃取法、溶剂辅助风味蒸发法、搅拌棒吸附萃取法、超临界萃取法和亚临界萃取法[8],基于不同的萃取原理,萃取方法的优缺点也各有不同。与其他提取方法相比,超临界CO2萃取技术具备安全性高、萃取效果好、选择性高、绿色节能等优点,能有效萃取得到高品质产品,且能较好地保持原料的香气特征[9]。
随着香气提取手段和检测分析技术的快速发展,近年来关于红茶香气成分的研究也日益增多。曹雪颖等[10]采用溶剂辅助蒸发法结合GC-MS和全二维气相色谱联合质谱(two dimensional gas chromatography mass spectrometry,GC×GC-MS)仪对祁红、金骏眉和滇红的香气物质进行了表征。彭云等[11]通过顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)结合GC-MS比较分析了云南、福建、宜昌3地的红茶挥发性香气成分。郑芳玲等[12]采用GC-MS和GC-O技术对不同地区红茶特征香气物质进行了鉴定。GC×GC-TOF-MS是新型的分离系统,相较于一维的GC-MS具有灵敏度高、分辨率强、峰容量大等优势,可实现复杂挥发物组分的分离鉴定[10],目前该技术已被用于多种食物的香气分析,但采用GC×GC-TOF-MS对茶叶超临界萃取物挥发性成分的研究却未见报道。
因此,本研究以遵义红茶为实验材料,结合单因素和响应面试验,探究萃取温度、时间、压力、夹带剂添加量和CO2流量等因素对萃取得率的影响,进一步优化超临界CO2萃取工艺,并结合SPME-GC×GC-TOF-MS、GC-O和相对气味活度值(relative odor activity value, ROAV)对红茶超临界萃取物的挥发性成分进行鉴定分析,明确红茶超临界萃取物的挥发性成分组成,以期为红茶的综合开发利用、红茶饮料风味品质的提升提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
贵州遵义红茶,贵州顺红源茶业有限公司;CO2气体(纯度≥99.9%),长沙鑫湘贸易有限公司;无水乙醇(分析纯AR),国药集团化学试剂有限公司;正构烷烃(C7～C25),上海麦克林生化科技股份有限公司;正己烷(GC,≥99%),西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
1.2 仪器与设备
HA220-50-6型超临界CO2萃取装置,南通华安超临界萃取有限公司;AF-20S型1 kg粉碎机,温岭市奥力中药机械有限公司;B-100HB型旋转蒸发仪,瑞士BUCHI公司;ME204E/02型电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;8890-7250型全二维气相色谱飞行时间质谱仪,美国Agilent公司。
1.3 实验方法
1.3.1 红茶超临界萃取物制备方法
以贵州遵义红茶作为实验材料,将其粉碎后过20目网筛,称取干燥的茶粉300 g装入1 L萃取釜中,打开CO2气瓶,依次打开阀门,同时调节设备参数至指定值,固定分离釜参数:分离釜Ⅰ分离温度38 ℃、压力7 MPa;分离釜Ⅱ分离温度36 ℃,压力6 MPa。待CO2流量稳定后,加入无水乙醇作为夹带剂。萃取结束后从分离釜b1和b2收集红茶萃取物,旋转蒸发后进行称量,并按公式(1)计算得率。
(1)
式中:y,得率,%;m1,红茶超临界萃取物的质量,g;m2,红茶样品的质量,g。
1.3.2 单因素试验
以红茶萃取物得率为考察指标,固定条件为萃取压力20 MPa、萃取温度50 ℃、动态萃取时间1.5 h、静态萃取时间20 min、夹带剂体积100 mL、CO2流量20 L/h,研究不同参数:萃取压力、萃取温度、动态萃取时间、静态萃取时间、CO2流量、夹带剂添加量对红茶超临界萃取得率的影响,试验设计见表1。
表1 单因素试验设计
Table 1 Single factor experimental design
水平萃取温度/℃萃取压力/MPa动态萃取时间/h静态萃取时间/min夹带剂添加量/mLCO2流量/(L/ h)140100.50010245151.0105015350201.52010020455252.03015025560302.54020030
1.3.3 响应面试验设计
在单因素试验结果的基础上,根据各因素对红茶萃取率的影响规律,选取萃取压力、动态萃取时间和夹带剂添加量为3个主要影响因素,以红茶萃取率为响应值,采用Design-Expert 13中的Box-Behnken方法设计响应面试验对超临界CO2萃取工艺条件进行优化。
1.3.4 SPME条件
准确称取0.5 g红茶超临界萃取物于20 mL磁性顶空瓶中,加入10 μL癸酸乙酯内标溶液(8.63 mg/L)。将顶空瓶放置于80 ℃平衡20 min,插入萃取头(50/30 μm SFIB-DVB/C-WR-80/10-P1)吸附20 min,在250 ℃下解析3 min,随后进行数据采集分析。
1.3.5 GC×GC-TOF-MS检测条件
GC×GC条件:调制柱类型:SV(C6～C40);一维色谱柱HP-5 ms Ultra Inert(30 m×250 μm×0.25 μm);二维色谱柱D8-17MS(2.32 m×180 μm×180 μm);升温程序:初始温度40 ℃,保持1 min;以2 ℃/min上升至180 ℃,保持0 min;以5 ℃/min升至250 ℃,保持5 min;载气为He(99.999%),流速0.9 mL/min;分流比为50∶1;进样口温度250 ℃,MSD传输线温度250 ℃。
MS条件:电离方式EI;灯丝电流5 μA;电子轰击源70 eV;离子源温度200 ℃;四极杆温度150 ℃。
1.3.6 GC-O方法
GC-MS系统连接到嗅觉评估端口(ODP-4)进行香气分析,检测成分按照1∶1的分流模式进入检测器和嗅闻仪;传输线温度250 ℃,嗅闻口温度150 ℃;柱温箱的升温程序参数与上述GC×GC条件相同。
嗅闻分析小组由3位经过专业训练的成员组成,使用“1～4”分级体系对气味特征及强度进行评估。使用可移动电阻器记录香气强度(aroma intensity,AI),其中“1”表示气味微弱,“2”表示气味适中,“3”表示气味较强,“4”表示气味强,最终的评估结果将由至少2位小组成员在同一时间阶段嗅闻到相似的气味描述及强度来确定[13],3次嗅闻结果取平均值。
1.3.7 挥发性成分定性定量方法
定性:采用全二维色谱数据处理软件 Canvas Panel 分析挥发性成分数据,设置最小峰检测信噪比为10,筛选化合物进行检测。通过NIST 20标准谱库和保留指数RI进行定性分析,将样品与正构烷烃(C7～C25)在相同色谱条件下分别前后进样进行分析,计算样品各化合物的RI值,保留正向、反向匹配度大于700,RI值偏差小于15的化合物。
定量:采用内标法对红茶中的香气化合物进行定量,通过计算挥发性成分的峰面积与内标物(癸酸乙酯)的峰面积之比计算其相对含量,每个样品进行3次重复检测,结果取平均值,计算如公式(2)所示:
(2)
式中:M,化合物相对含量,μg/g;A1,化合物峰面积;A2,内标物峰面积;m,茶样的添加量,g。
1.3.8 ROAV方法
ROAV为挥发性物质的相对含量与挥发性物质在水中的阈值之比,阈值参考文献和网站VCF(https://www.vcf-online.nl/Vcf-Home.cfm)。
1.3.9 数据处理
采用 Design-Expert 13 进行响应面试验分析和作图,使用全二维色谱数据处理软件 Canvas Panel 和NIST 20 标准谱库对挥发性成分进行定性,采用Excel 2021对数据进行统计整理作图,使用Graphpad Prism 8.0 软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 萃取温度对红茶萃取物得率的影响
由图1-a可知,萃取温度从40 ℃增加到50 ℃时,得率升高,当超过50 ℃后,得率呈下降趋势。温度是影响红茶萃取物得率的重要因素之一,萃取温度升高,分子热运动速度加快,溶剂与溶质分子相互碰撞的几率和缔合机会增加,同时,CO2流体蒸气压增大,进一步增大了茶叶萃取物的溶解度[14]。但随着萃取温度的升高,CO2的分子间距增加,密度减小,挥发性成分的溶解度也相应减小,导致提取率降低[15],而且温度过高可能会造成热敏性成分变质[16],影响萃取物品质,所以综合考虑选择50 ℃为较佳萃取温度。
2.1.2 萃取压力对红茶萃取物得率的影响
由图1-b可知,在萃取压力10～20 MPa时,得率随着压力的升高呈急剧上升趋势;在萃取压力20～30 MPa时,得率随压力的上升呈下降趋势。萃取压力是超临界流体萃取的一个重要参数,压力增大时,CO2流体密度增加,萃取物在超临界CO2中的溶解度增大,萃取物得率也随之显著上升[15]。但压力超过20 MPa时,萃取物得率逐渐下降,这可能是因为CO2流体密度过大,传质效率和扩散速率受到限制,萃取能力降低[17]。此外,过高的压力对于萃取设备的耐压等级要求更高,在一定程度上增加了设备成本和操作难度[18],故选择20 MPa为较佳萃取压力。
2.1.3 动态萃取时间对红茶萃取物得率的影响
由图1-c可知,当动态萃取时间为1 h时,红茶萃取物得率最高,1 h后,得率随着时间的延长逐渐降低。超临界萃取是一个动态传质过程,在萃取初阶段,红茶与超临界CO2流体还未充分接触,得率较低,随着接触时间延长,萃取体系逐渐达到平衡,得率增大[19];但后期,大部分有效物质被萃取出来,随着时间延长,可能蜡质、色素等大分子杂质成分被萃取出来[15],导致得率降低,而且萃取时间与萃取效率和萃取成本呈正相关[20],增加萃取时间会导致生产成本和能耗提高,故得到较佳的动态萃取时间为1 h。
2.1.4 静态萃取时间对红茶萃取物得率的影响
由图1-d可知,在静态萃取时间<20 min时,得率随着时间的上升而逐渐增加,20 min后,得率开始下降。静态萃取是指在动态萃取开始前,调节萃取釜压力、温度至设定值,关闭萃取釜两端阀门,使茶叶浸泡在CO2流体中的萃取过程。在萃取初期,CO2流体和茶叶未充分接触,得率较低,当一定时间后二者充分接触,达到最高萃取率,但浸泡时间过长,得率反而呈现下降趋势[19]。静态萃取可使CO2流体充分浸润茶叶,配合动态萃取持续补充CO2流体不断萃出挥发性物质[20],可以提高茶叶萃取物得率,也减少了CO2的浪费,综合考虑以20 min静态萃取时间作为较佳参数。
2.1.5 夹带剂添加量对红茶萃取物得率的影响
由图1-e可知,红茶萃取物得率随着夹带剂添加量的增加而急剧上升,但当夹带剂添加量>150 mL时,得率开始下降。夹带剂又称携带剂,在动态萃取时从携带剂罐通过泵压进入萃取釜,常见的夹带剂有甲醇、乙醇、水、丙酮等,本实验参考前人的研究[21]选用无水乙醇作为夹带剂,少量夹带剂的添加对CO2的密度影响不大,甚至会使CO2流体密度降低,导致得率不高,这与本实验结果相符。当适量夹带剂加入,被分离组分在气相中的溶解度增加,溶质的选择性提高,得率上升[22],但过多夹带剂加入会使得率降低,故综合考虑选用150 mL作为夹带剂添加量。
2.1.6 CO2流量对红茶得率的影响
由图1-f可知,CO2流量在10～20 L/h时,萃取物得率上升;在20～30 L/h时,得率逐渐降低。CO2流量一般从2个方面影响得率,即流量对传质速率的影响和流量对萃取时间的影响。CO2流量增加时,溶剂与茶叶之间的接触面积增大,传质速率增大,利于萃取[23];但过大的CO2流量导致萃取釜内流速增加,萃取时间减少,茶叶与CO2接触不充分,降低萃取效率[24],故综合考虑选择CO2流量20 L/h为较佳参数。
a-萃取温度;b-萃取压力;c-动态萃取时间;d-静态萃取时间;e-夹带剂添加量;f-CO2流量
图1 不同参数对红茶萃取物得率的影响
Fig.1 Effect of different parameters on the extraction rate of black tea
2.2 响应面优化试验
2.2.1 响应面试验设计
根据单因素试验结果,以萃取压力、动态萃取时间和夹带剂添加量为响应变量进行响应面试验,优化红茶超临界萃取工艺参数,Box-Behnken试验设计及结果见表2。
表2 红茶超临界萃取响应面试验结果
Table 2 Experimental results of response surface of black tea supercritical extraction
序号A-萃取压力/MPaB-动态萃取时间/hC-夹带剂添加量/mL得率/%1150.51500.497 5 2250.51500.602 03151.51500.626 44251.51500.555 65151.01000.527 86251.01000.573 57151.02000.524 5
续表2
序号A-萃取压力/MPaB-动态萃取时间/hC-夹带剂添加量/mL得率/%8251.02000.559 69200.51000.497 410201.51000.572 411200.52000.556 712201.52000.542 113201.01500.690 414201.01500.689 315201.01500.684 816201.01500.660 717201.01500.668 5
2.2.2 方差分析及显著性检验
采用Design-Expert 13软件对试验结果(表2)进行多元回归分析,得到回归方程为:Y=0.678 7+0.014 3A+0.017 9B+0.001 5C-0.043 8AB-0.002 7AC-0.022 4BC-0.052 1A2-0.056 3B2-0.080 3C2,其中Y为红茶超临界萃取物得率,A为萃取压力,B为动态萃取时间,C为夹带剂添加量。模型方差分析结果见表3。
表3 响应面回归模型方差分析
Table 3 Response surface regression model analysis of variance
项目平方和 自由度均方F值P值显著性模型0.071 690.008 042.21<0.000 1***A-萃取压力0.001 610.001 68.690.021 5*B-动态萃取时间0.002 610.002 613.540.007 9**C-夹带剂添加量0.000 010.000 00.092 30.770 1AB0.007 710.007 740.750.000 4***AC0.000 010.000 00.149 00.711 0BC0.002 010.002 010.650.013 8*A20.011 410.011 460.580.000 1***B20.013 310.013 370.75<0.000 1***C20.027 210.027 2144.04<0.000 1***残差0.001 370.000 2失拟项0.000 630.000 21.130.437 3净误差0.000 740.000 2总误差0.072 916R20.981 9R2adj0.958 6变异系数/%2.33
注:*表示影响显著(P<0.05),**表示影响中度显著(P<0.01),***表示影响高度显著(P<0.001)。
由表3可知,回归模型的F值为42.21,P值<0.000 1,模型的决定系数
结果表明所建立的二次方程具有较高的显著性,该模型能较好地反映各因素与得率之间的关系。变异系数为2.33%<5%,说明试验模型重复性良好。失拟项值为0.437 3(P>0.05),影响不显著,表明该方程具有良好的精确性和可靠性,能够用于红茶超临界萃取试验的理论预测。比较回归方程中各因素的F值可知,各因素对红茶超临界萃取物得率影响的顺序依次为动态萃取时间(B)>萃取压力(A)>夹带剂添加量(C)。
2.2.3 响应面分析
3个因素之间交互作用的三维空间响应面图和等高线图如图2所示。通过三维响应面图中的坡度可以判断显著性,坡面越陡表示显著性越强[25]。等高线的形状反映各因素交互作用是否显著,当等高线呈椭圆形时,表明2个因素之间的交互作用显著;当等高线呈圆形时,表明2个因素之间的交互作用不显著[26]。如图2-a和图2-b所示,响应面曲线坡度最陡,等高线形状呈椭圆形,表明萃取压力和动态萃取时间的交互影响极显著。从图2-c和图2-d可以看出,响应面曲线坡度略陡,等高线形状近似圆形,表明萃取压力和夹带剂添加量的交互作用不显著。而据图2-e和图2-f显示,响应面曲线坡度较陡,等高线形状近似椭圆形,表明动态萃取时间和夹带剂添加量的交互影响较显著。响应面曲线图和等高线图结果与表3 中F值结果一致。
a-萃取压力与动态萃取时间响应面;b-萃取压力与动态萃取时间等高线图;c-萃取压力与夹带剂添加量响应面;d-萃取压力与夹带剂添加量等高线图;e-动态萃取时间与夹带剂添加量响应面;f-动态萃取时间与夹带剂添加量等高线图
图2 各因素交互作用对红茶超临界萃取物得率影响的响应面和等高线图
Fig.2 Response surface diagrams and contour lines of effects of the interaction of various factors on the black tea supercritical extract
2.2.4 验证试验
运用 Design-Expert13 软件优化工艺条件,得到红茶超临界萃取物最佳工艺参数为萃取压力20.42 MPa、动态萃取时间1.064 h、夹带剂添加量149.508 mL,提取率达到最高0.68%。综合考虑实际操作时的局限性,调整工艺条件为萃取压力20.5 MPa,动态萃取时间1 h,夹带剂添加量150 mL。在此参数下进行3次重复验证试验,所测红茶超临界萃取物的平均得率为(0.671 9±0.018 6)%,与软件模型预测的最佳值十分接近,说明该模型的预测性良好,能够用于实际操作。
2.3 红茶超临界萃取物的挥发性成分分析
2.3.1 红茶超临界萃取物GC×GC-TOF-MS结果与分析
利用GC×GC-TOF-MS技术检测红茶超临界萃取物中香气物质,根据质谱库检索定性了122种香气物质,如电子版增强出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.042099),物质总含量为487.78 μg/g。这122种香气物质根据其化学结构可分为醇、醛、酯、酮、酸、酚、烷烃、烯烃、芳香烃、杂环类化合物以及其他11类,其中醇类占比42.01%(21种)、醛类占比3.23%(10种)、酯类占比16.4%(25种)、酮类占比7.63%(12种)、酸类占比6.16%(6种)、酚类占比0.86%(4种)、烷烃类占比1.9%(9种)、烯烃类占比2.06%(15种)、芳香烃类占比1.61%(10种)、杂环类占比0.51%(4种)、其他类占比17.63%(6种)。
由图3-a可知,从挥发性物质种类来看,酯类、醇类、烯烃类是红茶超临界萃取物中主要的挥发性物质;如图3-b所示,从挥发性物质的相对含量上看,醇类占比较高,是构成红茶超临界萃取物挥发性物质的主要部分,与前人研究一致[3]。各类挥发性物质中,醇类化合物有21种,其中香叶醇、苯甲醇、(E)-芳樟醇氧化物、苯乙醇的相对含量较高;酯类化合物有25种,其中水杨酸甲酯、二氢猕猴桃内酯的相对含量较高,这些物质可能是红茶萃取物的主要特征香气物质,与以往的研究结果类似[27]。
a-挥发性成分种类数量;b-挥发性成分相对含量占比
图3 红茶超临界萃取物中挥发性成分种类数量及相对含量占比
Fig.3 Types of volatile components in supercritical extracts of black tea and their relative content proportions
2.3.2 红茶超临界萃取物GC-O结果与分析
GC-O是一种结合仪器与人类嗅觉的方法,目前在食品风味分析领域已广泛应用,GC-O嗅闻到的香气物质被称为香气活性成分[13]。通过GC-O从红茶超临界萃取物中嗅闻到28种香气活性成分(表4),香气强度在0.33～4,主要包括6种醇类、6种酮类、5种酯类、3种烯烃类、2种醛类、2种酸类、2种其他类、1种芳香烃类和1种酚类化合物。其中,香气强度中等以上(≥2)的化合物有17种,大多为酮类和醇类化合物。
表4 红茶超临界萃取物GC-O结果
Table 4 GC-O results of the black tea supercritical extract
序号物质名称一维保留时间/min二维保留时间/s香气描述香气强度1二甲基砜15.22 0.13 淡淡臭味0.33 2正己酸19.22 2.90 脂肪香0.33 3苯甲醇22.22 6.54 花香0.67 4γ-己内酯23.72 6.97 椰子香、甜香2.33 52-乙酰基吡咯24.05 6.54 坚果香3.00 6苏合香醇24.22 5.03 甜香、花香3.00 73,5-辛二烯-2-酮24.89 4.23 果香0.67 8芳樟醇26.89 2.96 花香3.33 96-甲基-3,5-庚二烯-2-酮27.22 4.72 果香、药草香3.33 10苯乙醇27.72 5.46 玫瑰花香4.00 11辛酸31.89 3.19 脂肪酸香0.33 12水杨酸甲酯33.394.98薄荷香2.00 13桃金娘烯醇33.55 4.07 木本松香1.67 14辛酸乙酯33.722.99果香1.33 15异戊酸己酯36.39 2.84 果香2.33 16香叶醇37.39 3.75 花香、果香3.67 172-甲基萘39.72 5.54 花香、木香1.67 182-丁基-2-辛烯醛45.22 3.20 果香2.00 19香兰素46.558.11奶香、甜香3.00 20茉莉酮46.72 5.55 花香0.67 21甲基丁香酚47.05 5.82 甜香、丁香2.67 22雪松烯47.563.21木香、甜香3.00 23β-石竹烯47.89 3.27 甜香、木质香2.67 24α-紫罗酮48.55 4.16 甜香、花香2.33 25香叶基丙酮50.05 3.92 清甜香、花香2.00 26β-紫罗酮52.05 4.45 花香3.67 27去氢白菖烯54.224.05香草香1.00 28棕榈酸乙酯76.89 1.91 果香0.67
苯乙醇(AI=4)香气强度最高,其次为β-紫罗酮(AI=3.67)、香叶醇(AI=3.67)、芳樟醇(AI=3.33)和6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮(AI=3.33)。苯乙醇呈现为玫瑰花香、β-紫罗酮、芳樟醇呈现为花香,香叶醇呈现为花香、果香,6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮呈现为果香、药草香,对红茶超临界萃取物花香、果香的品质特征形成具有重要的贡献作用。有研究表明苯乙醇呈现令人愉悦的花香气味,对红茶特征香气的形成起关键作用[28];β-紫罗酮、芳樟醇和香叶醇等物质曾被鉴定对红茶整体香气贡献较大,是红茶中的关键呈香成分[29];6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮被鉴定为茯砖茶的主要香气成分[30]。此外,2-乙酰基吡咯、苏合香醇、香兰素、雪松烯等化合物的香气强度≥3,多具有甜香、花香等香气属性,是红茶超临界萃取物的重要呈香成分。水杨酸甲酯、2-丁基-2-辛烯醛、香叶基丙酮、γ-己内酯、异戊酸己酯、α-紫罗酮、甲基丁香酚、β-石竹烯香气强度≥2,大多呈现甜香、果香、花香等香气属性,和上述高强度香气活性物质共同构成了红茶超临界萃取物的花香、果香的香型。
虽然GC-O在食品中已得到了广泛的应用,但其检测方法主要依靠嗅觉识别,且受操作者自身条件及试验条件影响,存在一定的主观误差[29]。因此,为确保实验结果的准确性,需要结合其他方法来进一步确定红茶超临界萃取物的关键香气物质。
2.3.3 红茶超临界萃取物ROAV结果与分析
目前食品领域已经发现万余种气味成分,而其中仅有小部分成分对食品整体香气的塑造起着至关重要的作用,这一部分气味成分被称为关键呈香成分[31]。茶叶中香气化合物含量的高低并不能完全反映其对样品香气贡献度的大小,还受其阈值的影响。研究表明,ROAV≥1的香气化合物对样品整体香气的贡献度较大而ROAV<1的香气化合物对样品整体香气的贡献度较小[32]。
为了更精确地评估遵义红茶超临界萃取物中的香气化合物的影响,筛选关键呈香物质,在香气化合物定量的基础上,根据相关文献中香气化合物在水溶液中的阈值计算ROAV,结果如表5所示。以ROAV≥1为标准共筛选出51种关键香气化合物。其中,ROAV值>100的化合物有19种,包括β-紫罗酮、茉莉酮、苯乙醇、2-甲基萘、(Z)-芳樟醇氧化物、芳樟醇、叶醇、乙酸香叶酯、香叶醇、α-紫罗酮、柏木脑、桃金娘烯醇、香兰素、2-乙基呋喃、β-环柠檬醛、正己醛、1,1,6三甲基-1,2二氢萘、月桂烯和水杨酸甲酯。ROAV值在10～100的化合物有19种,包括(E)-芳樟醇氧化物、丙位壬内酯、2-戊基呋喃、3,5-辛二烯-2-酮、辛酸乙酯、对薄荷-1,3,8-三烯、萘、苯甲醇、二氢猕猴桃内酯、4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮、香芹酚、苯并噻唑、α-松油醇、香叶基丙酮、γ-己内酯、甲基丁香酚、正己酸、癸醛和橙花叔醇。ROAV在1～10的化合物有13种,分别是β-石竹烯、甲酸香叶酯、麝香草酚、异戊酸己酯、石竹素、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯、橙花醇、十四烷、苯甲醛、二苯并呋喃、苏合香醇、辛酸和棕榈酸甲酯。
表5 红茶超临界萃取物中ROAV>1的香气化合物
Table 5 Aroma compounds with ROAV more than 1 in the black tea supercritical extract
序号物质名称相对含量/(μg/g)阈值/(μg/g)ROAV12-乙基呋喃0.240.002 3a106.212正己醛0.470.004 5[34]103.423叶醇0.540.003 9[34]138.224苯甲醛0.720.35[34]2.055正己酸11.800.89[34]13.2662-戊基呋喃0.960.014 5[34]66.177月桂烯0.200.001 2[34]169.488苯甲醇26.470.62[34]42.699(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯0.170.034[34]5.0810γ-己内酯0.850.05[34]16.9911苏合香醇0.560.479[34]1.17123,5-辛二烯-2-酮6.240.1[34]62.4013芳樟醇2.370.001 5[34]1 577.4814对薄荷-1,3,8-三烯0.840.015[34]55.8515苯乙醇67.170.14[34]479.7816辛酸1.050.91[34]1.1517(E)-芳樟醇氧化物19.180.25[35]76.7318萘0.350.006 8[34]51.6819α-松油醇7.080.33[34]21.4520水杨酸甲酯32.260.034 9[34]924.2521桃金娘烯醇1.240.007[34]177.1922辛酸乙酯0.280.005[34]56.6823癸醛0.310.03[34]10.4224β-环柠檬醛1.250.003[34]415.7525苯并噻唑1.790.08[34]22.3626橙花醇1.210.29[34]4.1727异戊酸己酯0.120.022[34]5.2628香叶醇52.180.000 71[34]73 494.9229麝香草酚0.470.086[34]5.52302-甲基萘1.150.01[34]115.0231甲酸香叶酯1.310.2[34]6.5332香芹酚1.610.07[34]23.06331,1,6三甲基-1,2二氢萘1.140.002 5[34]456.0534丙位壬内酯0.660.009 7[34]68.3435乙酸香叶酯1.030.009[34]114.7436香兰素7.610.025[34]304.4237十四烷2.151a2.1538茉莉酮4.190.001 9a2 205.6839甲基丁香酚1.020.068[34]14.9440β-石竹烯1.250.15[34]8.3441α-紫罗酮0.980.000 4[34]2 451.5442香叶基丙酮1.170.06[34]19.50434-[2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮3.590.1a35.8544β-紫罗酮14.900.000 007[34]2 128 569.0845二苯并呋喃0.240.12[34]2.0146二氢猕猴桃内酯20.060.5[29]40.1147橙花叔醇2.520.25[34]10.0948石竹素1.040.2[34]5.1849柏木脑5.720.000 5[36]11 447.3050棕榈酸甲酯3.152[34]1.5851(Z)-芳樟醇氧化物11.680.1[34]116.83
注:小写字母“a”表示阈值通过网站VCF(https://www.vcf-online.nl/Vcf-Home.cfm)查询得到。
其中,β-紫罗酮的ROAV最高为2 128 569,其次是香叶醇(ROAV=73 494.92)、柏木脑(ROAV=11 447.3)、α-紫罗酮(ROAV=2 451.54)、茉莉酮(ROAV=2 205.68)、芳樟醇(ROAV=1 074.31)和水杨酸甲酯(ROAV=924.25)。β-紫罗酮呈现最高的ROAV,可能是因为其在水中极低的阈值(0.000 007 μg/g)和较高的相对含量(14.90 μg/g)。王金源等[33]研究发现,芳樟醇和水杨酸甲酯在花果香红茶中表现出较高的ROAV,是永泰菜茶加工花果香红茶的特征香气物质,与本实验结果基本相符。
2.3.4 红茶超临界萃取物关键香气成分分析
结合红茶超临界萃取物的GC-O与ROAV结果分析得到,一共有21种气味化合物同时满足ROAV≥1和被嗅闻到的条件。其中,有13种香气活性化合物AI≥2,包括具有花香属性的β-紫罗酮、苯乙醇、芳樟醇、苏合香醇,花果香属性的香叶醇、α-紫罗酮,木香属性的β-石竹烯,甜香和奶香属性的香兰素,甜香属性的甲基丁香酚、γ-己内酯,果香属性的异戊酸己酯、香叶基丙酮,和薄荷香属性的水杨酸甲酯,这些化合物可能对构成红茶超临界萃取物的特征香气起着关键作用。
然而,在GC-O分析中,某些ROAV<1的化合物也被嗅闻到,包括二甲基砜、棕榈酸乙酯、去氢白菖烯、2-丁基-2-辛烯醛、2-乙酰基吡咯、雪松烯和6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮,其中6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮、雪松烯、2-乙酰基吡咯呈现较高的香气强度(AI≥3)。同样,柏木脑、1,1,6三甲基-1,2二氢萘、β-环柠檬醛、月桂烯、叶醇、乙酸香叶酯、2-乙基呋喃、正己醛等高ROAV化合物(ROAV≥100)并没有被嗅闻到。存在这种差异的原因可能是在嗅闻过程中,多种挥发性物质在较短的时间同时释放并进行复杂地相互作用,而人类嗅觉很难快速准确识别出单个化合物的香气特征[37];其次,以ROAV为指标仅考虑到单个化合物在水中的阈值,无法对不同香气化合物间的互作关系进行探究,存在一定的局限性[36]。因此,采用GC-O结合ROAV法能够减小单独使用ROAV法的误差,后续本研究将进一步结合香气重组及遗漏缺失实验探究关键呈香化合物间的互作关系,明确超临界萃取物香气品质形成机制。
3 结论
本研究采用单因素和响应面法优化了超临界CO2萃取遵义红茶的工艺参数,得到最佳工艺条件为萃取温度50 ℃、萃取压力20.5 MPa、动态萃取时间1 h、静态萃取时间20 min、夹带剂添加量150 mL、CO2流量20 L/h,在此条件下红茶萃取物得率为(0.671 9±0.018 6)%。采用SPME-GC×GC-TOF-MS对红茶超临界萃取物的挥发性成分进行鉴定分析,共检测出122种香气物质,以醇类(占比42.01%)为主。通过GC-O分析,在红茶超临界萃取物中嗅闻到28种香气活性成分,AI≥2的化合物有17种,大多为酮类和醇类化合物。ROAV≥1法筛选出51种香气化合物,与嗅闻结果联合分析筛选出21种主要呈花果香和甜香的关键香气化合物,包括β-紫罗酮、香叶醇、芳樟醇、苯乙醇、香兰素等,这些关键物质对形成红茶超临界萃取物的香气品质具有重要贡献。
本研究为红茶产品的深加工开发利用提供了参考,后续将通过香气重组及遗漏缺失实验对关键呈香成分进行验证,进一步探究超临界萃取物关键香气成分间的互作关系。
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