咖啡是咖啡豆经过烘焙磨粉后加热水冲泡得到的饮料,同可可和茶作为三大无酒精饮料在全球流行[1]。中国咖啡主要产于云南,其咖啡种植面积及产量占全国的98%以上,主要分布于普洱、保山、德宏和临沧地区[2]。咖啡从鲜果到生豆主要有:采摘、加工、干燥、脱壳和分选5个步骤[3]。不同的加工方法赋予咖啡豆不同的风味品质[4-5]。咖啡的整个加工过程均有微生物的参与,乳酸菌和酵母菌是主要优势微生物[6],风味的形成与之存在密切关系[7-8],发酵过程是咖啡香气形成和风味发展的关键[9]。
在没有咖啡果肉基质或自身微生物参与的情况下,以发酵剂控制无菌咖啡生豆发酵是一种直接且有针对性的咖啡风味生物转化技术[10]。国内外研究表明,以酵母菌、乳酸菌或霉菌为发酵剂对无菌咖啡生豆进行发酵,可控制发酵过程,调节咖啡成分,改善咖啡风味[11-13]。WANG等[14]将酿酒酵母、毕赤酵母和乳酸乳球菌亚种接种于无菌咖啡生豆中,发酵提升了乙酸异戊酯、2-苯乙酯和糠醛的含量,在烘焙后,赋予咖啡水果和葡萄酒的香气及焦糖味。KIM等[15]以3种酵母和3种乳酸菌发酵无菌咖啡生豆,分析对代谢产物的影响,发酵后的咖啡游离氨基酸和总糖含量增加,提升了咖啡的甜感。将咖啡生豆灭菌,接种少孢根霉发酵3 d,咖啡豆吡嗪类物质的含量增加,对咖啡的挥发性风味有显著影响[16]。以微生物对无菌咖啡生豆进行发酵,能改变咖啡风味,提升咖啡品质,但是仅以微生物进行发酵无法得到某种特定的风味,为满足现代消费者对咖啡多样化需求,使咖啡多元化发展,赵林芬等[17]以酿酒酵母为发酵剂,添加热带水果和蜂蜜等与咖啡鲜果共同发酵,赋予咖啡水果香气,提升了咖啡的甜度,改善了咖啡风味品质。田浩等[18]发明了一种定向风味发酵咖啡的制备方法,以咖啡生豆为原材料,添加气相色谱-飞行时间质谱技术筛选含芳樟醇的风味底物,并接种乳酸乳球菌和酿酒酵母共同发酵,赋予咖啡桂花香气,制成桂花风味的咖啡饮品。鲍晓华[19]发明了一种小粒咖啡豆的蕉蜜加工工艺,将咖啡鲜豆在晒架上摊开晾晒至半干,加入香蕉泥搅拌均匀发酵一段时间后干燥,处理后增强了咖啡的香气和醇厚度。然而,目前对咖啡生豆在微生物的作用下添加风味原料发酵风味咖啡的工艺研究仍然较少。
本研究以食用玫瑰和咖啡生豆为原料,采用单因素试验和响应面优化相结合的方法,研究了马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)发酵玫瑰风味咖啡的最佳工艺,并对其发酵咖啡生豆色泽变化、生物活性成分进行分析比较及杯测,为咖啡发酵工艺的改进、风味品质的提升和咖啡多元化发展提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
K.marxianus,本实验室分离得到,菌株保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC),保藏编号:CGMCC 30564;YPD培养基,广东环凯微生物科技有限公司;单宁酸、芦丁、没食子酸标准品、福林酚,上海源叶生物科技有限公司;Al(NO3)3·9H2O,成都市科隆化学品有限公司;NaNO2、NaOH、Na2CO3,天津市致远化学试剂有限公司;咖啡豆、云南小粒咖啡-2023产季卡蒂姆水洗,云南保山潞江坝卡尔代咖啡庄园(海拔1 300 m);玫瑰花、大马士革玫瑰干花,云南翠云山农业科技有限公司。
1.2 仪器与设备
ELx800酶标仪,美国Biotek公司;BCM-1000A超净工作台,苏州安泰技术有限公司;Eppendorf移液枪,南京贝登医疗股份有限公司;9053A烘箱,上海实研电炉有限公司;HHPX-9272ME恒温培养箱,上海博讯实业有限公司;LX-B高压蒸汽灭菌锅,北京市永光明医疗仪器有限公司;HB64咖啡研磨机,温州梦享家餐饮设备有限公司;pH-10 pH计,广州市铭睿电子科技有限公司;R500F型咖啡烘焙机,北京三豆客科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵剂制备
把甘油管冻存的菌株取出,回温,接种于无菌的YPD液体培养基中,在28 ℃恒温培养2 d,传代,活化2代后离心,弃上清液加无菌生理盐水调节至所需浓度,备用。
1.3.2 咖啡发酵过程及烘焙研磨
挑选除去原料中的破碎豆、发霉豆、虫蛀豆、贝壳豆、萎缩豆等瑕疵豆及其他杂质,把咖啡豆放入发酵罐中加2倍的纯净水,用封口膜封口后110 ℃灭菌5 min。将配制好的菌悬液接到冷却至室温的发酵罐中,再加入玫瑰瓣,混匀;发酵罐置于恒温培养箱中发酵,发酵结束后将玫瑰花剔除,咖啡豆放于不锈钢筛网中,放入烘箱45 ℃干燥至水分含量低于12%;
烘焙:参照ZHAI等[20]的方法进行烘焙;
研磨成品:采用HB64咖啡研磨机对烘焙豆进行研磨,随后过40目筛网。
1.3.3 咖啡发酵条件单因素试验
以K.marxianus为发酵菌株,按照发酵工艺,考察发酵温度(20、25、30、35、40 ℃)、发酵时间(36、48、60、72、84 h)、接菌后发酵体系的浓度(以下简称接菌浓度)(4、5、6、7、8 lg CFU/mL)、玫瑰花添加量(4、6、8、10、12 g/100 g,咖啡生质量)对杯测感官评分的影响。考察其中一个因素时,其他因素以前期预实验中对玫瑰风味咖啡杯测分值较高的条件为固定值,分别固定为:发酵温度25 ℃、发酵时间60 h,接菌浓度7 lg CFU/mL,玫瑰花添加量8 g/100 g。
1.3.4 响应面法优化酵母发酵玫瑰风味咖啡工艺条件
结合咖啡发酵条件单因素试验的结果,将杯测感官评分作为评价指标,以发酵温度(A)、发酵时间(B)、接菌浓度(C)和玫瑰花添加量(D)为考察因素进行响应面设计,各因素水平编码见表1。
表1 Box-Benhnken试验设计因素与水平
Table 1 Box-Benhnken test design factors and levels
代号因素编码及水平-101A发酵温度/℃253035B发酵时间/h607284C接菌浓度/(lg CFU/mL)567D玫瑰花添加量/(g/100 g)81012
1.3.5 单宁酸含量的测定
参照HAILE等[21]的方法略作修改,准确称取1.00 g咖啡生豆粉末置于烧杯中,用20 mL热水进行提取,30 min后定容至25 mL,过滤后备用;取0.2 mL咖啡提取物,置于盛有6 mL水的10 mL容量瓶中,摇匀;加入0.5 mL福林酚和1 mL 75 g/L Na2CO3溶液;纯水定容,摇匀。放置30 min显色后,760 nm处测定吸光度;标准曲线:y=0.035 8x+0.045 4,R2=0.999。按公式(1)计算:
(1)
式中:ω,试样测定液中单宁酸的含量,mg/g;V1,试样提取定容体积,mL;V2,测试定容体积,mL;V3,测试吸取体积,mL;D,试样稀释倍数;m,试样质量,g。
1.3.6 总多酚含量的测定
使用福林酚法测定总多酚含量。参照王彦兵等[22]的方法,略作修改,称取1.00 g咖啡生豆粉末于烧杯中,加入20 mL 50%(体积分数)乙醇溶液,于60 ℃超声波提取40 min后定容至25 mL,过滤后备用。取1.0 mL咖啡提取液,放入10 mL比色管中,加入0.2 mL福林酚,3～8 min后加入2 mL 75 g/L Na2CO3溶液,纯水定容,避光静置1 h,765 nm处测定吸光值。标准曲线:y=0.048 1x+0.070 6,R2=0.997 7。其计算如公式(2)所示:
(2)
式中:X,样品总多酚(以没食子酸计)含量,mg/g;ρ,试样测定液中没食子酸的质量浓度,mg/L;V4,试样提取定容体积,mL;V5,检测定容体积,mL;V6,测试吸取体积,mL;n,试样稀释倍数;m,试样质量,g。
1.3.7 总黄酮含量的测定
采用硝酸铝法测定总黄酮含量。参考WIBOWO等[23]的方法略修改,准确称取1.00 g咖啡生豆粉末置于烧杯中,用20 mL热水提取30 min后定容至25 mL,过滤后备用;取2.0 mL咖啡提取物,分别置于25 mL比色管中,补水至10 mL,加50 g/L NaNO3溶液1 mL混匀,放置6 min;再加入100 g/L Al(NO3)3溶液1 mL混匀,放置6 min;最后加200 g/L NaOH溶液4 mL,纯水定容,混匀,放置15 min。其中1份不加Al(NO3)3溶液作为样品空白;在510 nm处测定吸光度。标准曲线:y=0.214 7x+0.005 4,R2=0.999 3。其计算如公式(3)所示:
(3)
式中:X,样品总黄酮(以芦丁计)含量,mg/g;m1,试液中黄酮质量,mg;V7,试样提取时定容体积,mL;V8,测试时取样体积,mL;m,样品的质量,g。
1.3.8 咖啡色泽的测定
准确称量咖啡生豆粉状样品5.0 g于色差分析仪检测皿中对咖啡生豆色差参数L*、a*和b*进行测定,每个样品重复测3次。
1.3.9 咖啡杯品测评
取烘焙好的咖啡豆样品,由5名获得Q-Grader Coffee认证的专业咖啡杯测鉴定师组成感官评价小组,按照SCAA标准杯测方法及流程对咖啡豆香气、风味、余韵、酸质、醇厚度、平衡感、干净度、甜度、一致性、整体评价10项指标进行杯测打分,并进行感官风味特征的描述性分析[24],每份咖啡样品均按照SCAA标准进行评分,以0.25分为增量在0～10分区间进行打分,并计算出总评分,总评分越高代表杯测品质越好。
1.4 数据处理
每个实验重复3次,实验结果以“平均值±标准偏差”的形式表示,试验数据的处理分别采用Design-Expert.V8.0、SPSS 26和Origin Pro 2022等软件进行设计、分析及绘制图形。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 接菌浓度对玫瑰风味咖啡感官品质的影响
如图1所示,随着接菌浓度逐渐增加,玫瑰风味咖啡杯测感官评分逐渐升高,当接菌浓度为6 lg CFU/mL时,玫瑰花香明显,与咖啡风味融合平衡,杯测评分达到最高(79.75)。接菌浓度较低时,发酵速度缓慢,发酵时间延长,玫瑰香味与咖啡风味融合较差,余韵短促;接菌浓度较高时,发酵速度过快会导致咖啡过度发酵,酸感较强且尖锐,被接受程度降低,且发酵体系菌体浓度过高,而营养组分有限,发酵体系只能满足菌体自身生长发育,不利于微生物、功能酶等分解大分子物质,释放呈香呈味物质。因此选择酵母菌接菌浓度为6 lg CFU/mL。
图1 接菌浓度对玫瑰风味咖啡感官评分的影响
Fig.1 Effect of inoculation concentration on sensory score of rose-flavored coffee
注:不同字母表示有显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.1.2 发酵温度对玫瑰风味咖啡感官品质的影响
温度是发酵过程中的关键影响因素,温度对微生物繁殖影响较大。由图2可知,当发酵温度为30 ℃时,杯测感官评分达到最高,此时咖啡风味和玫瑰香气融合较为平衡,余韵无杂、口鼻留香。当温度高于或低于30 ℃时都会在一定程度上抑制酵母菌的生长,超过最适温度,微生物生长代谢受影响,易死亡、变性、失活,发酵效果不佳。研究表明28～30 ℃是酵母菌最佳生长温度,因此最适发酵温度为30 ℃。
图2 发酵温度对玫瑰风味咖啡感官评分的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory score of rose-flavored coffee
2.1.3 发酵时间对玫瑰风味咖啡感官品质的影响
酵母菌在不同生长时间产生的代谢产物量不同,其代谢产物量随着发酵时间的延长而增加。由图3可知,发酵72 h时杯测感官评分最高,咖啡风味最佳,醇厚度最为厚重,整体风味评价最高。发酵时间低于72 h时,花香和咖啡风味融合差,有分离感,咖啡醇厚度单薄;当发酵时间超过72 h时,咖啡豆中的营养物质被微生物大量消耗,尤其是碳水化合物,易造成过度发酵,从而导致咖啡品质下降,杯测时咖啡酸质尖锐且带有水感,所以72 h是最适发酵时间。
图3 发酵时间对玫瑰咖啡感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on sensory score of rose-flavored coffee
2.1.4 玫瑰花添加量对玫瑰风味咖啡感官品质的影响
由图4可知,在玫瑰花添加量为10 g/100 g时,玫瑰风味咖啡杯测评分达到最高分,花香浓郁,与咖啡风味协调性较好;当玫瑰花添加量小于10 g/100 g时玫瑰香气较淡,未达到理想效果;当玫瑰花添加量大于10 g/100 g时,玫瑰香气过于浓烈进而掩盖咖啡本身的香气,影响咖啡整体风味,且玫瑰花添加量过多增加成本。因此,玫瑰花最佳添加量为10 g/100 g。
图4 玫瑰花添加量对玫瑰风味咖啡感官评分的影响
Fig.4 Effect of rose dosage on sensory score of rose-flavored coffee
2.2 响应面优化结果分析
2.2.1 响应面试验设计与结果
以发酵温度、发酵时间、接菌浓度和玫瑰花添加量为因素,杯测感官评分为响应值进行发酵工艺优化试验。响应面Box-Behnken实验设计及结果见表2。
表2 Box-Behnken实验设计及结果
Table 2 Box-Behnken test design and results
编号A发酵温度/℃B发酵时间/hC接菌浓度/(lg CFU/mL)D玫瑰花添加量/(g/100 g)Y杯测感官评分(分)1306051064.25±1.232307271266.25±2.063256061071.50±1.544257251068.75±2.30530846872.50±1.85630727871.70±0.507307261079.50±1.508306071069.25±1.259308461272.00±2.5010257261272.50±1.0011307261077.50±1.7512257271071.75±2.251325726875.00±2.001435726873.75±1.2515358461072.25±0.7516258461074.50±1.5017357271070.50±1.2518356061069.75±1.0019308451067.50±1.7520306061269.25±2.3021307251266.00±2.502230725867.25±1.5023307261080.25±0.8424357251065.75±1.7525357261268.75±1.252630606871.00±2.2527308471069.00±2.0028307261081.00±0.7529307261080.50±1.20
利用Design-Expert.V8.0统计软件对表2的试验数据进行多元回归拟合,得到杯测感官评分(Y)对发酵温度(A)、发酵时间(B)、接菌浓度(C)和玫瑰花添加量(D)4个因素的二次多项回归模型:Y=79.75-1.10A+1.08B+1.58C-1.37D-0.12AB+0.44AC-0.63AD-0.88BC+0.31BD-1.05CD-3.06A2-4.56B2-7.66C2-4.16D2。
2.2.2 模型方差分析及响应面分析
通过表3可知,回归模型F值较高(F=41.28),响应面回归模型极显著(P<0.01)。失拟项不显著(P>0.05),说明模型拟合度高,可靠性好。杯测感官评价总分二次回归方程模型的
说明得到的回归方程模型回归效果好,可对实验结果进行预测分析。发酵温度(A)、发酵时间(B)、接菌浓度(C)、玫瑰花添加量(D)的P值均小于0.01,说明这4个因素对玫瑰风味咖啡杯测感官评分的影响极为显著;根据P值大小可以得出影响玫瑰风味咖啡杯测感官评分的因素主次顺序是C>D>A>B,即接菌浓度>玫瑰花添加量>发酵温度>发酵时间。
表3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variances for developed regression equation
来源平方和自由度均方F值P值显著性模型575.201441.0941.28<0.000 1**A14.63114.6314.70.001 8**B13.55113.5513.610.002 4**C29.93129.9330.07<0.000 1**D22.55122.5522.660.000 3**AB0.06310.0630.0630.805 8AC0.7710.770.770.395 2AD1.5611.561.570.230 7BC3.0613.063.080.101 3BD0.3910.390.390.541 1CD4.4114.414.430.043 8*A260.75160.7561.04<0.000 1**B2134.901134.9135.55<0.000 1**C2380.641380.64382.46<0.000 1**D2112.281112.28112.81<0.000 1**残差13.93141失拟项6.43100.640.340.922 5不显著纯误差7.5041.88总差589.1328R20.976 3R2Adj0.952 7
注:**表示差异极显著(P<0.01),*表示差异显著(P<0.05)。
2.2.3 因素间交互作用分析
各因素间交互作用对玫瑰风味咖啡杯测感官评分影响的响应曲面如图5所示。响应面图中曲面越弯曲表明研究因素对结果影响越大[25],因为C(接菌浓度)的影响大于B(发酵时间)、A(发酵温度)和D(玫瑰花添加量),所以BC和AC的曲面陡峭。等高线的形状呈椭圆形表明研究因素之间的交互作用影响显著,CD的等高线呈椭圆形,说明CD的交互作用显著(P<0.05),这与方差分析结果一致。
a-发酵温度与发酵时间;b-发酵温度与接菌浓度;c-发酵温度与玫瑰花添加量;d-发酵时间与接菌浓度;e-发酵时间与玫瑰花添加 量;f-接菌浓度与玫瑰花添加量
图5 各因素间交互作用对杯测感官评分影响的响应面图
Fig.5 Response surface plots of the effect of interaction among factors on cup test sensory scores
2.2.4 验证试验
利用Design-Expert.V8.0预测玫瑰风味咖啡发酵最佳工艺条件为发酵温度29.21 ℃、发酵时间73.23 h、接菌浓度6.10 lg CFU/mL和玫瑰花添加量9.67 g/100 g,预测玫瑰风味咖啡杯测感官评分为80.09。为方便实际操作,将优化发酵工艺条件的参数调整为发酵温度30 ℃、发酵时间72 h、接种浓度6 lg CFU/mL和玫瑰花添加量10 g/100 g。在此条件下发酵玫瑰风味咖啡进行验证,得到实际杯测感官评分为81.25,接近拟合结果,证明模型拟合性好,结果有效。
2.3 玫瑰风味咖啡生物活性成分结果分析
以响应面优化出的最佳工艺进行玫瑰风味咖啡发酵,比较K.marxianus和玫瑰花共同发酵的玫瑰风味咖啡(记为KRF)、K.marxianus发酵的咖啡(记为KF)与原料咖啡(记为YL)生豆的生物活性成分。各咖啡生豆样品中单宁酸、总多酚和总黄酮含量如图6所示。
图6 咖啡发酵前后生物活性成分
Fig.6 Bioactive components of coffee before and after fermentation
由图6可知,KRF、KF和YL中单宁酸、总黄酮含量存在显著性差异(P<0.05),而总多酚含量无差异。发酵后玫瑰风味咖啡生豆中单宁酸和总黄酮含量分别是:9.79 mg/g和26.16 mg/g,由于发酵过程菌株生长与玫瑰花中的某些成分共同作用,促进了单宁酸的释放,发酵后总黄酮含量显著增加,玫瑰花中富含黄酮类物质,与酵母菌共同发酵后能够提高总黄酮含量,有利于增强咖啡的抗氧化性能[26]。
2.4 玫瑰风味咖啡色差结果分析
玫瑰花和K.marxianus的共同发酵对咖啡生豆色泽的影响肉眼可见。色泽的变化可用色差仪来评估,L*值越大,咖啡豆的亮度越大,a*值越大,咖啡豆颜色偏红,而b*值越大,则咖啡豆越黄[27]。由图7可知,接种K.marxianus和玫瑰花共同发酵后,咖啡生豆亮度下降;咖啡生豆颜色偏红,呈玫红色,这是由于发酵过程中玫瑰花里的色素得到分解释放,并迁移至咖啡豆中;而咖啡黄蓝度变化较小。
图7 咖啡发酵前后色差比较
Fig.7 Color indexes of coffee before and after fermentation
2.5 玫瑰风味咖啡烘焙豆的杯测结果
由感官评价小组成员,按照SCAA国际杯测标准对YL、KRF和KF咖啡烘焙豆的各项杯测评分,结果如图8所示。
图8 咖啡杯测评分结果雷达图
Fig.8 Coffee cup measurement score results radar chart
YL、KRF和KF在每个感官属性上都获得了不同的评分,总分分别是78.00、81.25和80.50。KRF在香气、风味、余韵、甜度、一致性上都表现优越,也获得了较好的整体评价和总分。YL咖啡生豆加工方式为传统水洗,其烘焙豆杯测干净度较好,但酸质较为尖锐,香气和风味平淡;KF的余韵和酸质与YL相比有所提升,呈现茶感和泉水甜,但酸度单一,香气淡薄;而添加玫瑰花和酵母菌共发酵后增加了咖啡的香气,赋予咖啡玫瑰花香,KRF杯测风味描述:玫瑰花香、杏仁味、糖浆、花茶口感、泉水甜、酸度柔和。
3 结论
本研究经单因素和响应面试验得到K.marxianus发酵玫瑰风味咖啡的最优工艺条件为:发酵温度30 ℃、发酵时间72 h、接菌浓度6 lg CFU/mL和玫瑰花添加量10 g/100 g,杯测评分为81.25,K.marxianus发酵的玫瑰风味咖啡杯测评分较好,高于原料烘焙豆(78.00);发酵后的咖啡生豆呈玫红色,其中单宁酸含量为9.79 mg/g和总黄酮含量26.16 mg/g。玫瑰花和酵母菌共发酵能促进单宁酸的生成,提高总黄酮含量,玫瑰花赋予了咖啡独特的花香,提升了咖啡的香气,增加了咖啡品类。本研究主要对玫瑰花和酵母菌共发酵玫瑰咖啡的发酵工艺进行优化,比较发酵成品的生物活性成分和色泽变化,并进行杯测,为提升咖啡品质,丰富咖啡风味提供一种思路方法和理论依据,但未对发酵成品的风味物质进行解析,因此后期将进一步深入研究。
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