鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)是一种引起食源性疾病的常见致病菌,能通过多种途径侵入人体,尤其是通过受污染的食物或水源进行传播,主要来源于肉品、畜脏、牛乳和蛋类等食物。沙门氏菌感染中鼠伤寒沙门氏菌的感染发病率最高,对于鼠伤寒沙门氏菌的常用治疗方法为抗生素疗法,但抗生素的使用会不可避免地诱导细菌产生耐药性,从而导致耐多重抗生素的病原体出现。因此,目前迫切需要新的策略既可保护宿主免受致病菌侵害,同时不增加耐药性的发展。
群体感应(quorum sensing, QS)是一种细胞间的通讯工具,通过产生和释放信号分子与受体结合,诱导下游信号通路,从而调节细胞代谢过程。细菌通过QS感知所处环境中细菌种群的密度、物种组成及环境信号,进行适应性调整基因表达来更好地适应环境变化。QS被细菌病原体用来协调多种生理过程,如生物被膜的形成、调控毒力因子的表达、次级代谢产物的产生以及其他微生物之间的相互作用[1]。目前对于群体感应的研究主要分为两类,一是研究群体感应系统的机制,关注革兰氏阳性菌和阴性菌中不同信号分子的合成与作用[2]。二是关注特定类型的群体感应干扰策略,比如说只关注群体感应抑制剂或群体感应淬灭(quorum quenching, QQ)[3]。群体感应干扰是控制细菌感染的有效策略,这种策略不是直接杀死细菌,而是在不影响细菌生存的情况下阻止多种毒力因子的表达,使细菌毒力降低,抑制运动性以及生物被膜形成的能力,使细菌更容易受到宿主免疫反应影响[4]。当前研究中,群体感应干扰策略目前大致分为三类:干扰QS信号分子的合成;干扰QS信号分子的胞外运输与反应;干扰QS信号分子与受体的结合。
对于群体感应的研究往往集中于绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等常见的典型细菌上。考虑到鼠伤寒沙门氏菌的耐药性问题以及对鼠伤寒沙门氏菌的QS研究日益增多,本文以鼠伤寒沙门氏菌的多种QS系统为基础,对群体感应的不同干扰策略进行梳理和分析,以期对于鼠伤寒沙门氏菌的QS干扰和未来应用提出新的见解,为解决沙门氏菌感染,耐药性问题及其在食品发酵工业的危害上找到新的解决办法。
1 鼠伤寒沙门氏菌的QS系统
鼠伤寒沙门氏菌中存在多种QS系统在调节细菌毒力和抗生素耐药性方面起重要作用,分别为N-高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserine lactones,AHL)、呋喃酰硼酸二酯类(autoinducer-2,AI-2)、3型自诱导分子(autoinducer-3,AI-3)、吲哚和扩散信号因子(diffusible signaling factor,DSF)等5种QS系统[2](图1)。
图1 鼠伤寒沙门氏菌的5种QS系统
Fig.1 Five quorum sensing systems in S. Typhimurium
1.1 AHL介导的QS系统
AHL是革兰氏阴性菌中最常见的QS信号。鼠伤寒沙门氏菌通过感应AHL信号来进行种间通讯。AHL是S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosylmethionine, SAM)和酰基酰载体蛋白由AHL合成酶LuxI催化合成。鼠伤寒沙门氏菌虽然缺失LuxI同源基因,不能合成AHL。但AHL可通过细胞膜自由扩散,因此鼠伤寒沙门氏菌可利用其他细菌生成的AHL信号分子[5]。在细菌初定植期间,鼠伤寒沙门氏菌可编码SdiA受体蛋白识别和利用AHL,SdiA的氨基端是AHL分子结合域,羧基端是DNA结合域,SdiA需结合AHL后才能进行DNA分子互作,激活rck操纵子基因座和srgE基因座。其中rck操纵子参与沙门氏菌Pef菌毛的生物合成、侵袭宿主细胞、抵抗补体杀伤的功能,srgE编码沙门氏菌Ⅲ型分泌系统(type three secretion system,T3SS)效应子并通过T3SSⅡ输入到宿主细胞[6]。
1.2 AI-2介导的QS系统
AI-2介导的QS系统存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中,是细菌间的“通用语言”。首先S-腺苷甲硫氨酸SAM甲基化为S-腺苷半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAH),SAH随后在S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase, Pfs)的催化下生成S-核糖高半胱氨酸(S-ribosyl-L-homocysteine, SRH)。SRH被LuxS裂解生成4,5-二羟基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxyl-2,3-pentanedione, DPD),DPD可自发重排生成AI-2信号分子。鼠伤寒沙门氏菌通过lsr操纵子进行AI-2的信号传导。lsr操纵子由lsrACDBFG组成,AI-2通过LsrACDB转运蛋白进入细胞内,由LsrK激酶加工为磷酸化的AI-2,LsrR则作为抑制因子,结合磷酸化的AI-2使其失活解除对lsr操纵子的抑制,促进对AI-2的吸收。LsrG和LsrF能降解磷酸化的AI-2来调控AI-2磷酸化水平解除对lsr操纵子的抑制,在还原条件下,LsrG能将磷酸化的AI-2转化为同分异构体的3,4,4-三羟基-2-戊酮-5-磷酸(3,4,4-trihydroxy-2-pentane-5-phosphate, P-TPO)和3-羟基-2,4-戊二酮-5-磷酸(3-hydroxy-2,4-pentanedione-5-phosphate, P-HPD),LsrF则将 P-HPD 中的酰基转移至辅酶A,生成磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate, DHAP)和乙酰辅酶A,参与进行糖酵解和柠檬酸循环[7]。
1.3 AI-3介导的QS系统
AI-3是肠道共生菌群产生的细菌信号。AI-3与肾上腺素 (epinephrine, Epi)/去甲肾上腺素 (norepinephrine, NE)结构上较相似,且之间存在着交叉通讯交流。鼠伤寒沙门氏菌表达一种称为QseC的组氨酸激酶(histine kinase, HK)传感器,可以识别AI-3信号并进一步介导细菌毒力[8]。QseC有2个跨膜结构域, 分别为HK结构域和ATP酶结构域。QseC接受到AI-3信号分子后,进行自身磷酸化,将磷酸基团转移到其同源反应调控蛋白QseB上。沙门氏菌中还有第2种双组分系统, 即QseEF,其中QseE是HK, QseF为反应调节蛋白(response regulator, RR)。QseE不能感应AI-3, 但能感应Epi/NE以及硫酸盐、磷酸盐。QseC和QseE这两种肾上腺素能受体通过互作,QseBC和QseEF双组分系统间存在交叉通讯交流现象在体内外均能调控鼠伤寒沙门氏菌的毒力。
1.4 吲哚介导的QS系统
吲哚是一种由苯环与吡咯环稠合而成的芳香烃,是胃肠道中丰富的启动病原体定植的微生物代谢物。吲哚由色氨酸酶(trytophanase, TnaA)产生,该酶存在于大肠杆菌及其他胃肠道微生物中。超过85种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生吲哚,鼠伤寒沙门氏菌本身不产生吲哚,但可以感应吲哚。吲哚作为一种细胞间信号分子,控制着细菌的多阶段生理活动,包括耐药性、芽孢形成、生物被膜形成、毒力因子的形成等。在鼠伤寒沙门氏菌中,吲哚可以通过降低毒力岛(Salmonella pathogenicity island 1, SPI-1)的表达来减弱细菌的运动性、侵袭性和毒力因子的表达,而不影响与细菌生存相关的毒力岛(Salmonella pathogenicity island 2, SPI-2)的表达。
1.5 DSF介导的QS系统
脂肪酸是由肠道微生物群作为代谢产物产生,通常作为微生物群落和动物宿主的营养来源。但有一类脂肪酸能显著抑制入侵肠道和毒力,并被细菌当作细胞间交流信号,这类分子为DSF。DSF通常是α, β-不饱和脂肪酸,动植物细菌的病原体使用这种罕见的顺式-2-不饱和脂肪酸来调节群体感应系统。沙门氏菌以非传统方式响应DSF,其中苛养木杆菌产生的顺式-2-十六碳烯酸(cis-2-hexadecenoic acid,c2-HAD)抑制作用最强,结合3种沙门氏菌转录激活因子HilD、HilC和RtsA,阻止其诱导入侵必须的基因。在鼠伤寒沙门氏菌中,DSF通过阻止HilD与靶标DNA相互作用和诱导HilD被Lon蛋白酶快速降解来抑制HilD活性,HilD是诱导上皮细胞侵袭所必需的AraC型激活剂。
2 鼠伤寒沙门氏菌的群体感应抑制策略
群体感应作为细菌的通信工具,依赖于信号分子的分泌、运输和识别来调控后续基因表达来协调菌群行为,群体感应提高了细菌汲取营养、适应环境的能力。群体感应干扰策略的开发主要还是依赖于QS系统发挥功能的基本分子机制。因此,鼠伤寒沙门氏菌的QS干扰策略主要可分为3种:a)干扰QS信号分子的合成;b)干扰QS信号分子的运输及降解;c)干扰QS信号分子与受体蛋白的结合。
2.1 干扰QS信号分子的合成
QS信号分子的合成需要多种酶的参与,通过抑制相关合成蛋白或酶的活性,从源头阻断群体感应信号分子的合成,是干扰群体感应途径的有效手段。鼠伤寒沙门氏菌LuxS是生成AI-2信号分子过程中的重要合酶,参与细胞的各项生理反应。鼠伤寒沙门氏菌luxS突变株中生物被膜形成缺陷,且lsr操纵子的表达显著降低。CHOI等[9]发现敲除luxS基因,鼠伤寒沙门氏菌SPI-1毒力岛中相关基因的转录水平会降低,同时侵袭上皮细胞的能力也减弱,在小鼠体内的毒力减弱。在鼠伤寒沙门氏菌中,LuxS催化裂解SRH为DPD分子,在胞内DPD分子自发可逆的环化为AI-2分子,抑制LuxS合酶可间接降低AI-2浓度。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基转移形成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),SAH经Pfs核苷酶脱去腺苷形成S-核糖同型半胱氨酸(SRH),因此干扰Pfs酶活性也可成为阻断AI-2合成途径的有效策略。SHARIFI等[10]研究发现植物精油对肠出血性大肠杆菌O57:H7 的生物膜形成有显著的抑制和破坏作用,同时实时荧光定量PCR结果显示luxS和pfs有明显的下调,表明EOs具有抗菌、抑制生物被膜形成、抗QS潜力。HUSNA等[11]通过构建pfs敲除菌株,发现Pfs对鼠伤寒沙门氏菌的生长至关重要,但在pfs敲除菌株中添加SAH水解酶可恢复鼠伤寒沙门氏菌的生长并恢复毒力,表明Pfs在细菌毒力中的关键作用在于减少SAH的毒性积累,SAH反过来抑制了甲基转移酶,这可能是抗菌开发的新目标[11]。AI-2合成干扰除了抑制LuxS合酶和Pfs核苷酶活性外,还可通过抑制甲基转移酶的活性和干扰DPD分子在周质空间中的环化过程来抑制AI-2的产生,但目前这方面的研究还有待更多的研究。
2.2 干扰QS信号分子的胞外运输与反应
群体感应淬灭通过破坏信号分子干扰QS系统,将信号分子降解或失活。目前发现的QQ酶主要以AHL为作用靶点,根据酶制剂特点分为三类:AHL内酯酶/对氧磷酶(内酯水解)、AHL酰基转移酶(酰胺水解)和AHL氧化酶/还原酶(氧化还原)。AHL内酯酶已被鉴定可有效抑制细菌生物被膜形成并减弱毒力因子,通过水解方式裂解AHL中的高丝氨酸内酯环,降低QS分子的有效性。不动杆菌属中aidE基因编码高丝氨酸内酯酶, 对多种类型的AHL信号分子具有降解活性。表达aidE基因的胡萝卜软腐欧文氏菌株Z3-3的致病性明显下降,表明利用AidE降解信号分子进而降低病原菌致病性具有潜在的应用价值[12]。AHL酰基转移酶能水解AHLs酰基链和高丝氨酸部分之间的酰胺键,来源于铜绿假单胞菌PAO1的PvdQ酶能降解含有11～14个碳链的多种AHL信号分子,降低细胞毒性[13]。AHL氧化还原酶能够催化AHL酰基侧链的氧化或还原。目前,已在伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)等细菌中发现AHL-氧化还原酶。例如从酸杆菌属(MP5ACTX8 Acidobacterium spp.)中分离获得的BpiB09短链脱氢酶在铜绿假单胞菌PAO1中的表达,降低了运动能力,减弱了生物被膜形成能力[14]。虽然鼠伤寒沙门氏菌并不会产生AHL分子,但是并不意味着不可以用干扰AHL降解的策略还影响其获取别的来源的AHL,但目前这方面还有待更多的探索研究。
在AI-2型QS系统中,AI-2分子在胞内合成后经TqsA蛋白转出至胞外,达到阈值浓度后被LsrB受体蛋白识别并经LsrACD迅速转运至胞内,因此干扰AI-2受体蛋白成为干扰群体感应途径的有效手段之一。TqsA蛋白和YdiA蛋白作为AI-2分子的转出蛋白,以五聚体复合物嵌入在细胞膜上,通过Na+/H+离子通道转出AI-2分子,TqsA的缺失会导致细菌生物量、运动能力、生物被膜形成、胞内AI-2 浓度和lsr 操纵子表达量增加。在大肠杆菌中,YdiK的表达受嘌呤代谢和转运的PurR转录因子调控[15]。虽然目前针对沙门氏菌TqsA和YdiK的研究较少,但通过转出蛋白干扰群体感应的前景很广阔。
AI-2作为细菌间通用的信号分子,降解AI-2可导致QS在种间及混合种群中表达的淬灭。通过将AI-2激酶LsrK和ATP引入细菌培养物来实现群体感应信号降解,从而将AI-2在细胞外磷酸化,发现AI-2控制的细菌串扰显著减少。体外合成磷酸化的AI-2淬灭了大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及哈维氏弧菌合成生物系统的QS。磷酸化AI-2具有亲水性,无法穿过细胞膜作为QS信号,因此这些细菌的QS反应被严重抑制。这种策略在多微生物感染中可能特别有效,因为LsrK可以磷酸化DPD,即AI-2的前体分子,并且无论不同细菌QS系统使用的AI-2结构和传输/传感器机制如何,这种策略都是有效的[16]。
2.3 干扰QS信号分子与受体蛋白的结合
溴化呋喃酮(bromo-furanone,BMF)已被证明是有效的生物膜形成[17]和QS抑制剂。KJELLEBERG等[18]于1996年从红色海洋藻类中分离出天然的溴化呋喃酮被证明是LuxS的共价抑制剂,溴化呋喃酮不仅抑制LuxS,还抑制参与AI-1感知的其他蛋白质。SRH类似物可通过结合竞争LuxS蛋白表现出对LuxS合酶活性的抑制能力。JANSSEN等[19]发现(Z)-4-溴-5-溴亚甲基-3-烷基-2(5H)-呋喃酮[(Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-alkyl-2(5H)-furanone]这种化合物诱导参与新陈代谢、应激反应(ibpA、ibpB和grpE)和药物敏感性(ahpC、marA、emrR、acrA)的基因,其中大多数被抑制的基因参与新陈代谢、T3SS(sseAD和ssaEGH)和鞭毛生物合成(fliK、fliM、fliO和flgCD)。呋喃酮烷基链肠毒的差异对在沙门氏菌中的活性十分重要。没有烷基链的呋喃酮与烷基化呋喃酮相比,生物膜抑制活性较强,但对沙门氏菌毒性更大。LOWERY等[20]发现线性烷基类似物取代DPD的C1部位改变了DPD分子的生物活性,影响lsr操纵子的表达,因此可以选择DPD-C1-烷基类似物来作为鼠伤寒沙门氏菌lsr表达的抑制剂[21]。用呋喃酮预处理使沙门氏菌生物膜更容易受到抗生素治疗。这些研究表明,特定的溴化呋喃酮在预防鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成方面具有较大潜力。
在抑制AI-2类QS信号分子与受体蛋白结合过程中,可以从2方面进行干扰,一是通过类似物与AI-2竞争结合受体蛋白;二是过表达受体蛋白LsrR,使磷酸化AI-2结合LsrR解除对lsr操纵子的抑制作用减弱。过表达LsrR导致AI-2介导的QS下调降低了沙门氏菌在巨噬细胞中的存活率,同时参与氧化应激反应的基因(如sodA、sodCI和sodCII)表达减少,通过阻碍沙门氏菌逃避巨噬细胞内的氧化杀伤来降低沙门氏菌的毒力[22]。
鼠伤寒沙门氏菌的膜结合蛋白QseC是一种AI-3受体。鼠伤寒沙门氏菌的QseC能调控SPI-1和SPI-2编码的T3SSs及其效应子[8],调控毒力与应激相关周质蛋白 VisP的表达增强沙门氏菌应激条件时 (如酸性pH、H2O2和CrCl3等)在沙门氏菌囊泡(Salmonella-containing vacuole, SCV)内的生存能力[23]。同时QseC调控鼠伤寒沙门氏菌运动性 (flhDC)、侵袭性 (sifA) 以及繁殖能力 (sopB) 相关基因的表达, 并且QseC还介导鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞后的细胞凋亡[24]。JI等[25]研究发现鼠伤寒沙门氏菌qseC基因的缺失增强了qseB的表达和细菌生物被膜形成能力,减弱了细菌运动性和侵袭性,相反qseB基因的缺失对细菌运动能力无明显影响,而增强细菌对Hela细胞的侵袭能力和减弱生物被膜形成。近期研究人员研究发现QseC的特异性抑制剂儿茶酚胺受体拮抗剂LED209抑制鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因flhDC的表达,进而抑制巨噬细胞NLRC4炎性复合体的活化和巨噬细胞焦亡的发生。LED209对QseC的阻断效应可以促进巨噬细胞清除胞内细菌,该效应与抑制鼠伤寒沙门氏菌胞内SCV的维持,促进细菌由SCV向胞质转移,促进细菌与溶酶体融合,增加细菌对活性氧和活性氮杀伤的敏感性。YANG等[26]研究发现LED209通过抑制QseC降低了副溶血杆菌(Vibrio parahaemolyticus)对体内盐水虾幼虫和白虾的毒力,且LED209对病原体和宿主无毒性,有潜力成为广谱抗病毒治疗药物。
综上所述,鼠伤寒沙门氏菌的群体感应抑制策略主要集中在以上三类途径中。目前对于鼠伤寒沙门氏菌的QS干扰又以AI-2类系统为主。图2系统地展示了AI-2是如何从合成到运输最后与受体蛋白结合的过程中被抑制的整个QS干扰流程。未来针对鼠伤寒沙门氏菌其他类型的QS系统的干扰或许也是治疗鼠伤寒沙门氏菌的干扰的有效方式。
图2 鼠伤寒沙门氏菌中AI-2类QS系统的干扰策略
Fig.2 Interference strategies of AI-2 mediated QS in S.Typhimurium
注:①干扰LuxS合酶、Pfs酶抑制AI-2信号分子合成;②加入LsrK使AI-2体外磷酸化干扰AI-2穿过细胞膜、通过转运蛋白TqsA运出AI-2;③溴化呋喃酮、DPD-C1-烷基等类似物与AI-2竞争受体;过表达LsrR解除抑制。
3 鼠伤寒沙门氏菌的群体感应促进策略
除AIs外,鼠伤寒沙门氏菌中还有2种不常见的QS信号分子吲哚和DSF。不同于上述信号分子,吲哚和DSF这两种信号分子介导的QS系统对鼠伤寒沙门氏菌的毒力因子、运动性、侵袭性起负调控作用,因此可以通过促进吲哚和DSF这2种信号分子作用来抵抗鼠伤寒沙门氏菌。鼠伤寒沙门氏菌群体感应干扰策略如表1所示。
表1 鼠伤寒沙门氏菌群体感应干扰策略
Table 1 Strategies for quorum sensing interference of S.Typhimurium
干扰类型QS分子干扰策略途径鼠伤寒沙门氏菌影响表型参考文献抑制AI-2干扰合成抑制LuxS聚合酶侵袭能力下降、毒力降低[9]抑制AI-2干扰合成抑制Pfs核苷酸酶抑制生物膜形成及生长[11]抑制AI-2干扰胞外反应促进转出蛋白TqsA、YdiK调控生物被膜、运动性等[15]抑制AI-2干扰胞外反应引入LsrK严重抑制AI-2介导的QS[16]抑制AI-2干扰受体蛋白结合添加溴化呋喃酮及其类似物抑制新陈代谢、毒力和鞭毛形成[20-21]抑制AI-2干扰受体蛋白结合过表达LsrR解除lsr操纵子抑制存活率下降、毒力降低[22]抑制AI-3干扰受体蛋白结合阻断QseC受体运动性、侵袭性降低[25-26]促进吲哚干扰合成竞争色氨酸促进生成吲哚减弱侵袭性[30]促进吲哚干扰受体蛋白结合与AHL竞争SdiA受体结合侵袭性、感染能力降低[35]促进吲哚干扰受体蛋白结合双组分系统PhoPQ减弱侵袭性[33-34]促进DSF干扰反应破坏β-氧化途径降解DSF侵染能力显著降低[31-32]促进DSF干扰受体蛋白结合结合HilD抑制毒力因子表达、入侵能力降低[38-39]
3.1 干扰QS信号分子的合成
QS信号分子的合成需要多种酶的参与,通过抑制相关合成蛋白或酶的活性,从源头阻断群体感应信号分子吲哚(其他微生物代谢产物)是由色氨酸酶TnaA催化L-色氨酸转化为吲哚,并由外排蛋白Mtr和AcrEF转运到胞外参与种间通讯[27]。吲哚信号参与细菌间的通讯对环境变化做出响应,包括调控细菌耐药性、毒力控制、生物膜形成和耐酸性[28-29]。BAJAJ等[30]通过一种通信激活的蛋白质表达谱(communication-activated profiling of protein expression, CAPPEX)揭示了大肠杆菌通过竞争鼠伤寒沙门氏菌前体中的Trp色氨酸来促进吲哚的生物合成。吲哚反过来被释放来抑制鼠伤寒沙门氏菌中毒力因子的表达,从而减弱沙门氏菌的侵袭力。吲哚主要阻止肠腔内的入侵,对系统性感染的影响较小。在大肠杆菌中敲除TnaA部分消除鼠伤寒沙门氏菌毒力因子在体外表达和体内致病过程中的抑制作用,支持了色氨酸-吲哚轴在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌间通讯作用,减弱沙门氏菌在宿主细胞和活体小鼠中的入侵,同时对小鼠的生存无明显影响。
3.2 干扰QS信号分子的降解反应
通过β-氧化途径,脂肪酸化合物被降解。破坏β-氧化途径,顺式-2-不饱和脂肪酸继续抑制hilA。表明DSF不是通过降解产物而是直接抑制[31],因此可以抑制DSF被降解来干扰群体感应。LUCAS研究发现脂肪酸代谢基因fadD突变的沙门氏菌hilA被显著抑制表达,同时细菌侵染能力也显著降低等[32]。同时,研究发现,敲除fadL、fadD或fadBA等脂肪酸代谢相关基因,长链不饱和脂肪酸对PhoP/PhoQ双组分调节系统的抑制作用独立于β-氧化途径,其中PhoP/PhoQ对鼠伤寒沙门氏菌致病性十分重要[33-34]。
3.3 干扰QS信号分子与受体蛋白的结合
在鼠伤寒沙门氏菌中,吲哚信号分子通过与AHL分子竞争SdiA受体蛋白的结合域,从而调节质粒的稳定性、毒力因子表达、抗生素耐药性以及细菌在营养缺乏环境中的适应性。吲哚处理降低了鼠伤寒沙门氏菌对上皮细胞、巨噬细胞的侵袭能力和毒力基因的表达,通过对细菌入侵相关SPI-1基因的表达下调来实现。吲哚处理降低了SPI-1主调节因子hilA的表达[35],进一步引起了T3SS分泌基因prgH和转录因子invF的表达下调,invF激活的分泌型效应子SipC表达也受到抑制,表明吲哚介导的侵袭性和感染性的降低是SPI-1毒力基因簇的协同作用的结果。相对于吲哚影响细菌侵袭相关SPI-1的表达,吲哚处理对SPI-2基因(ssrB和ssaR)的影响无明显变化,说明吲哚处理主要影响沙门氏菌的侵袭能力而不影响细菌在细胞内的存活能力[33]。吲哚对病原菌毒力的影响机制研究较少,很少有转录调控因子和双组份系统被报道参与吲哚信号转导。不同于致病性大肠杆菌中吲哚通过SdiA调节毒力的表达,吲哚并不通过SdiA介导沙门氏菌的毒力和运动性。但近期双组分系统PhoPQ被报道下调SPI-1基因表达,表明PhoPQ可能参与吲哚对沙门氏菌的作用[33-34]。吲哚对鼠伤寒沙门氏菌的作用靶标未知,但研究发现饮食中的吲哚衍生物,如吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酮酸和色胺,对沙门氏菌的作用与吲哚相似,吲哚-3-丙酮酸使hilA表达下调3倍,色胺和吲哚-3-乙酸分别使hilA表达下调1.3和1.5倍[35]。
在鼠伤寒沙门氏菌中,沙门菌致病性岛SPI-1基因编码的T3SS由AraC型转录调控因子HilD控制,对细菌入侵至关重要。HilD与AraC家族成员HilC和RtsA形成前馈环,诱导产生HilA,HilA反过来激活编码针状复合物和分泌型效应蛋白的基因表达,促进上皮细胞的侵袭[36-37](图1)。DSF通过与AraC家族转录调控因子相互作用,抑制肠道病原菌毒力基因的表达。在鼠伤寒沙门氏菌中,DSF通过阻止其与靶标DNA的相互作用和诱导其被Lon蛋白酶快速降解来抑制诱导上皮细胞侵袭所必需的AraC型激活剂HilD的活性,其中c2-HDA活性在测试的DSF中作用最强,分别抑制HilD依赖的转录调控因子hilA和Ⅲ型分泌效应因子sopB 200倍和68倍。c2-HDA可直接与主调控因子HilD的羧基头部高亲和力结合,使HilD失去DNA结合能力。因此,下游基因hilA和侵袭相关基因hilD、hilC和rtsA的转录均被抑制,从而抑制鼠伤寒沙门氏菌入侵上皮细胞的能力[38]。在c2-HDA存在的情况下,沙门氏菌的生长显著减少了其对HEp-2细胞的入侵(78%),而油酸在相同浓度下减少了70%的入侵,表明c2-HDA抑制了入侵基因的表达和鼠伤寒沙门氏菌入侵上皮细胞的能力[38-39]。
4 结论与展望
近几十年来,抗生素的广泛使用导致全球范围内出现了对各种病原微生物如鼠伤寒沙门氏菌的抗生素耐药性,导致肠道菌群失调和肠道疾病多发。虽然已报道的研究证明了鼠伤寒沙门氏菌的毒性及耐药性与QS机制相关,但是具体的靶点及相应机制的研究却不够深入,例如多种QS系统之间的多层调控,以及群体感应抑制剂对多种QS系统组成的通信网络的干扰机制的解析。虽然当前已知沙门氏菌中QS系统可以根据信号分子分类为:AHL、AI-2,AI-3,吲哚以及DSF等,但是缺乏对不同的QS系统之间多层调控机制的解析。当前QS干扰策略的研究绝大多数停留在基于单靶点的高通量挖掘和筛选验证上,借助相关体内体外实验评价其具体的干扰效果,鲜有研究QS干扰相应的QS网络系统的动态响应和调整机制。
目前对鼠伤寒沙门氏菌的QS干扰策略研究单一且独立,且干扰单类QS系统难以控制鼠伤寒沙门氏菌群体感应系统的整体效果。考虑到不同的QS信号分子动态调节细菌不同的代谢和生理活动,如生物被膜形成、毒力因子形成、运动性和耐药性,因此需建立起鼠伤寒沙门氏菌的群体感应网络,后续便可以从多角度同时阻断鼠伤寒沙门氏菌的群体感应网络。本综述以鼠伤寒沙门氏菌为例,展示了从多角度干扰群体感应网络的可能性。对于其他致病菌的群体感应网络,也可以采用组合的方式对其实现多靶点的干扰和阻断。目前对于绿脓杆菌的群体感应的多靶点干扰已有一些工作发表,如通过多酚黄酮类化合物作用于LasR和RhlR两类QS受体,降低毒力因子绿脓菌素和弹性蛋白酶的产生。针对其他致病菌的QS系统的先进的干扰策略也可借鉴地使用到鼠伤寒沙门氏菌的干扰中来。未来对群体感应干扰机制的研究不应该只是单靶点,应从网络层面进行思考,多靶点干扰群体感应机制应才是未来鼠伤寒沙门氏菌及其他更多菌群的研究方向。例如可以同时从控制AI-2信号分子的合成和结合过程,也可以促进吲哚或者DSF相关的途径来更好地实现对鼠伤寒沙门氏菌的QS的抑制防控。除此之外,还可以结合合成菌群的思路来抑制鼠伤寒沙门氏菌的定植和毒性。例如抑制其他细菌生成AHL来减弱鼠伤寒沙门氏菌对AHL的利用或者增强其他细菌生成吲哚代谢物来抑制鼠伤寒沙门氏菌的毒力。总之针对鼠伤寒沙门氏菌开发行之有效的干扰策略对于人类肠道健康,食品安全维护等具有重要的意义。
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