乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是革兰氏阳性杆菌或球菌,不形成芽孢,其特点是能发酵糖生成乳酸,具有丰富的多样性。发酵食品是一些地区的传统饮食,近年来在食品工业中占有越来越重要的地位。LAB是世界上公认的适用于食品发酵的安全菌株,在发酵食品中起着重要作用。经过LAB发酵的食物,不但在风味品质上有大幅度的提升,而且在不添加防腐剂的前提下保质期也明显延长[1]。
酵母菌一般指能够利用糖类物质发酵的真菌类微生物,属于兼性厌氧菌,利用糖类物质生长繁殖,分别将糖分解为水和CO2或酒精和CO2,通过代谢产生醇类物质和羧基化合物。酵母菌发酵食品能够提高食品的风味物质种类和含量,赋予食品独特的发酵风味[2]。此外,一些从发酵乳制品中分离出来的酵母,具有降低胆固醇水平的作用[3],是发酵饮料的优良菌株。
蔬菜水果富含多种维生素、矿物质、抗氧化剂以及膳食纤维,除了为人体提供能量和营养,还可以预防疾病和改善肠道健康。果蔬汁保留了新鲜蔬菜水果中的主要营养成分,但是部分果蔬汁原液的口感较酸涩,通过微生物发酵可以改善原液中的涩味,且获得更丰富的风味和更醇厚的口感。目前人们已熟练掌握单一菌种的发酵技术,但为提高营养物质含量以及口味多元化开发,存在显著优势的多菌种混合发酵逐渐进入人们视野。目前,酵母菌乳酸菌混合菌种发酵果蔬基底的饮料已经得到广泛研究,混菌发酵使得果蔬汁发酵产物中有机酸、醇类物质、酚类物质等风味物质的含量提高,同时增加抗氧化活性,延长保质期,与人们的日常需求高度贴合。
1 乳酸菌与酵母菌联合发酵果蔬汁对风味物质的影响
风味是构成食品质量的重要因素之一,食品风味是由挥发性物质和非挥发性物质两类化合物共同表现出来。挥发性风味物质是发酵果蔬汁具有独特香气的物质基础,主要有醇类、酯类、酮类、醛类等物质。非挥发性风味物质包括有机酸、酚类、游离氨基酸、可溶性糖等,主要影响发酵果蔬汁的酸甜等滋味和口感,同时,通过与挥发性化合物相互作用影响挥发性化合物的释放对食品整体香气特征也有重要影响[4]。
1.1 挥发性风味物质
果蔬汁在发酵过程中产生的各种香气物质,对发酵产品的感官质量有着极其重要的影响[5]。发酵后产生的挥发性风味物质是赋予果蔬饮料香气和风味的关键成分,主要包括醇类、酯类、酮类以及醛类等物质。在发酵果蔬汁中检测到的主要风味物质及其香气特点如表1所示。
表1 果蔬汁发酵产生的主要挥发性风味物质
Table 1 Main volatile flavor compounds in fermented fruit-vegetable juices
发酵基底发酵菌种产生的主要风味物质风味参考文献猕猴桃植物乳植杆菌、副干酪乳酪杆菌正庚醛、癸醛、壬醛、正己醇、正丁醇、4-萜烯醇、壬酸等水果香、玫瑰香、甜橙香、香蕉、奶油香、迷迭香等[6]甜瓜植物乳植杆菌C17、戊糖乳杆菌Lp-b、毕赤酵母NEER醋酸乙酯、醋酸异戊酯、醋酸异丁酯果香、朗姆酒香等[7]芒果红酵母、植物乳植杆菌、干酪乳酪杆菌1-己醇、1-七醇、1-辛醇、亚麻醇、β-大马士革酮、柠檬烯等花香、果香、松香、柠檬香等[8]南瓜嗜酸乳杆菌、肠膜明串珠菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳酪杆菌3-羟基-2-丁酮、乙酸、丙酮等清香、果香等[9]桑葚异常威克汉逊酵母、酿酒酵母乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、棕榈酸乙酯等香蕉味、玫瑰花香、蜂蜜甜香、热带水果香、奶油香等[10]红枣安琪果酒酵母、植物乳植杆菌、嗜热链球菌嗜热亚种辛酸乙酯、丙酸乙酯、2,3-戊二酮、2-庚醇等果香、青草香、花香等[11]沃柑酿酒酵母、毛榛毕赤酵母、植物乳植杆菌乙酸、异山梨醇、苯乙醇、2,3-丁二酮等酒香、花香、奶油香[12]葡萄酿酒酵母、酒类酒球菌琥珀酸二乙酯、乳酸乙酯等黄油香、奶油香[13]枸杞酿酒酵母、植物乳植杆菌乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇、大马士酮等水果香、花香、白兰地酒香等[14]
1.1.1 醇类物质
醇类物质是果蔬汁中芳香特性来源的主要优势化合物[5],主要由2个途径生成:一是微生物通过糖分解代谢形成代谢产物;二是发酵果蔬汁原料中的蛋白质经发酵被分解为氨基酸,氨基酸又发生脱氨或脱羧反应生成醇类物质。
近年来,混合菌种的发酵在不断发展,其产物的风味物质含量及种类普遍高于单菌发酵的产物。张璐等[6]在利用植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)115和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)混合发酵猕猴桃汁中,经发酵后检测出醇类物质12种,其含量占香气物质总量的53.33%,混菌发酵可产生3种单菌发酵没有的醇类物质,分别为正丁醇、反式-2-己烯-1-醇和4-萜烯醇。含量较高的为反式-2-己烯-1-醇,占香气物质总量的6.31%;与单菌发酵对比,混菌发酵后正己醇的含量较发酵前的含量明显升高,由7.72 mg/kg上升到9.97 mg/kg。正己醇具有果香味,随含量的升高,散发出果香会更加浓郁、典型[15]。ZHONG等[8]利用酵母和植物乳植杆菌、干酪乳酪杆菌混合发酵芒果汁,乳酸菌酵母菌混菌发酵组具有花香、蜂蜜香气的苯乙醇含量从242.64 μg/L升高到1 636.20 μg/L,提升了近7倍。陈晓蝶等[12]利用酿酒酵母、毛榛毕赤酵母和植物乳植杆菌分别进行沃柑果酒的单菌与混菌发酵,结果显示相比单菌发酵组,三菌发酵组增加了高级醇的种类和含量,增加了沃柑果酒的香气复杂性。
混菌发酵较单菌发酵产生种类更丰富的醇类物质,其中部分是发酵果蔬汁的特征香气物质,所以混菌发酵果蔬汁可以显著提高其风味品质。
1.1.2 酯类物质
酯类物质是由醇类物质结合酸发生酯化反应形成的,可赋予发酵产物酒花香以及水果香。酯类在自然环境中有高挥发性的特点,因此,即使发酵果蔬汁中酯类物质含量较少,也是产生香气的重要成分之一。
猕猴桃汁经过干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)CICC 20994、戊糖乳杆菌CICC 22174、植物乳植杆菌CICC 20265、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CICC 20269和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)5种乳酸菌发酵有助于酯类物质的形成,共产生7种酯:丁酸乙酯、硼尼酰丁酸酯、ã-叔乙酸酯、乙酯-2、4-十二烯酸酯、乙基-2、4-十二烯酸酯、甲酸香叶酯和壬乙酸酯。在浓度方面,CICC 20265和CICC 20269混菌发酵产生的丁酸乙酯、壬乙酸酯和苯乙酸乙酯的含量比单菌发酵显著升高,这些酯的产生增加了猕猴桃汁成熟果实的香气,赋予了其更浓的果味和甜味[16]。
在乳酸菌和酵母菌的混菌发酵中,酵母菌发酵产生的乙醇可以与乳酸菌发酵产生的酸类物质结合生成酯。WANG等[7]在利用植物乳植杆菌C17、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)Lp-B以及毕赤酵母(Pichia)NEER混合发酵甜瓜汁,发现在发酵过程中产生了大量的酯类物质,如醋酸乙酯、醋酸异戊酯、醋酸异丁酯、醋酸丁酯、醋酸丙酯和醋酸戊酯等,这些酯类物质可产生强烈的果香,且醋酸乙酯、醋酸异戊酯、醋酸异丁酯是混菌发酵才产生的独特酯类,在两种乳酸菌单菌发酵中并不存在[17]。醋酸乙酯是发酵甜瓜汁的特征香气物质,丰富了甜瓜汁的香气成分。RUIZ等[18]用酒类酒球菌(Oenococcus oeni)对葡萄酒进行二次发酵,通过苹果酸-乳酸发酵途径把苹果酸转化为乳酸,降低葡萄酒的酸涩口感。此外,相比于一次发酵,葡萄酒中醋酸酯和脂肪酸乙酯的浓度显著增加,醋酸酯质量浓度从21.96 mg/L提高到28.01～30.14 mg/L,乳酸乙酯从3.27 mg/L上升到52.34 mg/L,分析原因是二次发酵时乳酸菌发酵产生的酸与一次发酵时酵母菌发酵产生的乙醇发生了酯化反应。
混菌发酵饮料的酯类物质的种类和含量,得到提高,酯类物质作为发酵果蔬汁中贡献极大的组分,为发酵果蔬汁的香味提升提供重要作用。
1.1.3 酮类物质
酮类物质在发酵过程中主要由微生物分泌酶促进脂肪氧化途径形成,且酮类物质的香气阈值较低,因此含量较低时也能对风味产生很大影响,能赋予发酵物质奶香和果香,是发酵果蔬汁重要的特征风味物质[6]。发酵果蔬汁中主要的酮类物质包括2-甲基-3-戊酮、3-辛酮、香叶基丙酮、4-庚酮以及2-壬酮等。
尹雪林等[19]用戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为猕猴桃酒的发酵菌株,以2种单菌分别发酵猕猴桃酒作为对照组,混合菌株发酵作为实验组,研究发现,混菌发酵组获得的挥发性香气成分种类多于单菌发酵组,且混菌发酵产生了新的酮类物质β-大马士酮。该物质具有强烈的玫瑰香味,赋予发酵产物独特的香气。叶萌祺[20]用异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)和酿酒酵母混合发酵苹果酒产生的β-大马士酮含量为0.08 mg/L,高于酿酒酵母单菌发酵。此外,混菌发酵的苹果酒中还检测出香叶基丙酮,香叶基丙酮是一种具有甜味、青草味和果香的挥发性物质,混合发酵的苹果酒中香叶基丙酮的含量提高,赋予苹果酒更丰富的香气。
上述研究结果显示,混菌发酵可产生许多单菌发酵无法高效形成的酮类物质,对改善果蔬汁质量具有重要影响。
1.1.4 醛类物质
醛类物质在果蔬中的含量较少,但同样是一种重要的挥发性化合物,这类物质浓度过高可能会对果蔬汁的口味产生负面影响,浓度过低则会影响发酵果蔬汁的香气质量,因此,发酵后醛类物质含量应保持在一定的浓度范围内。醛类物质是脂质氧化过程中经烷氧自由基分解产生的,有油脂香和果香。因为其是不稳定的化合物,在发酵过程中,微生物的生长代谢会使得醛类物质在食品基质中还原为醇或氧化为酸[21]。
谢晶晶[22]在使用酿酒酵母和德尔布有孢圆酵母混菌发酵紫山药酒的研究中发现,发酵后共产生3种醛类物质,其中2,4-二叔丁基苯酚和2,4-二甲基苯甲醛是混菌发酵产生而单菌发酵不产生的,相对含量分别为4.55%和0.55%;癸醛具有柑橘的清香,经混菌发酵含量显著增加,由0.33%上升到3.41%。在混菌发酵后,醛类物质的总含量呈升高趋势。张江宁等[11]利用市售植物乳植杆菌和安琪果酒酵母混菌发酵红枣汁后,对其发酵后挥发性风味物质成分进行分析,醛类物质在乳酸菌和酵母菌单菌发酵中占挥发性风味物质的0.4%和0.2%,混菌发酵后含量提升到1.3%。其主要的醛类为乙缩醛、E-2-庚烯醛、E-2-己烯醛等。乙缩醛提供青草气味,带果香,微甜带涩;E-2-己烯醛具有宜人的绿叶香味和符合消费者习惯的水果香气。
尽管混菌发酵果蔬汁只产生了较少量的醛类物质,但这些醛类物质对风味的贡献不容小觑,符合人们对果蔬汁风味的习惯和要求。
1.2 非挥发性风味物质
1.2.1 有机酸
有机酸类是分子结构中含有羧基的化合物,其通常以游离形式存在于植物的叶、根以及果实中,如乌梅、覆盆子等,且有机酸的含量影响着发酵果蔬汁的味道、颜色、化学稳定性、pH、营养特性、可接受性和贮存质量的平衡。
MENEZES等[23]在植物乳植杆菌LBC 81和酿酒酵母CCMC 0615共发酵玉米汁中,产生的主要有机酸为乳酸、乙酸、琥珀酸和苹果酸。其中,乳酸和乙酸在发酵的过程中由乳酸菌生成,其形成为发酵产物提供了营养价值,但含量过高会导致风味不佳;乙酸是乙酸乙酯的前体物质,在发酵后期转变为酯,提高发酵产物的香气;苹果酸是发酵中重要的风味混合剂。与植物乳植杆菌LBC 81单菌发酵相比,混菌发酵显著降低了乳酸和乙酸的含量,分别从0.55 g/L和0.22 g/L分别降到了0.28 g/L和0.17 g/L,由于2种酸浓度过高会产生异味,因此二者含量降低对玉米汁的形成起着积极作用。马立娟等[24]用酿酒酵母和植物乳植杆菌发酵菠萝汁,与植物乳植杆菌单菌发酵相比发酵产物在有机酸的组成上存在差异,单菌发酵乳酸产量极高,而酵母菌的加入降低了乳酸的含量,并且产生了甲酸,导致了混菌发酵菠萝汁与单菌发酵的口感发生变化,同时,混菌发酵也降低了琥珀酸和苹果酸的含量。蓝莓汁中柠檬酸含量高导致口感偏酸,在蓝莓汁发酵过程中同时引入酵母菌和乳酸菌降低了发酵产物的酸度,获得更加醇厚的口感[25]。
由以上发酵果蔬汁的实例可知,对于原液富含柠檬酸的果蔬汁,如山楂、蓝莓等,经乳酸菌单菌发酵后酸度过高会影响口感,可用酵母菌联合乳酸菌进行发酵对果蔬汁酸度进行调节。一方面,某些酵母菌,如毕赤酵母可以有机酸作为发酵碳源促进酵母菌生长,从而降解含量过高的柠檬酸等有机酸,降低发酵产物酸度。另一方面,酵母代谢产生的醇类物质与有机酸反应转化成酯,也有助于果蔬汁酸度的降低。
在酵母菌与乳酸菌混合发酵果蔬汁过程中,乳酸菌进行的同型或异型乳酸发酵,其丰富的代谢产物可为发酵果蔬汁提高营养价值,而酵母菌可适量降解发酵过程中含量升高的有机酸,降低酸度的同时,可为发酵产物带来更加丰富的口感。
1.2.2 酚类化合物
酚类化合物有内源性酚类化合物和外源性酚类化合物,存在于植物中的酚类物质称为内源性酚类化合物,如黄酮类化合物以及酚酸类化合物。在食品发酵加工的各个阶段中,外源性复合酚类化合物的形成可改变饮料的质量特性,如口味、颜色、收敛性等。
杨梅中主要的酚类化合物是黄酮醇、花青素、没食子酸和原儿茶酚酸。ZHU等[26]在使用酵母菌、乳酸菌以及醋酸菌混合发酵杨梅汁的工艺中发现,混合发酵可显著提高没食子酸和原儿茶酚酸的含量,增加发酵汁的抗氧化活性;酵母菌单菌发酵杨梅汁的花青素含量显著降低,饮料颜色明显变浅,而混合菌种发酵可减缓花青素的降解,使发酵杨梅汁色泽加深、提高亮度,使其具有良好的外观并提高抗氧化活性。
混菌发酵果蔬汁可以减弱酚类物质的降解,酚类物质不仅对发酵果蔬汁的风味有所改善,而且具有抗氧化、抗炎症、提高免疫力等一系列对人体有益的功能,因此,减弱酚类物质降解可以提高发酵果蔬汁的营养价值。
1.2.3 氨基酸
氨基酸是一类含有氨基和羧基的有机化合物,它们是构成蛋白质的基本单元。同时在发酵食品中,也作为非挥发性风味物质发挥重要作用。例如,谷氨酸是鲜味的主要来源,芳香族氨基酸可以通过降解形成具有果香、花香的化合物,甘氨酸和丙氨酸则可以与葡萄糖发生美拉德反应从而产生甜味[27]。VILA-REAL等[28]利用植物乳植杆菌299V和魏斯氏菌2LABPT 05发酵小米饮料,发现发酵8 h后精氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺的含量增加了1～2倍,精氨酸和苏氨酸不仅可以提供甜味,而且还具有如维持肠黏膜完整性和屏障功能等健康功能,可以促进身体健康。张倩茹等[29]采用市售植物乳植杆菌、鼠李糖乳酪杆菌和副干酪乳酪杆菌发酵红树莓山楂汁,发酵饮料中游离基酸的总量为732.68 mg/kg,天冬氨酸含量由发酵前的81.11 mg/kg增至143.78 mg/kg,谷氨酸由发酵前的118.69 mg/kg增至139.57 mg/kg,谷氨酸和天冬氨酸是发酵液中含量最高的2种氨基酸,是酸味氨基酸,同时也是鲜味物质形成的前提,由此可见经发酵,发酵液酸味、鲜味等风味更加浓郁。
在果蔬或谷物等植物基底中,蛋白质含量较少,且大分子物质不易被吸收。经发酵后,发酵基底中的蛋白质被酶分解成多肽和氨基酸等物质,使其更容易被人体吸收。发酵后含量增加的氨基酸不仅可以提供良好风味,同时也具有某些健康功能,满足人体所需。
1.2.4 还原糖
还原糖是具有还原性的糖类,即分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖,包括人们熟知的葡萄糖和果糖,以及食品中常用的甘露糖和阿拉伯糖等都是还原糖。还原糖在发酵中可被微生物直接利用,是表征发酵的重要指标之一[30]。此外,还原糖作为重要的非挥发性风味物质,可以调节发酵果蔬饮料的甜度和口感。
微生物发酵果蔬汁时一方面利用果蔬汁中的还原糖作为碳源加以利用,另一方面通过微生物表达的糖化酶、纤维素酶等降解淀粉、纤维素产生葡萄糖等还原糖。发酵产物中还原糖含量变化取决于微生物发酵过程中还原糖消耗和生成的动态平衡。宋泽铭[31]用酿酒酵母1-7-1和植物乳植杆菌A33发酵低醇椰子水,在发酵36 h后,酿酒酵母单菌发酵还原糖消耗最多,含量降低至27.98 g/L,植物乳植杆菌单菌发酵的还原糖消耗相对较少,含量为37.14 g/L,而混菌发酵椰子水的还原糖含量介于二者之间。此结果表明,酵母菌利用糖的能力高于乳酸菌,发酵27 h后还原糖下降速度提升说明酵母菌可以优先利用还原糖发酵。经过发酵,椰子水本身的甜度降低,但可能通过糖酵解途径或美拉德反应产生一些新的挥发性风味物质,提供独特风味。乳酸菌可通过糖酵解途径将单糖转化为丙酮酸,丙酮酸再转化为一些短链有机酸、醇类和羰基化合物等风味物质,如双乙酰、乙醛、乙酸和乙醇等[32]。
综上所述,果蔬汁混菌发酵研究中,如果发酵菌株与发酵基底适配,且菌株之间匹配得当,发酵产物中非挥发性和挥发性风味物质都会向着使果蔬汁口感、风味和滋味以及健康功能提升的方向变化。分析原因如下:1)不同微生物的代谢产物相互发生化学反应,例如乳酸菌代谢产物乳酸和酵母菌代谢产物醇类反应形成酯类风味物质;2)不同种属微生物含有不同的酶系,分别催化果蔬汁发酵基底发生不同的代谢转化,形成优势互补,从而产生更丰富的风味物质;3)乳酸菌和酵母菌互相转化彼此的代谢产物,如酵母菌可以利用乳酸菌代谢产物乳酸作为碳源,降低发酵产物中乳酸含量,同时增加醇类、酯类物质,调节风味物质含量。自然发酵食品大多为混菌发酵,这既反映了环境微生物的丰富性,也说明混菌发酵比单菌发酵更具天然优势。但是,自然发酵食品的质量稳定性不佳,受环境影响大,所以,需要深入探究混菌发酵对食品感官品质、安全性和储存特性的影响,筛选优良菌株,优化发酵工艺,阐释分子机制。
2 混菌发酵果蔬汁中乳酸菌和酵母菌的互作关系和机制
由于乳酸菌和酵母菌混菌发酵可产生新风味物质,或调节某些风味物质含量,因此二者联合发酵常被用于生产实践中。为了阐释其科学性,学者们探究了发酵体系中的乳酸菌和酵母菌的互作关系,如偏利共生、协作、中立、竞争、拮抗等等[33]。乳酸菌和酵母菌主要的几种相互作用机制如图1所示。下面将讨论乳酸菌和酵母菌间几种主要的互作关系和分子机制,以及对发酵饮料品质的影响。
a-影响细胞生长;b-群体感应作用;c-代谢产物互补作用
图1 乳酸菌和酵母菌的主要相互作用机制
Fig.1 Main mechanisms of the interaction between lactic acid bacteria and yeasts
2.1 协同作用
乳酸菌和酵母菌都是发酵果蔬汁常用菌株,二者最常见的相互作用是协同作用,即乳酸菌与酵母菌都朝着有利于生长的方向进行。例如,岳洋洋[14]用植物乳植杆菌R3和酿酒酵母JY2共发酵枸杞制备枸杞酒,通过测定其生长曲线初步确定2种菌为协同关系,植物乳植杆菌R3的加入可促进酿酒酵母JY2的生长。
对于乳酸菌和酵母菌协同作用的机制,得到最广泛认可的是代谢产物互补机制[34],如乳酸菌的代谢产物为酵母菌提供能量来源,酵母菌发酵产生的维生素和氨基酸等物质则为乳酸菌提供生长因子[35]。另外,乳酸菌发酵产生乳酸导致发酵环境的pH下降,当下降到适合酵母菌增殖的条件时,酵母开始酒精发酵,同时还可利用发酵基底中其他营养物质促进乳酸菌生长。
乳酸菌和酵母菌协同作用的另一个机制是通过群体感应(quorum sensing,QS)系统进行细胞间通信。在QS系统中,自诱导因子-2(autoinducer-2,AI-2)是最常见、最重要的信号分子,由LuxS基因合成,用于种内和种间通讯[36]。当AI-2的浓度达到阈值时,与乳酸菌细胞膜上的受体蛋白结合,通过信号传递调节基因表达,从而影响乳酸菌的行为,具有调控生物膜形成、影响细菌素代谢和影响乳酸菌耐酸胁迫等作用[37]。WANG等[38]从西藏开菲尔饮料中分离出了副干酪乳酪杆菌GL1、瑞士乳杆菌SNA12以及马克斯克鲁维酵母G-Y4,并且发现添加了G-Y4无细胞发酵上清液(cell-free supernatant,CFS)的2株乳酸菌生物膜形成能力明显提高。进一步研究显示,添加G-Y4 CFS导致乳酸菌LuxS基因转录水平大幅提升,产生更多AI-2,促进了乳酸菌生物膜的形成。此发现证明开菲尔饮料中酵母菌通过代谢产物调节乳酸菌活性,解释了酵母菌和乳酸菌的协同关系的QS机制。
乳酸菌与酵母菌协同互作的另一机制是朊粒机制。朊粒,又称蛋白质侵染因子或感染性蛋白质,最早在动物细胞中发现,与疯牛病等传染性疾病有关。在酵母细胞中也存在朊粒,最早发现的是[PSI+]、[URE3]和[PIN+],朊粒的形成影响酵母细胞的生长。WATANABE等[39]研究显示,在kimoto清酒发酵初期,发酵体系中酿酒酵母和乳酸菌共存,乳酸菌产生的乳酸作用于酵母菌,引起朊粒[GAR+]的形成,改变了酵母菌的糖代谢通路,使酵母菌可以在含葡萄糖的发酵条件下优先利用其他碳源,减少乙醇的产生。通过这种作用方式,乳酸菌促进了自身和酵母菌的扩增,为后期以酵母菌为主的酒精发酵创造更好的条件。
2.2 拮抗竞争作用
除了协同作用,拮抗竞争也是乳酸菌和酵母菌之间一种重要互作方式。例如,在产酸啤酒中,乳酸菌产生乳酸导致啤酒具有酸味,而酵母菌可通过抑制乳酸菌过度发酵而获得风味优良的产酸啤酒[40]。二者的拮抗竞争作用尚未有明确的机制解释,但根据前期的一些研究[41-42],广泛接受的一种机制是乳酸菌发酵产生大量酸性代谢产物超过酵母菌耐受pH下限后会抑制酵母菌的生长,而酵母菌通过分解糖类产生酒精,酒精使乳酸菌蛋白质变性,从而抑制乳酸菌生长。此外,乳酸菌和酵母菌间也通过其他代谢产物的相互拮抗,影响彼此的生长速率,如乳酸菌产生的4-羟基-苯乳酸、环肽可以抑制酵母菌生长[43-44]。在白酒制作过程中,酿酒酵母代谢产生SO2导致植物乳植杆菌的死亡,这也是发酵食品中乳酸菌和酵母菌拮抗作用的另一例证[45]。
乳酸菌和酵母菌拮抗竞争作用的另一机制是群体感应。群体感应现象可以促进生物膜形成,但是,当LuxS基因表达较少,无法达到阈值时,群体感应同样具有某些抑制作用,如抑制生物膜形成、抑制细菌素代谢等等。GU等[46]从酸奶中分离出了酿酒酵母YE 4、屎肠球菌8-3及发酵乳杆菌2-1,研究表明,酿酒酵母YE4 CFS不仅抑制屎肠球菌8-3和发酵乳杆菌2-1的生长,还能抑制其生物膜形成,是因为酿酒酵母YE4 CFS影响了LuxS基因的表达,从而抑制了两种LAB细胞信号分子AI-2的活性。
此外,LIU等[47]的研究显示,乳酸菌和酵母菌在原子力显微镜下可见共聚集,进而提出二者的相互拮抗作用可以通过物理接触发生。转录组水平研究显示植物乳植杆菌与酿酒酵母的接触导致酵母细胞中与细胞周期、细胞增殖相关的基因表达改变,抑制了酵母菌的生长和增殖。乳酸菌和酵母菌在营养贫乏的环境中共栖,二者对碳源等营养物质和生长空间的竞争显然也会限制其生长和活性,所以在共发酵时需要调整菌种比例和发酵时间。
3 人工合成菌群在发酵中的应用
在食品发酵体系中微生物的相互作用形成复杂的网络,即影响不同微生物的生长和代谢,也对食品风味的形成发挥重要作用。很多自然发酵食品的风味具有明显的地区差异性,这和发酵环境中微生物种类具有密切关系,导致食品发酵过程的标准化和精准控制存在困难。为了解决这个问题,很多研究者探索了人工合成菌群的构建,即从自然发酵食品中分离优势微生物,进行不同的组合构建人工合成菌群,达到类似、甚至优于天然发酵剂的效果。
宋肖肖等[48]从天然茶菌饮料中分离纯化功能菌株,得到迈耶氏酵母等4个优势菌株,以此构建人工复合菌剂。通过不同复合方式的比较得到一款人工合成菌群发酵剂,发酵茶菌饮料在总酸度和茶多酚含量上与自然发酵产品相似,证明通过菌株复配构建稳定的人工发酵剂可行,为茶菌的标准化工业生产打下基础。郭小龙等[49]从高温大曲中分离酵母等微生物,构建人工合成菌群替代传统母曲制作高温大曲,结果表明人工合成菌群在定向调控大曲酶活性以及白酒中某些特定风味组分及含量方面具有潜在应用价值。
乳酸菌和酵母菌的组合在发酵果蔬方面也显示了增香、增色的优势。VIESSER等[50]研究显示,可可浆中主要可发酵糖是葡萄糖和果糖,在自然发酵时微生物优先利用葡萄糖,所以葡萄糖消耗快而果糖消耗慢,发酵效果不佳。研究者将一株可高效利用果糖的植物乳植杆菌LPBF 35与发酵毕赤酵母YC 5.2组合后,发酵初级代谢产物乙醇、乳酸、乙酸和次级代谢产物2-甲基丁醇,乙酸异戊酯、乙酸乙酯的含量显著增加,使发酵可可浆的色泽和风味都得到改善。此研究结果为基于发酵基底的碳水化合物成分,理性设计构建人工菌群发酵其他果蔬汁提供了良好的借鉴。
4 总结与展望
在食品发酵过程中,发酵底物与微生物的适配,微生物之间相互调节,微生物代谢产物之间发生化学反应等,使发酵食品风味物质形成的动态过程不易调控。乳酸菌和酵母菌作为自然发酵食品中最常见的2种微生物,近年来其混菌发酵产物已经成为研究热点。总体上,混菌发酵可产生更多的风味物质如醇类、酯类、酮类、醛类,也可平衡有机酸、还原糖含量,为发酵果蔬汁提供了良好的风味和营养价值。但是,为了实现发酵过程的稳定可控、定向增加风味化合物种类与含量,还需要深入研究发酵果蔬的基底成分、关键风味物质、发酵微生物的代谢途径、关键调节基因以及发酵微生物之间的相互作用机制,从而更好地为构建人工合成菌群提供支撑。
目前关于发酵食品的研究,大部分都基于高效液相色谱、高效气相色谱、液相色谱-质谱联用以及气相色谱-质谱联用等技术展开,仅能做到对风味物质的组分或含量进行定性或定量分析,而研究风味物质产生机制、代谢通路及乳酸菌和酵母菌相互作用影响风味物质的机制研究很少。未来需要利用人工智能结合基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等先进技术对其进行更加深入全面系统的研究。乳酸菌和酵母菌联合发酵果蔬汁风味物质及其形成机制的深入研究,可为现有发酵果蔬饮料工艺改良优化提供参考,进一步为开发新型发酵果蔬汁提供理论基础。
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