香气作为评价甜瓜风味品质的重要指标[1],也是驱动消费者的关键属性[2],其相关研究也越来越受到重视[3-4]。研究表明,果实香气是在底物和关键酶的共同作用下形成的,因此除关键酶外,其还受到合成底物(前体)的调控[5-6],而香气底物浓度也成为香气产生的一个重要限制因素[7]。目前,甜瓜香气品质研究已取得一些进展[8-10],但还不够系统深入。因此,本文以甜瓜香气组分为出发点,明确其特征香气,阐明特征香气的生物合成路径,总结分析关键调控因子,对甜瓜风味品质研究及调控具有重要意义。
1 甜瓜果实香气组成
果实香气是大量挥发性物质的复杂混合物,主要包括酯、醇、醛、萜类和挥发性的酚类等[11],其成分因种类、成熟度等因素而异[12-13]。甜瓜根据呼吸类型可以分为呼吸跃变型和非呼吸跃变型两类[14],中国甜瓜大多属于呼吸跃变型甜瓜,具有高度芳香性特征[15]。甜瓜中最主要的挥发性组分是酯类、醇类和醛类[16],有研究表明酯类一般是跃变型甜瓜中的主要香气物质,而醛类一般是非跃变型甜瓜中主要的香气物质[17]。大量研究表明,大多数甜瓜成熟果实的特征香气物质以直链酯类乙酸乙酯为主[8,18-19],对已报道的甜瓜成熟果实香气成分进行统计分析,成熟甜瓜的香气主要化合物以乙酸乙酯、乙酸苯甲酯和乙酸-2-甲基-1-丁酯等酯类为主。
由于不同的香气化合物阈值及浓度不同,对果实香气的贡献也不同[20],因此,常用香气活力值(odor activity value,OAV)来衡量某一香气成分的贡献度,从而判定哪些成分对香气起着关键作用[21]。当OAV≥1,则认为该组分对其香气有作用,且OAV越大,对整体香气的贡献度就越高[22],只有具有较高OAV的成分才是果实的特征香气,而乙酸乙酯、乙酸苯甲酯和乙酸-2-甲基-1-丁酯这几类香气的阈值较低,分别是5、0.2[23]、11 μg/kg[24],因而它们具有较高的OAV,是跃变型甜瓜成熟果实中主要的特征香气成分,而且它们具有明显的感官特性,乙酸-2-甲基-1-丁酯和乙酸乙酯均具有果香味[22,25],乙酸苯甲酯具有茉莉香味[26],因此,它们是成熟甜瓜香气系统的关键特征香气物质[20]。
2 甜瓜果实特征酯类香气合成路径
本文以表1中甜瓜特征酯类香气为例(乙酸乙酯、乙酸苯甲酯和乙酸-2-甲基-1-丁酯等),分析总结其生物合成路径,这是因为大多数成熟甜瓜的特征香气主要以酯类为主,这些挥发性酯产生于许多主要的代谢物前体,包括氨基酸、脂肪酸和碳水化合物[35]。
表1 甜瓜成熟果实中香气成分组成
Table 1 Aroma components in ripe melon fruits
甜瓜种类品种名称香气化合物数量主要香气物质酯类含量占比/%酯类种类占比/%参考文献薄皮白玉糖58乙酸苯甲酯、2,3-丁二醇二乙酸酯、乙酸己酯、乙酸丁酯等81.5229.31[27]薄皮玉美人16乙酸苯甲酯、乙酸-2-甲基丁酯、乙酸己酯和2,3-丁二醇双乙酸酯等96.9081.25[28]薄皮龙甜雪冠13乙酸苯甲酯、乙酸-2-甲基丁酯、2,3-丁二醇双乙酸酯和乙酸异丁酯等97.4676.92[28]薄皮玉美人15乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、呋喃唑酮、乙酸苯甲酯、2,3-丁二醇二乙酯等94.5160.00[20]薄皮龙甜3号13乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、2,3-丁二醇二乙酯、乙酸烯丙酯等98.0269.23[20]薄皮高甜黄金道15乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸苯甲酯、乙酸异丁酯、乙酸仲戊酯等98.9880.00[20]薄皮日本甜宝14乙酸乙酯、2,3-丁二醇二乙酯、乙酸-2,6-二甲基-3-辛醇酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸己酯等99.5771.43[20]薄皮香沙蜜18乙酸乙酯、乙酸苯甲酯、烯丙基硫醚、十六酸、乙酸-2-甲基-1-丁酯等71.4861.11[20]薄皮甘甜3号34乙酸乙酯、乙醇、乙酸、异戊醇、丁酸乙酯等60.0435.29[29]薄皮甘甜5号40乙酸乙酯、乙醇、乙酸、异戊醇、顺-6-壬烯-1-醇等47.8627.5[29]薄皮盛开花33乙酸乙酯、丁酸、乙醇、丁酸乙酯、3-甲基-1-丁醇等63.7436.36[29]薄皮白棒子88乙酸乙酯、乙酸甲硫酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等69.5935.23[30]薄皮金塔寺99乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯等70.7732.32[30]薄皮梨瓜88乙酸乙酯、乙酸-2-甲基丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯等42.6127.27[30]厚皮黄河蜜97乙酸乙酯、乙酸-2-甲基丙酯、乙酸戊酯、乙酸苄酯等27.1728.87[30]厚皮银帝86乙酸乙酯、乙酸戊酯、1-甲基乙氧基乙酸乙酯、乙醛等21.5226.74[30]厚皮玉金香91乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸-2-甲基丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯等52.7329.67[30]厚皮A74×7571乙酸苯甲酯、乙酸乙酯、2-甲基-3-丙酸苯丙酯、2-甲基-乙酸-1-丁醇、乙酸己酯等79.8154.93[31]厚皮Elizabeth10乙酸苯甲酯、乙酸-2-甲基丁酯、乙酸己酯和乙酸异丁酯等99.0790.00[28]厚皮创新1号13乙酸-2-甲基丁酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异丁酯和(Z)-6-壬烯醛等93.6584.62[28]厚皮网纹甜瓜网络时代3号62乙酸苯甲酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、2-苯基乙酸乙酯、乙酸己酯等68.0240.32[32]厚皮西州蜜25号36乙酸异丁酯、2-甲基-1-丁醇乙酸酯、乙酸正己酯、2-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸正丁酯等84.1572.22[33]厚皮伽师瓜43乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯等79.9565.12[34]
2.1 脂肪酸合成路径
研究显示,以亚油酸为食的“南果梨”果实中增加的酯类为乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯和一些长链酯类化合物[36],在甜瓜中,用脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)底物亚油酸和亚麻酸处理甜瓜果盘,提升了LOX活力并诱导己醛、(2E)-壬烯醛和直链酯(如乙酸乙酯)的积累,相比之下,LOX 抑制剂降低了此类化合物的水平[19],说明脂肪酸是合成乙酸乙酯等酯类物质的重要前体。众多报道表明,游离脂肪酸如亚油酸和亚麻酸通过LOX途径生成 9氢过氧化物和13氢过氧化物,9氢过氧化物在氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)的作用下被还原为壬醛和壬二烯醛,13氢过氧化物在HPL的作用下被还原为己醛和己烯醛,然后分别通过醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH) 和醇酰基转移酶(alcohol acyltransferase,AAT) 转化为相应的酯[12,37-39]。图1总结了不饱和脂肪酸亚油酸/亚麻酸生成C6、C9等酯类香气的具体路径[22]。乙酸乙酯是成熟甜瓜的主要特征香气,也是果实呈现 “果香味”的主要来源,但是由脂肪酸途径生成乙酸乙酯是经过LOX途径还是β氧化途径,其具体合成路径尚不明确,还需进一步深入研究。
图1 脂肪酸代谢合成酯类香气[22]
Fig.1 Aroma of esters synthesized from fatty acid metabolism
注:ISO:异构酶(isomerase)。
2.2 氨基酸合成路径
氨基酸分解代谢被认为是甜瓜香气化合物产生的重要途径[40],关于植物中氨基酸衍生挥发物的生物合成的大部分信息都是基于放射性标记或稳定同位素标记的前体饲喂实验[12]进行证明的。果实香气中的支链酯主要来自于氨基酸途径,以缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸为前体经过2种反应形成(图2),一种是经支链氨基酸转氨酶(branched-chain amino acid transaminase,BCAT)启动形成相应的α酮酸[41],后经丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)脱羧生成相应的醛类[42-43],再经ADH和AAT催化形成相应的支链酯,或者α酮酸经丙酮酸脱氢酶(pyruvate decarboxylase,PDH)形成酰基辅酶A,再与相应的醇在AAT作用下合成支链酯类,如乙酸-2-甲基-1-丁酯来源于异亮氨酸,乙酸异丁酯来源于缬氨酸等[38,44-45];另一种是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸经醛合成酶[38,42]或脱羧脱氢直接形成相应醛类[45],再经ADH和AAT催化形成支链酯。GONDA等[46]研究结果表明,在甜瓜果实组织中,氨基酸代谢形成香气通过转氨机制启动,而非其他植物中所证明的脱羧或直接醛合成机制。因此,甜瓜果实中特征支链酯的形成为转氨酶氨基酸转氨酶(amino acid transaminase,AT)启动途径。
图2 氨基酸代谢合成酯类
Fig.2 Aroma of esters synthesized from amino acid metabolism
注:红色方框表示合成底物,绿色方框表示关键酶和挥发物(下同)。
而芳香酯如乙酸苯乙酯和乙酸苯甲酯源自苯丙氨酸[46-48],苯丙氨酸通过芳香氨基酸转氨酶(aromatic amino acid transaminase,ArAT)反应形成苯丙酮酸,后经系列生化反应形成苯甲醛,进而生成乙酸苯甲酯(图2)。
2.3 碳水化合物合成路径
酯类的合成除了脂肪酸途径和氨基酸途径外,果实中的糖也可以代谢为酯类,在酿酒酵母和苹果香气中表明乙酸乙酯的生物合成是糖酵解途径生成丙酮酸后在各种酶促反应下生成[49-50],唐贵敏[37]在厚皮甜瓜香气研究中表明,单糖在无氧条件下生成丙酮酸,后经一系列反应形成酯;WANG等[43]在甜瓜中发现丙酮酸/α-酮酸脱羧酶 PDC1参与甜瓜果实中乙醛、丙醛和戊醛的生物合成,并揭示了甜瓜中短直链挥发物的生物合成途径。综上,本文总结出以单糖为前体的乙酸乙酯生物合成途径如图3所示。
图3 糖代谢合成酯类
Fig.3 Aroma of esters synthesized from glucose metabolism
3 影响甜瓜果实酯类香气合成的调控因子
3.1 调控甜瓜果实酯类香气合成的宏观因子
酯类是伴随着甜瓜成熟而产生的,作为重要的香气物质,其受到多种因素的调控,既有内部因素(品种,成熟度),又有外部因素(施肥、嫁接、生长调节剂和采后处理)(表2)。
表2 影响甜瓜酯类香气合成的宏观因子
Table 2 Macroscopic factors affecting the synthesis of melon esters aroma
影响因素 对酯类香气的影响参考文献内部因素品种呼吸跃变型甜瓜品种中酯类种类和含量较非呼吸跃变型高[17]成熟度随着果实发育酯类的种类和含量逐渐增加并成为果实中主要芳香物质组分,“彩虹7号”和“日本甜宝”从花后25 d至花后35 d,果肉中酯类种类分别从11种和10种增加到19种和18种,酯类含量分别从6.8 μg/kg和7.6 μg/kg增加到69.5 μg/kg和79.1 μg/kg[51]外部因素施肥钼酸铵处理的甜瓜果实中酯类物质含量高于其他处理,0.04 mg/L钼酸铵处理的“千玉6号”果实酯类物质占比达61.79 %,高于其他浓度处理[52]嫁接嫁接改变了甜瓜果皮和果肉中主要酯类含量,嫁接提高了果皮中乙酸乙酯和乙酸-2-甲基-1-丁酯的含量,降低了乙酸己酯和乙酸苯甲酯的含量,而在果肉中除乙酸乙酯外, 嫁接降低了其他3种(乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸己酯和乙酸苯甲酯)主要酯类含量,说明嫁接改变了薄皮甜瓜的主要酯类含量[53]生长季节非乙酸酯与乙酸酯的比值在不同年份季节之间存在差异,2013年乙酸酯/非乙酸酯含量比值为36.99/38.03,2014年乙酸酯/非乙酸酯含量比值为62.71/22.30[54]外源乙烯处理显著提高了直链酯类物质的含量,尤其是乙酸酯、己酸酯和己酯类物质,外源乙烯处理通过氨基酸途径影响酯的种类和含量[40,55]生长调节剂CPPU处理的甜瓜果实中乙酸异丁酯、乙酸乙酯、乙酸2-甲基丁酯和乙酸苄酯等几种重要酯类的相对含量显著低于蜜蜂授粉,分别下降了3.98%、3.71%、1.97%和1.16%[56]BTH处理影响“玉金香”甜瓜酯类香气物质的释放,BTH处理组较CK组果实支链酯类、芳香族酯类和硫酯类香气物质的释放峰值分别降低了37.95%、16.54%和17.36%[57]采后贮藏玉金香在(22±2) ℃贮藏期间,甜瓜酯类相对含量呈双峰形变化,在贮藏第2天和第10天出现峰值,相对含量分别为66.28%和91.58%[58]强化保鲜剂和1-甲基环丙烯共处理甜瓜的酯类香气含量均高于1-甲基环丙烯处理和对照甜瓜,处理20 d时酯类香气含量较对照高57.68%[59]
甜瓜品种根据呼吸类型分为呼吸跃变型和非呼吸跃变型。研究表明,呼吸跃变型甜瓜品种中酯类种类和含量较非呼吸跃变型高[17]。果实的成熟度对香气也有影响,据报道,甜瓜果实成熟初期,醛类物质较多,随着果实的发育成熟,酯类物质的种类和含量逐渐增多,且成为成熟果实的主要香气成分[51]。除了内部因素外,外部因素对甜瓜果实酯类香气也有影响,微量元素钼对果实品质形成有重要影响,0.04 mg/L钼酸铵处理甜瓜果实,其酯类物质含量高于其他处理[52]。嫁接对品质也有影响,研究表明,嫁接改变了甜瓜果皮和果肉中主要酯类含量[53]。环境因素也影响酯类,生长季节引起甜瓜果实酯类物质的差异,尤其是乙酸酯与非乙酸酯之间的比值[54]。此外,研究人员还关注了一些植物生长调节剂对甜瓜酯类的影响,比如乙烯[40,55]、氯吡脲[N-(2-chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea,CPPU][56]、苯并噻重氮(benzothiadiazole,BTH)[57]等。甜瓜成熟后离消费者品尝还有一段距离,因此采后贮藏和保鲜也是一个研究方面,据报道采后贮藏温度以及处理方法可以保持甜瓜新鲜度以及风味品质,延缓其衰老,从而延长货架期[58-59]。具体见表2。
3.2 调控甜瓜果实酯类香气合成的微观因子
3.2.1 调控甜瓜果实酯类香气合成的关键基因
为了通过分子辅助育种方法调控甜瓜香气品质,在上述代谢途径基础上,有必要探讨甜瓜香气物质生物合成路径中的关键调控基因,以期为调控香气品质提供科学依据。酯类挥发性成分作为甜瓜的特征香气成分,果实成熟度、呼吸类型、植物生长调节物质、栽培措施等均对甜瓜香气产生影响,其作用原理均是通过关键基因起作用。
根据特征酯类香气合成途径可知,甜瓜特征酯类香气合成涉及到多种酶基因,其中LOX和HPL为脂肪酸途径中特有的关键酶基因,BCAT、ArAT、PDC和PDH为氨基酸途径中的关键基因,其中PDC还参与了碳水化合物途径,而ADH和AAT是酯类合成最关键的酶基因,在3种途径中均有参与(表3)。有研究表明HPL可能与绿叶挥发物的产生相关[60],迄今为止,还没有从甜瓜中鉴定出HPL[41],牡丹中PDH催化丙酮酸不可逆氧化脱羧生成乙酰辅酶A[62],在甜瓜中还未得到证实,其余基因在甜瓜香气合成中的作用均已得到不同程度的验证。陈昊[63]利用CmADH4瞬时超表达实验,显著提升了甜瓜果肉中ADH总酶活力,同时伴随着果肉中乙酸乙酯、乙酸己酯和(E,Z)-3,6壬二烯醇含量超量积累,紧接着,WANG等[43]在PDC1沉默的甜瓜果实中发现,乙酸丙酯、丁酸丙酯和丙酸丙酯的含量显著下降。以上研究表明,甜瓜关键基因对酯类香气的合成有显著影响,可为甜瓜香气调控提供依据,若需实践还需进一步加强功能验证研究。
表3 影响甜瓜酯类香气合成的关键基因
Table 3 The key genes affecting the synthesis of melon ester aroma
注:—表示无相关数据。
基因名称酶种类成员底物产物参考文献CmHPLHPL—9,13-氢过氧化物绿叶挥发物,如图1 中壬二烯醛和己烯醛[60]CmLOXLOXCmLOX10、CmLOX13亚油酸(优先)、亚麻酸氢过氧化物,如图1中9,13-氢过氧化物[12,19,61]CmAATAATCmAAT1-4醇+酰基辅酶a酯类,如图2中乙酸-2-甲基-丁酯[54]CmADHADHCmADH1-2醛+NADH/NADPH醇类,如图2中2-甲基丙醇[54]CmArATArATCmArAT1L-苯丙氨酸苯甲醛(图2)[46]CmBCATBCATCmBCAT1L-缬氨酸L-亮氨酸L-异亮氨酸α-酮酸(图2)[46]PDCPDC(α-酮酸脱羧酶)PDC1丙酮酸、2-丁酸氧丁酯、2-己酸氧己酯乙醛、丙醛和戊醛等醛类,如图2中2-甲基丙醛[43]PDHPDH—丙酮酸、α-酮酸酰基辅酶A(图2)[62]
除了以上与酯类合成关系比较紧密的关键酶基因外,还有许多与初始前体等物质运输、合成有关的基因,如参与脂肪酸等转运的ABC(ATP-binding cassette transporter)转运蛋白基因[64-65],与植物中脂肪酸的组成和含量密切相关的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)基因,可以催化多饱和脂肪酸去饱和形成多不饱和脂肪酸[66]等,在甜瓜中还有待研究。
3.2.2 调控甜瓜果实酯类香气合成的转录因子
随着果实香气基因的不断深入研究,转录因子(transcription factors,TF)逐渐成为新的焦点。转录因子是一群能与目标基因5’端特定序列专一性结合,从而调控目标基因表达的蛋白质分子,其可识别并调控多个靶基因,如植物中广泛存在的具有多功能的转录因子MYB、bHLH、NAC等,可在植物非生物胁迫[67]、生长发育[68]等方面发挥重要作用。目前,在园艺作物香气合成中已鉴别出RIN 转录因子调控番茄脂肪酸途径香气物质合成[69],PuMYB91、PubHLH61和PuNAC100-like协同正调控南国梨PuAAT和PuLOX3的表达[70],MdMYB1和MdMYB6调控苹果MdAAT2的表达[71],MabZIP4和MabZIP5可调控香蕉BanAAT的表达[72],进而参与果实酯类芳香物质的调控。甜瓜中转录因子的研究主要集中在果实成熟和发育方面,研究表明CmERFI-15 和 CmERFII-9 可以正调控甜瓜果实成熟[73],CmsHsp28具有延缓甜瓜果实成熟的功能[74]。然而,目前有关甜瓜酯类芳香物质转录调控的研究较少,其转录调控机制也有待进一步研究。
4 展望
甜瓜中发现的这些不同的香气挥发物来自各种相关和不相关的代谢途径,涉及许多基因和酶,这些基因和酶共同塑造了甜瓜果实的香气系统[41,47]。酯类香气作为甜瓜风味品质的重要贡献者,其合成过程中的众多合成前体和调控因子共同影响着其含量,因此明确甜瓜酯类香气的合成与调控机制,对解析果实芳香品质具有重要意义。
综上可知,全面科学地解析甜瓜香气品质的合成与调控机制还需从以下方面展开深入研究:首先,明确特征香气的生物合成路径,生物体中合成路径错综复杂,因此需借助前体特异性标记等多学科交叉的方法,阐明目标物质在生物体内的合成路径;其次,加强基因功能的验证研究,尽管甜瓜酯类香气合成中涉及到的一些基因已得到初步验证,但大都是在模式作物中进行,所以很多基因的功能还未在甜瓜果实中得到直接证实;此外,通过目标基因的深入研究,筛选挖掘相关转录因子,丰富果实酯类芳香物质的调控机制,为甜瓜风味品质改良调控提供更多的科学依据。
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