白酒是我国传统的、最具民族特色的蒸馏酒,使用高粱等粮谷为原料,经过酒曲糖化发酵后,通过发酵、蒸馏、贮存、勾调而成[1]。蒸馏是白酒生产的关键步骤,甑桶固态蒸馏在其中起着不可替代的作用,可将酒醅中的乙醇和多种微量挥发性风味物质浓缩至基酒中[2]。不同的风味物质因沸点和溶解性的差异,在蒸馏过程中的馏出顺序不同,从而影响不同时间段基酒的风味。因此,研究蒸馏过程中风味物质的变化情况,对于明确各阶段基酒中特征风味物质、把控基酒品质、指导白酒勾调有重要意义。
白酒固态蒸馏设备的优化以及风味物质馏出规律的相关研究开始于20世纪80年代。近年来,李学思等[3]基于GB/T 10345—2007《白酒分析方法》标准,深入剖析了浓香型白酒在蒸馏过程中,各个馏分中风味物质的变化规律。研究发现,总酯呈现出“先降后稳,再升后降”的态势;总酸在断花后的含量显著增加,且在酒尾部分增加更显著;乙醛和乙缩醛的含量均逐渐下降。张琦等[4]采用直接进样结合GC-MS解析了浓香型白酒蒸馏过程中风味组分的变化规律,鉴定出70种组分,其中多元醇、酸和高级脂肪酸呈上升的趋势,酯类和一些醇类呈下降的趋势。李艳敏等[5]采用气相色谱法测定解析了老白干蒸馏过程中风味物质的变化规律,其中醇类逐渐降低,乳酸乙酯逐渐增加,乙醛逐渐降低。倪书干等[6]采用液液萃取和GC-MS联用的方法解析了浓香型白酒蒸馏过程中的16种风味组分的变化规律。
已有的研究主要采用GC-MS解析蒸馏过程酒样中的酯类、醇类、酸类和醛类这几种化合物,对于其他一些微量香气组分的研究分析较少。且浓香型白酒是极为复杂的基质,已有研究报道在浓香型白酒中发现了上千种组分[7],传统一维GC-MS无法达到分析要求。全二维气相色谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography, GC×GC)在一维色谱柱的基础上增加了一根极性不同的二维色谱柱,一维柱流出的物质进入二维色谱柱中进行二次分离,从而能够显著提高峰容量和分辨率。目前,白酒风味研究已广泛应用此技术[8-9]。
因此本研究采用顶空固相微萃取(head space solid phase micro extraction, HS-SPME)技术富集浓缩蒸馏过程中酒样的挥发性组分,随后经过GC×GC结合飞行时间质谱仪(time of flight mass spectrum, TOFMS)对其进行分离鉴定,定量分析所有挥发性组分并解析其在蒸馏过程中含量变化的规律,为量质摘酒和分级贮存等工艺提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 酒样采集
浓香型白酒蒸馏酒样采集自五粮液股份有限公司酿酒车间,酒醅所在窖池的窖龄在40年以上,选取中层糟醅上甑蒸馏,酒头每0.5 min收集1个样品,基酒和酒尾每分钟收集1个样品,共37个样品,每个酒样取20 mL,蒸馏时间约34 min。
1.1.2 药品
本研究使用的标准品,美国Sigma-Aldrich公司、日本TCI公司,均为色谱纯;C7～C30直链正构烷烃及乙醇(HPLC级),Sigma-Aldrich公司;NaCl(AR级),中国医药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
超纯水仪,美国Millipore公司;全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(GC×GC-TOFMS, Pegasus 4D),美国LECO公司;7890A气相色谱仪和一维色谱柱DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国安捷伦公司;二维色谱柱Rxi-17SilMS (1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Restek公司;50/30 μm的DVB/CAR/PDMS三相萃取头(2 cm),美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 HS-SPME实验方法
将不同的酒样用饱和NaCl水溶液分别稀释到5%酒精度,然后取1 mL稀释后的酒样放入20 mL带有搅拌子的顶空瓶中,加入10 μL内标溶液,之后在50 ℃、400 r/min的条件下进行平衡,时间为15 min;之后,插入纤维头在相同条件下进行萃取,时间为45 min。萃取富集后的纤维头在GC进样口进行解吸附,进样口模式为分流模式,分流比为5∶1,温度为250 ℃,解吸附时间为5 min,随后进行GC×GC-TOFMS分析。每个样品重复分析3次。
1.3.2 GC×GC-TOFMS分析方法
一维柱箱初始为45 ℃,保持3 min后,再以5 ℃/min 升温至230 ℃并保持10 min。二维柱箱初始为50 ℃保持3 min,并以相同的升温速率升至235 ℃保持10 min。调制补偿温度为20 ℃。调制周期为4 s(热脉冲时间0.8 s)。色谱柱采用恒流模式,流速为1 mL/min,载气为高纯氦气(纯度>99.999%)。
1.3.3 质谱条件
离子源温度电压为70 eV,温度为230 ℃,传输线温度为240 ℃,检测器电压为1 500 V,采集质量数范围为35～400 amu,采集频率为100 spectra/s。
1.4 数据处理
本研究采用LECO公司软件ChromaTOF对原始数据进行解图处理。自动识别信噪比大于100的色谱峰,通过解卷积后与NIST 2020和Wiley 9对比,并剔除质谱相似度小于800的化合物,剔除空白对照背景中的一些化合物如胺类、腈类和烷烃类等,作为初步鉴定结果。采用同样条件分析正构烷烃(C7～C30),以此来计算化合物在一维色谱柱的保留指数,并与文献报道的保留指数进行比对确认,筛选偏差在30以内的组分作为较为准确的结果[9-11]。将标准品添加在52%vol乙醇水溶液中,对比了样品与模拟酒溶液中色谱峰的一维和二维保留时间,筛选一维时间偏差在4 s内(1个调制周期),二维时间偏差在0.1 s内的组分作为最终确认的鉴定结果。
将氘代己醇作为内标,按照内标法计算出所有鉴定组分在所有酒样中的相对含量。
采用Excel 2013计算风味物质在所有样品中的相对含量及其变化规律,采用Origin 2022、PowerPoint 2013和RStudio绘图。
2 结果与分析
2.1 蒸馏过程中酒精度的变化
蒸馏可以提取富集酿酒原料中的部分物质和酒醅中微生物的发酵产物,馏分主要是乙醇和水,亦有大量呈香呈味的风味物质馏出[2]。通过蒸馏,可以将酒醅中4%vol～6%vol左右的乙醇经过汽化、冷凝等步骤浓缩为70%vol左右酒精度的基酒。酒精是多种风味物质的重要载体,使易溶于酒精的风味物质被更多地蒸馏至基酒中,因此研究蒸馏过程中基酒酒精度的变化十分重要。由图1可以看出,第一个馏出的基酒酒精度为62.3%vol,随后29个样品的酒精度稳定在70%vol以上,其中最高的是第3个酒样,达到了78.5%vol。随着蒸馏时间的延长,基酒中酒精度逐渐下降,尤其在酒尾阶段,酒精度迅速下降至21.3%vol。
图1 浓香型白酒蒸馏过程中酒精度随时间的变化
Fig.1 Variation of alcohol content with time in the distillation process of Wuliangye base liquor
2.2 基酒的风味物质分析
伴随着酒精的蒸出,酒醅在发酵阶段积累的多种微量风味物质也会随蒸汽一起进入酒体。在蒸馏过程中,各种风味物质由于沸点和极性不同,在水和乙醇中的溶解度不同,会按不同的顺序蒸馏至基酒中,从而使得不同馏分中的风味组分各不相同,各有其独特的风味特点。
如图2所示,蒸馏过程中,不同馏分的色谱图存在显著差异。本研究采用一维极性色谱柱与二维中极性色谱柱的组合,不同种类的风味组分由于其化学性质的不同,在二维色谱图上会规律性地分布。图2中,酯类、醇类和酸类化合物呈现规律性分布,根据其色谱峰强度,可以直观地比较不同馏分中这些组分含量的差异。蒸馏4 min时,酯类化合物色谱峰的强度最高,尤其是浓香型白酒特征香气物质—己酸乙酯,同时酯类化合物的色谱峰数量也最多。醇类化合物(均为一元醇)在蒸馏0 min和4 min时的数量较少,在13、22、31、34 min时含量和数量有显著提升。酸类化合物的含量和数量在酒尾阶段显著提高,在此之前均较少。
图2 浓香型白酒蒸馏过程中不同馏分的GC×GC-TOFMS总离子流色谱图
Fig.2 Total ion chromatogram of different fractions in the distillation process of strong aroma type liquor
本研究在所有馏分中共鉴定出318种风味物质,根据风味物质与内标的响应比计算了各个馏分中所有准确鉴定组分的相对含量,并分析了这318个风味组分在不同馏分中含量的变化,远远超过已有研究中的数十种组分,如附件1所示。这些组分主要分为酯类(96种)、醇类(41种)、酸类(14种)、醛酮缩醛(73种)、呋喃(23种)、含氮化合物(8种)、含硫化合物(19种)、酚类(5种)、萜烯(5种)、内酯(5种)和芳香类物质(29种)。通过计算不同馏分酒样中这11类组分的总含量,解析了这11类组分在蒸馏过程中含量变化的规律,如图3所示。图3-a～图3-c酯类、醛酮缩醛和含硫化合物在蒸馏前期达到最高浓度,随后整体呈现下降趋势,归纳为图4-a中A趋势。图3-d、图3-e醇类和酚类物质在酒头中的含量较低,随着蒸馏的进行逐渐升高,在蒸馏中期达到最高,随后继续下降,归纳为图4-b中B趋势。图3-f、图3-g酸类和芳香类物质的含量随着蒸馏的进行一直升高,在酒尾阶段达到最高,归纳为图4-c中C趋势。图3-h～图3-j内酯、含氮化合物和萜烯在蒸馏前中期基本没有,在酒尾阶段突然出现且浓度较高,归纳为图4-d中D趋势。
a-酯类;b-醛酮缩醛;c-含硫化合物;d-醇类;e-酚类;f-酸类;g-芳香类;h-内酯;i-含氮化合物;j-萜烯;k-呋喃
图3 不同类别风味组分的总含量随蒸馏时间的变化情况
Fig.3 Changes of the total content of different flavor components with distillation time
a-趋势A;b-趋势B;c-趋势C;d-趋势D
图4 浓香型白酒蒸馏过程中风味组分含量变化的趋势
Fig.4 Variation trend of substance content in the distillation process of strong aroma type liquor
根据图3可总结得出4种变化趋势,如图4所示。趋势A,71种香气组分的含量在酒头达到最高,随后逐渐降低;趋势B,133种香气组分的含量随着蒸馏时间的增加而逐渐上升,在蒸馏中段达到最高,随后逐渐降低;趋势C,21种香气组分的含量随蒸馏过程逐渐上升;趋势D,93种香气组分在最后几个馏分中的含量迅速增加。
如图5-a所示,呈现趋势A的主要香气组分为酯类和醛酮缩醛类化合物,这两类物质在浓香型白酒中数量最多,包含了很多分子质量较小的香气组分,且极性较弱,更容易在乙醇水溶液中蒸馏出,因此在蒸馏前半段和中段中含量达到最高。大量的酯类化合物集中在酒头使酒头香气极其浓郁,主要为9个碳以下的酯,比如丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和其他一些支链酯,经长期贮存后可成为勾调白酒的上等原料。同时,酒头中较多的醛和含硫化合物会带给基酒不愉快的刺激味和新酒味,需要经过贮存方可使得新酒味减少、酒体趋向协调、酒味变得柔和[12]。呈现趋势B的主要香气成分是酯类、醛酮和醇类化合物。酯类除了壬酸乙酯和癸酸乙酯外,主要为8～11个碳的支链酯和不饱和酯。醇类化合物因为含有羟基,极性较强,在乙醇水溶液中较难蒸馏出,所以存在着含量逐渐增高的阶段。呈现趋势C的主要是芳香类和呋喃化合物,这两类化合物的分子质量较大,沸点较高,往往在蒸馏最后阶段含量达到最高。各类物质均有一部分呈现趋势D,都只在最后几个馏分中出现。比如一些分子质量较大的香气组分,如十二酸乙酯和十四酸乙酯,还有一些极性较强物质,如酸类化合物。
a-不同变化趋势中各类风味组分的分布情况;b-不同风味组分中4种变化趋势的分布情况
图5 不同变化趋势中各类风味组分的分布情况和不同风味组分中4种变化趋势的分布情况
Fig.5 Distribution of various flavor components in different trends and distribution of four trends in different components
如图5-b所示,酯类、醛酮缩醛和含硫化合物主要呈现趋势A和B,酸类、含氮化合物、酚类、萜烯、内酯和芳香类化合物主要呈现趋势D,这与图5-a一致。尤其是含氮化合物,全部呈现趋势D,包括2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪和四甲基吡嗪,主要都在酒尾阶段(即35、36、37号样品)出现。如图6所示,统计了不同趋势中风味物质的沸点,其中8个吡嗪的沸点在135～190 ℃,趋势D中的其他化合物的沸点普遍高于吡嗪。同时吡嗪是非极性或弱极性的化合物,因此在蒸馏过程中含量变化趋势应符合B或C。这说明蒸馏不只是分离风味组分与酒醅,这个过程还可能发生化学反应,比如蒸馏时糖和氨基酸可以发生美拉德反应,会生成吡嗪类化合物[13-14]。因此,本研究中,吡嗪的含量在酒尾迅速增加的原因可能是蒸馏过程中发生的美拉德反应生成了吡嗪类化合物。已有研究报道,随着蒸馏的进行,吡嗪类化合物的含量逐渐上升[15-16],此结论与本研究一致。吡嗪主要呈现炒坚果和烘烤的香气,是白酒中重要的香气物质,如表1所示;吡嗪同时也具有一定的生理活性和健康功效,例如四甲基吡嗪有助于心脏血管和脑血管疾病的治疗,2-甲基吡嗪具有抗氧化功能[14,17]。
表1 浓香型白酒蒸馏过程中主要在酒尾出现的化合物
Table 1 Compounds mainly appearing in the tail of strong aroma type liquor during the distillation process
注:RT1,一维色谱柱的保留时间;RT2,二维色谱柱的保留时间;相似度,样品中分析物质谱与NIST库中质谱的匹配值;LRIcal,计算的线性保留指数;LRIlit,来自NIST Chemistry WebBook数据库中线性保留指数;香气描述来自于http://www.flavornet.org/index.html。
名称 CAS号 相似度RT1/sRT2/sLRIcalLRIlit分子式 香气描述2-甲基吡嗪109-08-08941 0470.971 270.71 271C5H6N2爆米花2,6-二甲基吡嗪108-50-98571 1702.581 330.21 320C6H8N2烤坚果2,5-二甲基吡嗪123-32-08241 1732.681 331.71 333C6H8N2烤坚果2-乙基-6-甲基吡嗪13925-03-68711 2931.231 389.71 395C7H10N2果香2,3,5-三甲基吡嗪14667-55-18801 3291.191 407.51 421C7H10N2烘烤香3-乙基-2,5-甲基吡嗪13360-65-18211 4431.31 465.41 458C8H12N2烤土豆2,3-二甲基-5-乙基吡嗪15707-34-38431 4431.31 465.41 460C8H12N2烘烤香四甲基吡嗪1124-11-48531 4671.281 477.61 472C8H12N2烘烤香愈创木酚90-05-18332 1390.831 872.21 871C7H8O2烟熏味4-甲基愈创木酚93-51-68252 2740.931 9731 970C8H10O2烟熏味邻甲酚95-48-78902 3310.832 0071 996C7H8O药水味2-乙基苯酚90-00-68562 5500.842 078.42 075C8H10O霉味顺-芳樟醇氧化物5989-33-38291 4041.121 445.61 454C10H18O2花香异佛尔酮78-59-18861 7011.21 601.71 600C9H14O樟脑味α-松油醇98-55-58541 8781.11 703.41 700C10H18O薄荷味大马酮23696-85-78542 0821.221 832.51 830C13H18O苹果丙位己内酯695-06-78761 8991.021 716.21 703C6H10O2坚果香丙位庚内酯105-21-58391 9971.051 785.61 784C7H12O2坚果香丙位辛内酯104-50-78642 2231.071 934.11 924C8H14O2椰子味丙位壬内酯104-61-08422 37012 019.82 025C9H16O2椰子味
图6 不同含量变化趋势中香气组分的沸点(标准大气压)
Fig.6 Boiling points of aroma components in different trends (standard atmospheric pressure)
酚类、萜烯和内酯的沸点均较高,与其他趋势D中化合物的沸点一致(图6)。表1显示了符合趋势D的含氮化合物、酚类、萜烯和内酯的信息,这四类物质都是白酒中具有重要香气贡献的化合物,酚类主要呈现烟熏味和药水味,内酯主要呈现坚果香和椰子味,萜烯的香气类型不一致。
3 结论
本研究首次采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析了浓香型白酒蒸馏过程中37个酒样的挥发性组分,计算了鉴定出的318种组分的含量并解析了这些组分在不同馏分中含量的变化情况。研究发现在蒸馏过程中,各类物质呈现出不同的变化规律。酯类、醛酮缩醛和含硫化合物在蒸馏前期达到最高浓度,随后整体呈现下降趋势。醇类和酚类物质在酒头中的含量较低,随着蒸馏的进行逐渐升高,在蒸馏中期达到最高浓度,随后继续下降。酸类和芳香类物质的含量随着蒸馏的进行一直在升高,在酒尾阶段达到最高。内酯、含氮化合物和萜烯在蒸馏前中期基本没有,在酒尾阶段突然出现且浓度较高。将吡嗪类物质的馏出规律、沸点等物理化学性质与其他组分相比,证实了酒样中的吡嗪类化合物是蒸馏过程中通过美拉德反应生成的。掌握白酒蒸馏过程中风味物质的变化规律,在酿造中根据蒸馏时间以及乙醇浓度适时摘酒,对提高白酒品质有着重要意义。
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