酶降解法制备低分子质量岩藻聚糖的研究进展

岩藻聚糖(fucoidan,FUC)是一种主要由硫酸酯化修饰的岩藻糖组成的多糖[1]。FUC除含有岩藻糖外,其还可能含有D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖以及糖醛酸[2]。FUC主要存在于褐藻和一些海洋来源的无脊椎动物[3]。FUC的结构随其来源物种、采收季节、采集地点和成熟度而发生变化[4]。根据FUC中岩藻糖的连接方式可将其分为两大类:即由(1→3)-α-L-吡喃岩藻糖基组成的FUC和由(1→3)-和(1→4)-α-L-吡喃岩藻糖基交替连接构成的FUC。按分子质量大小可将FUC分为:分子质量<10 kDa的低分子质量FUC(low-molecular weight fucoidan,LMWF)、分子质量介于10～10 000 kDa的中分子质量FUC以及分子质量> 10 000 kDa的高分子质量FUC[5-6]。据报道,FUC的生物活性与其分子质量和结构密切相关。分子质量较大的FUC因其黏度大,渗透性较差,不容易被人体吸收利用,导致其应用受到限制[7]。因此,将FUC降解为分子质量低、易于吸收的LMWF对拓展FUC的应用具有十分重要的意义。目前,LMWF制备工艺的滞后导致其利用程度较低。常用的FUC降解方法可分为生物降解法、物理降解法和化学降解法。生物降解法通常是指酶水解法,物理降解法包括超声波降解法和有机溶剂沉淀法,化学降解法主要包括酸降解法、H2O2降解法和自由基降解法[8]。物理降解法产率较低,目前多用于实验室研究;化学降解法可导致硫酸根基团脱落,从而影响LMWF的生物活性。相比较而言,酶降解法具有选择性好、反应条件温和、副产物少、降解产物LMWF的分子质量均一度好、硫酸基团的保留率高和易于批量制备等优点。因此采用酶降解技术来获取LMWF具有较好的转化应用前景[7,9]。本文从FUC降解酶的来源、分类和制备以及LMWF的制备工艺及生物活性等方面展开综述,为酶降解法制备LMWF及其在食品和药品领域的应用开发提供参考。

1 FUC降解酶的分类及来源

1959年,Nature杂志的一篇研究论文首次报道了FUC降解酶。在该论文中,研究者们从海洋细菌Pseudomonas atlantica和Pseudomonas carrageenovora中分离出一种具有降解FUC活性的酶,并将其命名为“fucoidanase”,即岩藻聚糖酶[10]。随着研究的不断深入,国内外研究者陆续发现多个FUC降解酶并将这些酶归为三类:岩藻聚糖酶、α-L-岩藻糖苷酶和硫酸酯酶[11]。

1.1 岩藻聚糖酶

岩藻聚糖酶是一种具有高特异性和催化活性的酶[11],其来源比较广泛,涉及海洋动物、海洋细菌、海洋真菌以及淡水微生物等。据报道,可产生岩藻聚糖酶的细菌有交替单胞菌科(Alteromonadaceae)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)[12]、黄杆菌科细菌(Flavobacteriaceae)[13-14]、亚特兰蒂斯假单胞菌(P.atlantica)、卡氏假单胞菌(P.carrageenova)[10]、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)[15]、褐藻文英庄菌(Wenyingzhuangia fucanilytica)[16-17]、多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)[18-19]、海科贝特氏菌(Cobetia amphilecti)[20]、福尔摩沙鲍菌(Formosa haliotis)[21]、昆布海藻鼠尾菌(Muricauda eckloniae)[22]、镰刀菌属菌株(Fusarium sp.)LD-8[23]、海沙中分离获得的弧菌属菌株(Vibrio sp.)N-5[24]、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株H-TP2[25]、交替单胞菌科SN-1009和黄杆菌科菌株SW5[26,27-28]、褐藻来源的柠檬假单胞菌菌株KMM 3296和KMM 3298、海参来源的菌株3297和SI-1234[29-30]、黄杆菌科细菌CZ1127[31]。可产生岩藻聚糖酶的真菌主要有曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和毛霉属(Mucor)等[32]。WU等[33]从真菌Dendryphiella arenaria TM94中得到一种内切岩藻聚糖酶。淡水微生物,如Pseudomona fluoreslen HNT O1,也可以产生岩藻聚糖酶[34]。此外,一些海洋软体动物也是岩藻聚糖酶的一个重要来源,例如从F.haliotis[35]和Haliotis gigantea[36]的肠道中分离的岩藻聚糖酶;Patinopecten yessoensis和Littorina kurila的消化系统也能分泌岩藻聚糖酶[37]。最近,有研究者从褐藻黄杆菌12076中发现了一种新型α(1→4)-L-岩藻聚糖内切酶OUC-FaFcn1[38]。不同来源酶作用方式及底物详见表1。

1.2 α-L-岩藻糖苷酶

α-L-岩藻糖苷酶是一种普遍存在于生物体内的外切糖苷酶[39],该酶具有将L-岩藻糖苷残基从糖链的非还原末端切除的功能[40-41]。研究显示,α-L-岩藻糖苷酶具有水解岩藻聚糖中α(1→6)、α(1→3)、α(1→4)和α(1→2)岩藻糖基的能力[42]。目前获得的α-L-岩藻糖苷酶主要来源于海洋无脊椎动物、海洋细菌和海洋真菌[11]。从扇贝Pecten maximus消化腺中提取的酶具有降解α-L-岩藻聚糖的活性[43];从栖热菌属菌株(Thermus sp.)Y5中提取出的一种可以降解岩藻聚糖的酶,经鉴定为α-L-岩藻糖苷酶[42]。此外,采用L-岩藻糖诱导法可获得α-L-岩藻糖苷酶。例如,尖芽孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的α-L-岩藻糖苷酶是一种典型的诱导型糖苷酶[44]。目前,转录技术亦被应用于制备α-L-岩藻糖苷酶。例如,采用该技术已从W.fucanilytica中分离纯化出种α-L-岩藻糖苷酶Alf1 Wf[45]。

1.3 硫酸酯酶

硫酸酯酶是生物体内参与硫酸酯代谢的一种酶,主要通过FUC的α(1→3)和α(1→4)连接的岩藻糖残基发生选择性脱硫,从而使聚糖发生裂解[40]。基于氨基酸序列,可将硫酸酯酶分为4个族:将甲酰甘氨酸依赖性硫酸酯酶归为硫酸酯酶的家族1,称为S1家族;将来自假单胞菌Pseudomonas putida的烷基硫酸酯酶AtsK的同系物归为S2家族;将来自P.aeruginosa PAO1的烷基硫酸酯酶SdsA1归为S3家族;将来自P.carrageenovora 9T的芳基硫酸酯酶AtsA归为S4家族[46]。有研究者从海洋细菌W.fucanilytica CZ1127T中分离鉴定了2种FUC酶SWF1和SWF4,这2种酶分别隶属于S1硫酸酯酶家族的S1-17和S1-25亚家族[47]。迄今为止已经描述了2种热稳定硫酸酯酶,分别为来自P.aeruginosa的Atsa,其最适温度为57 ℃;以及来自Flammeovirga pacifica的Ary 423,其最适温度为40 ℃[48]。目前,有关硫酸酯酶的研究报道较少。该类型的酶主要来源于海洋无脊椎动物和细菌,已从菌株Vibro sp.N-5和无脊椎动物扇贝Pecten maximus中分离得到硫酸酯酶[24,43]。王春霞等[49]从海洋中分离筛选得到的细菌Flavobacteriaceae sp. CZ1127以海参岩藻聚糖硫酸酯为碳源经过培养发酵后产生硫酸酯酶。

2 酶的制备

在广阔的海洋中,存在着大量种类繁多的微生物,通过诱导培养结合提取分离技术可以得到不同的岩藻聚糖酶类,包括岩藻聚糖酶、α-L-岩藻糖苷酶和硫酸酯酶。研究显示,影响酶性质差异的因素包括酶的来源、底物的来源、纯化酶的方法、酶的分子质量、以及影响酶促反应的温度、酸碱度和某些金属离子等。酶的纯度直接影响其生物活性,在酶的制备过程中需要充分考虑和优化上述因素,以确保酶的活力和稳定性。

2.1 岩藻聚糖酶的制备

岩藻聚糖酶是一种具有独特生物活性的酶,其在自然界中的来源相当广泛。目前,海洋微生物是岩藻聚糖酶的主要来源。产酶菌株的一般筛选过程如下:将含菌样本利用特定的培养条件进行粗筛获得杂聚菌群;将杂聚菌群进行稀释培养结合挑菌筛选技术,获得单独的菌株;将单独的菌株采用FUC作为唯一碳源进行诱导,发现能够降解FUC的特异菌株。张袁[50]运用稀释平板法从我国厦门海域采集的生物样品中成功分离出了129株海洋真菌。在FUC作为唯一碳源的条件下,筛选出了28株可产生岩藻聚糖酶的菌株;其中,菌株PZ322生产岩藻聚糖酶的产量出众,酶活力达3.83 IU/mL,且该菌株产酶的性能稳定,展现出较好的转化应用潜力。陈惠源等[18]将纯化的S.multivorum菌株于28 ℃培养16 h,将培养液于4 ℃下5 000 r/min离心30 min,可获得酶活力为130 U的粗酶。为了获得高纯度的岩藻聚糖酶,通常需要系统的分离纯化。首先,通过化学沉淀法,可将培养液中的酶与其他杂质进行初步分离。接下来,将粗酶上样分子排阻层析柱分离,可以获得高纯度的岩藻聚糖酶。赵先朋等[51]将假海源菌株ZJCN121采用液态发酵培养,粗酶液经丙酮沉淀后再行葡聚糖凝胶(SephadexG-100)层析柱分离纯化,获得相对分子质量为60.2 kDa的岩藻聚糖酶,该酶的最适反应温度为50 ℃,最适pH值为6.5。另有研究者将镰刀菌属菌株LD-8通过固态发酵后,结合丙酮沉淀和Sephadex G-100柱层析获得分子质量为6.4 kDa的岩藻聚糖酶;该菌株产生岩藻聚糖酶的最佳培养时间为48 h,最适温度为60 ℃,最适pH为6.0[52]。此外,有报道采用硫酸铵分级沉淀法从少动鞘氨醇单胞菌PF-1中纯化出一种FUC降解酶;经Somogyi-Nelson法测量酶活力,发现其酶活力的最适温度为30 ℃,最适pH值为5～6[19]。

除了从培养液中获取岩藻聚糖酶,研究者亦可直接采用超声破碎的方式从菌株细胞中获取粗酶,用于后续实验。鲁勇等[53]将黄杆菌菌株RC2-3 mut在30～35 ℃的液体基中发酵培养24～72 h,离心取细胞沉淀,在冰浴保护下超声破碎细胞,离心取上清液即得含岩藻聚糖酶的提取液;该酶的最适pH值为9.5,最适温度为60 ℃。吴茜茜等[23]将Vibrio sp.N-5菌株采用含FUC的培养基中25 ℃下培养3 d,离心收集细胞,用2%的NaCl溶液洗涤后,在pH值为6.0的乙酸钠缓冲液中超声波破碎细胞,即可获得含岩藻聚糖酶的粗酶液,该酶最适温度为40 ℃,最适pH值为6.0。某研究团队将从海泥中分离到的菌株HN-25对其进行紫外诱变,采用超声波法提取结合分离纯化可得分子质量为35 kDa的岩藻聚糖酶;该酶在30 ℃,且pH值为8.0的条件下,酶活力最高且稳定性最佳[20]。王凤舞等[54]将活化后的产酶菌MD3接种于含有0.2%的FUC的培养基中,于25 ℃下180 r/min恒温水浴振荡培养12 h;再按体积分数10%接入产酶培养基中,于25 ℃下150 r/min培养48 h,以10 000 r/min冷冻离心收集菌体细胞,冻存后复溶,超声破碎并冷冻离心,上清液即为粗酶液。

基因工程法是利用生物体的遗传信息,通过基因克隆和过表达的技术,将编码基因导入到适当的宿主细胞中,使其表达并产生大量的酶。这种方法具有高效、快速、低成本等优点,其工业化应用前景广阔。QIU等[38]将岩藻聚糖酶OUC-FaFcn1的基因转入pET-28a(+)质粒,然后再将其导入重组大肠杆菌BL21(DE3)中;在ZYP-5052培养基中培养48 h,离心,洗涤,重悬,超声破碎细胞,再离心取上清液得到岩藻聚糖酶粗酶液;最后,采用Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化粗酶液获得分子质量为110 kDa左右的岩藻聚糖酶OUC-FaFcn 1;该酶在40 ℃、pH值为9.0时的活力最佳。有研究者从福尔摩沙藻类中鉴定并克隆了岩藻聚糖酶FFA 1的编码基因,将其导入大肠杆菌中制造蛋白酶;再通过HisTrap柱纯化、Bio-Scale微型柱脱盐、Mono Q柱和Sephacryl S-200柱纯化,收集具有FUC酶活力的组分,并利用SDS-PAGE得到分子质量为111 kDa的内切酶FFA 1;该酶的最适pH值为6.5～8,在Ca2+、Ba2+、Mg2+和Mn2+离子存在下具有良好的活力[55]。SHEN等[17]提取了W.fucanilytica CZ1127的基因组DNA,通过PCR扩增后插入pET-28a(+)载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中;将成功的细胞在37 ℃培养后收集,并在NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中超声破碎;最终得到纯化后的酶FunA;该酶的表观分子质量为48.0 kDa,其在40 ℃、pH值8.0时活力最强;此酶选择性内切C2位硫酸化和非硫酸化岩藻糖残基之间的α-(1→3)-糖苷键。除了从海洋样本中筛选获得产生岩藻聚糖酶的菌株外,研究者亦可从食物共生菌中寻找此类菌株。王聪聪等[56]从酒曲中获取的菌株WA1207,以岩藻多糖为唯一碳源进行发酵培养,离心获得的上清液即为含有岩藻聚糖酶的粗酶液,该酶的活力为0.414 U/mL;通过正交试验得出,最佳酶解温度为55 ℃、最适pH为6.0,最佳酶解时间为24 h。

2.2 α-L-岩藻糖苷酶的制备

α-L-岩藻糖苷酶在生物体内具有重要的作用,其参与多种生物化学反应。目前,有关α-L-岩藻糖苷酶制备方面的报道主要涉及化学沉淀法和柱层析法。DANIEL等[43]通过硫酸铵分级沉淀法从扇贝P.maximus消化腺中获得一种α-L-岩藻糖苷酶,其最适温度为50 ℃、最适pH值为5.5。DONG等[45]使用岩藻聚糖作为唯一碳源对W.fucanilytica菌株进行培养,离心取沉淀,在pH 8.0 Tris-HCl缓冲液中超声破碎,使用HiTrap′ M QFF、MonoQTM 5/50 GL、SuperdexTM 200 10/300 GL色谱柱进行纯化,将最终纯化的蛋白质脱盐后进行SDS-PAGE分析,结果显示表观分子质量为68.1 kDa,经实验证实为α-L-岩藻糖苷酶。有研究者使用嗜热菌株Y5,在48 ℃孵育12 h后,通过LB(Luria-Bertani)平板3次传代进而纯化该产酶菌株;纯化后的菌株采用含有3%的酿酒酵母破碎细胞壁悬浮液和适量矿物盐组成的培养基,于45 ℃振荡培养16 h;然后,在通风环境下,于45 ℃、700 r/min发酵培养2 d获得粗酶液;将粗酶液再经过多个色谱柱纯化,包括DEAE Toypearl柱、DEAE 5 PW柱、Mono Q HR 5/5色谱柱、L-岩藻糖胺-琼脂糖亲和柱及Phenyl Superose HR 5/5色谱柱,最终得到高纯度的酶。该酶的分子质量约为61.0 kDa,活力为10 U/mg,并在37 ℃、pH 5.5～7.5下保持稳定;同时可以切割多种类型的L-岩藻糖苷键,具有广泛的糖苷配基特异性[42]。多种层析柱联合纯化法虽然具有高度的可控性和准确性,但其纯化过程复杂,成本较高,在一定程度上限制了其实际应用。

2.3 硫酸酯酶的制备

据报道,硫酸酯酶可以从产酶菌株中直接提取获得[23]。吴茜茜等[23]将Vibrio sp.N-5菌株采用含FUC的培养基于25 ℃培养3 d,离心收集细胞;用2%的NaCl溶液洗涤后,在pH 6.0的乙酸钠缓冲液中超声波破碎细胞,得到硫酸酯酶;该酶最适温度为40 ℃,最适pH值为7.5。有研究利用基因工程法制备硫酸酯酶。MIKKELSEN等[48]将来源于菌株W.fucanilytica 中的SWF1和SWF4基因分别组装到pet-22b(+)质粒中,然后将重组质粒导入到大肠杆菌中培养,再经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养;离心收集细胞,超声破碎,所得粗酶液经HisTrap HP柱和Biolodic LP System进行纯化;最终得到SWF1和SWF4基因分别对应的分子质量为55.94和57.08 kDa的硫酸酯酶;2种酶在pH 7.8～8.4时具有最佳活力,但温度为40～45 ℃时SWF1对应的酶活力最强,而30～35 ℃时SWF4活力最强。王春霞等[49]筛选出一株产硫酸酯酶的菌株Flavobacteriaceae sp. CZ1127;以海参岩藻聚糖硫酸酯为唯一碳源,发现培养时间48 h、pH值7.0、且温度25 ℃时该菌株产酶能力最高达22.88 U/mL。

3 LMWF制备工艺

酶降解法利用酶的生物催化特性,通过精确调控反应条件,如温度、pH值和底物浓度,来实现对目标产物的制备。曹声生等[57]将适量的岩藻聚糖内切酶和20 g海带Laminaria japonicia来源的FUC加入到2L去离子水中,30 ℃水解48 h,加热到100 ℃终止反应,反应得到的寡糖混合物主要包括单硫酸化的岩藻糖及岩藻寡糖,分子质量为243～1 133 Da。为了提高制备效率,可以借助超滤系统对降解产物进行分离。HWANG等[58]将5 g来源于半叶马尾藻的FUC溶解在125 mL蒸馏水中,向混合物中加入质量浓度为1 mg/g的岩藻聚糖酶,在55 ℃下连续水解6 h;最终通过超滤系统分离获得分子质量为1～30 kDa和<1 kDa的2个组分,产率分别为8.7%和91.3%。有研究者将1 mL从海带来源Flavobacteriaceae RC 2-3菌株中获得的岩藻聚糖酶(500 U/mL)与1 mL 5 g/L纯化后的FUC混合,然后在37 ℃下孵化不同时间在100 ℃下加热10 min终止反应,离心收集上清液得到酶消化产物,然后通过Vivaflow小型超滤系统对酶水解产物进行分级获得5个组分,包括<5 kDa、5～10 kDa、10～30 kDa和>50 kDa的组分。不同降解时间的研究结果表明:降解2 h后,分子质量<2 kDa的FUC比例增加到53.7%,平均分子质量从819 kDa下降到4.3 kDa;降解10 h后,FUC分子质量<2 kDa的占比达96.3%,平均分子质量进一步降低至1.5 kDa[59]。超滤系统不仅可以提高产物的纯度和分离效率,还可以减少样品后续处理的工作量,有利用工业化生产应用。

乙醇分级沉淀法是以乙醇作为沉淀剂,通过改变溶液的极性使不同分子质量的溶质因溶解度差异而实现分离的手段;该法是一种高效且常用的分离不同分子质量FUC的实验技术。CHMES等[35]将800 mg来源于墨角藻的FUC与50 mg/L的岩藻聚糖酶Fhf 1加入浓度为10 mmol/L且pH值8的Tris-HCl中,于37 ℃下反应24 h后,于80 ℃加热10 min终止反应,离心除蛋白;将反应产物加入终体积分数为75%的乙醇进行沉淀,于4 ℃下离心15 min将高分子质量产物(沉淀)与LMWF(上清液)分离;将LWMF采用HPLC排阻色谱检测,发现其分子质量约为2 kDa。将1 g来自霍氏马尾藻的FUC溶于98 mL缓冲液中,并加入2 mL的0.1 mg/mL岩藻聚酶FFA1,在34 ℃下反应72 h,然后加热到80 ℃灭活,并离心除蛋白沉淀;再用乙醇沉淀法去除高分子质量FUC,LMWF的上清液经GE Healthcare柱分离,得到主链由重复的[→3-α-L-Fucp(2SO3-)-1→4-α-L-Fucp(2,3SO3-)-1→]片段以及[→3-α-L-Fucp(2,4SO3-)-1→]片段连接而成的LMWF;这些LMWF的侧链由(α-L-Fucp-1→2-α-L-Fucp-1→)构成,并通过C4位连接到主链[55]。将来源于Fucus evanescens的FUC采用海洋细菌KMM 3553T的重组酶FFA 2在34 ℃下水解72 h,80 ℃加热将酶灭活并离心除蛋白;采用乙醇沉淀法获得LMWF的产量为43%;进一步脱盐获得聚合度为4～16的LMWF[60]。将来源于裙带菜的FUC与岩藻聚糖酶液按1∶1混合,在30 ℃、pH 5.6条件下水浴振荡反应72 h,煮沸10 min终止反应并离心除蛋白;上清液用95%的乙醇沉淀,最终获得分子质量为1.4～3.7 kDa的LMWF[19]。

利用先进的分析仪器,如质谱仪、核磁共振仪等,对降解产物进行深入分析,不仅能够精确地鉴定产物的结构,也可以全面地了解降解过程中的化学变化。SHEN等[17]将1 U酶液与50 mL 海参Isostichopus badionotus来源的FUC溶液(2 mg/mL,pH=8.0)在25 ℃下孵育,在反应期间每隔一段时间取样,反应12 h后,补加1 U酶,继续孵育12 h,得到分子质量约为1.8 kDa由8个硫酸酯基团修饰的八糖和分子质量约为0.9 kDa由4个硫酸酯基团修饰的四糖。将来源于褐藻Ascophyllum nodosum的FUC(1 mg/mL)加入5%(体积分数)的岩藻聚糖酶提取物,在30 ℃、pH值5.5醋酸盐缓冲液中轻微搅拌反应数天,通过HPLC法配合脉冲安培检测器分析降解产物,结果显示在反应过程中FUC的表观分子质量从25 kDa降低到约3 kDa[43]。YU等[61]将来源于Acaudina molpadioides海参的FUC溶于20 mmol/L的Tris-HCl(pH=7.2)溶液中,按照1 000∶1的比例加入CZ1127岩藻聚糖酶,于25 ℃下反应8 h,通过Carbograph SPE柱水洗涤除盐后,采用高效液相色谱串联质谱检测发现降解产物含有二硫酸化三聚岩藻寡糖、二硫酸化四聚岩藻寡糖、四硫酸化七聚岩藻寡糖和四硫酸化八聚岩藻寡糖。另有研究者将含有岩藻聚糖酶OUC-FaFcn 1和2 mg/mL的FUC溶液混合,在40 ℃下孵育并在0～48 h内间隔取样,并通过酶底物特异性实验联合HPLC分析发现OUC-FaFcn 1是一种仅作用于α-(1→4)-岩藻糖苷键的FUC内切酶[38]。这种深入的分析不仅有助于优化降解过程、提高产物的纯度和产率,还可为相关酶在工业生产领域的应用提供理论支撑。

4 LMWF生物活性

相较于大分子质量的FUC,通过酶降解法获得的LMWF因其黏度变小、渗透性变好而更利于机体吸收,作为功能性食品和药品方面的应用更具优势。近年的研究发现:LMWF具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗凝等生物活性,展现出良好应用前景。

4.1 抗癌活性

尽管医学界在癌症研究和治疗方面取得了显著进展,但癌症的发病率和死亡率仍居高不下,严重威胁人类健康。此外,目前的化学类抗癌药物对脑及心脏等器官具有一定的作用。因此,国内外专家越来越关注天然产物来源的抗癌药物。近年来的研究表明LMWF具有良好的抗癌活性;且其活性与LMWF的结构、分子质量等方面密切相关。SENTHILKUMAR等[5]利用酶解法从褐藻中提取的平均分子质量为0.8 kDa 的LMWF具有更好的抗癌作用;上述LMWF对多种癌细胞的生长具有显著的抑制活性,这些癌细胞包括宫颈腺癌细胞、纤维肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、肺腺癌细胞和白血病细胞。有研究人员证实LMWF能够提升正常肝细胞的活力,同时抑制多种肝癌细胞的生长[62]。在临床实验中,LMWF给药可改善局部晚期直肠癌患者的生活质量[63]。LMWF作为一种辅助剂,可以增强氟尿嘧啶抑制结肠癌细胞存活和迁移的能力,进而提高以氟尿嘧啶为基础的化疗方案对野生型和突变型Kirsten大鼠结直肠癌的疗效[64]。与单独使用奥拉帕尼相比,LMWF联合奥拉帕尼治疗能够进一步降低肿瘤复发和肺转移的发生率;同时,LMWF联合奥拉帕尼治疗能够降低肿瘤内M2巨噬细胞的数量,并增加CD8+细胞的数量,从而改善抗肿瘤免疫应答[65]。采用天然FUC或LMWF处理淋巴母细胞和弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞,发现LMWF对正常的B细胞和T细胞无毒性,可以抑制细胞增殖并促进细胞凋亡;此外,LMWF抑制PD-L1表达的效果更佳[66]。近年来的研究表明,FUC的抗肿瘤活性与L-岩藻糖的含量、硫酸根含量和分子质量有关;其中,分子质量较低且硫酸根和岩藻糖含量较高的LMWF对人肝癌细胞的抑制作用最佳[67]。但也有研究者持相反的观点,认为FUC比LMWF具有更佳的抗癌效果。有研究表明,来自霍氏链霉菌的FUC及其高分子质量产物均对结直肠癌细胞DLD-1的集落形成具有显著的抑制作用,而聚合度4～10的寡聚糖对癌症细胞集落生成的抑制作用较弱;该研究团队认为FUC的聚合度明显影响其抗肿瘤作用,低聚合度寡糖可能不易与肿瘤细胞有效互作[55]。但是,该体外实验的结果并未采用体内实验进行验证。深入探索LMWF在临床治疗中的应用价值是将来的研究重点。

4.2 抗氧化活性

抗氧化剂,作为一类能够中和或稳定自由基的化合物,在维护细胞稳态和预防慢性疾病方面发挥着至关重要的作用。相较于FUC,LMWF的抗氧化活性更为突出。CHEN等[59]通过酶降解来源于Laminaria japonica的FUC获得的LMWF(5～10 kDa),与未降解的FUC相比,可显著增加对酪氨酸酶和黑色素生成的抑制作用,并增强DPPH自由基的清除能力。在小鼠模型中,来源于F.vesiculosus的FUC通过其抗氧化功能剂量依赖性增强小鼠造血细胞的活力和存活率[68]。HWANG等[58]的研究表明,分子质量<10 kDa的LMWF清除羟自由基和总氧自由基的能力均明显高于未降解的FUC。

4.3 抗炎、抗病毒活性

炎症是对感染、抗原攻击或组织损伤的反应,旨在根除微生物或刺激物并加强组织修复。然而,过度的炎症可能导致组织损伤,并且如果严重的话,可能导致器官功能障碍和死亡。有研究人员通过体内、体外实验证明了LMWF可以抑制中性粒细胞的迁移,并减少细胞释放的微粒数量,从而起到抗炎功效[69]。JAYASINGHE等[70]从可食用的棕色海藻Sargassum siliquastrum中分离的LMWF对RAW 264.7巨噬细胞中脂多糖刺激的炎症反应具保护作用。病毒感染已成为全球性的健康威胁,对人类身体健康造成了严重危害。来源于F.evanescens的天然FUC及其酶法制备的高分子量和低分子量组分,对汉滩正汉坦病毒(Hantaan orthohantavirus)感染Vero细胞的不同阶段具有抑制作用。与天然FUC和高分子量组分相比,低分子量组分显示出更强的杀病毒效果[60]。海带FUC在解聚前无抑菌活性,但其解聚产物能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,展现出良好的抗菌活性[71]。

4.4 抗凝活性

聂小伟等[9]的研究表明,海带来源分子质量为21～24 kDa的FUC具有抗凝血活性,分子质量为8 kDa时抗凝活性最强。通过活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)和凝血酶时间(thrombin time,TT)检测LMWF的抗凝活性。LMWF以剂量依赖的方式显著延长APTT及TT。在LMWF高达200 μg/mL的质量浓度下,没有观察到PT的显著延长,这表明寡糖不会抑制凝血的外源途径。结果表明,寡糖可能通过不同的机制发挥其抗凝活性[56]。CHEN等[72]比较了海带中2种低分子质量、不同硫酸盐含量的FUC组分的抗血栓和抗血小板作用,试验结果表明2种LMWF组分在FeCl3诱导的动脉血栓形成中均表现出良好的抗血栓活性,静脉注射LMWF 显著抑制了动脉血栓形成和血栓素B2的水平,并升高了内皮细胞表达的6-酮-前列腺素F1α水平,表明其可抑制血小板的活化和聚集。LMWF在体内显示出抗凝剂、抗聚集剂和抗血栓作用之间的相关性。

4.5 其他活性

有研究表明从藻类中提取出的低分子质量、高硫酸盐含量的FUC具有较好的降血糖作用,并认为糖苷键为(1→3)-和(1→4)-交替连接构成的LMWF显示出更强的降血糖作用[73]。在糖尿病小鼠中,分子质量<5 kDa的LMWF比分子质量为5～30 kDa裙带菜孢子叶来源的FUC展现出更好的降血糖活性[74]。WU等[75]对LMWF抗肺纤维化和抗上皮-间质转化的生物活性进行了比对研究,发现LMWF可通过下调炎症信号通路,抑制转化生长因子-β1诱导的上皮间质转化进程,证明LMWF可以通过减弱炎症和上皮间质转化进程来抵抗肺纤维化。WANG等[76]采用高糖高脂饮食结合链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病模型,证明LMWF可以通过调节脂质代谢调节因子的表达水平,抑制肾纤维化的进程。此外,LMWF在体外可以促进树突状细胞的成熟和迁移以及CD4+和CD8+T细胞的增殖,进而实现其免疫增强功能[77]。

5 展望

FUC作为一种天然的生物活性物质,具有多种生物活性,而基于FUC降解获得的LMWF具有更佳的生物功能。酶降解法以其对特定底物的高度选择性而倍受关注,其能够在温和且特定的条件下有效生产所需的LMWF,且具有反应效率高和环保无污染等优点,展现出在工业化生产中应用的潜力。近年来,研究者对FUC降解酶及其在制备LMWF中的应用进行了深入研究。国内的研究主要集中于酶的筛选和优化反应条件等方面,而国外则更注重于酶的结构与功能关系的研究。岩藻聚糖降解酶可以通过多种途径获取,主要包括海洋微生物和海洋动物。丰富的来源为岩藻聚糖酶的研究和应用提供了良好的物质基础。通过深入研究来源,可以更好地了解岩藻聚糖降解酶的生物活性和应用潜力,为未来的科学研究和实践应用提供有力支持。

虽然国内外的研究均已取得了一定的进展,但是也存在一些问题,如酶的稳定性不佳和反应效率低等。此外,LMWF中糖苷键的连接位置不同,其生物活性也不尽相同,而岩藻聚糖内切酶具有降解特异性糖苷键的特点。因此,寻找更多的可以降解FUC的酶依然是国内外研究酶法制备LMWF的热点。随着酶工程技术的不断发展,酶法制备LMWF的研究将更加深入。未来将有更多的新型酶被发现和应用,进一步提高酶法降解制备LMWF的效率和产率。同时,应该进一步阐明酶的结构与功能的关系,为酶法制备LMWF提供更加科学的技术支撑。

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