酱油是一种广受世界各国人们欢迎的调味品,其能在调味的同时上色[1]。酱油对食材和食物的上色能力主要与其色率指标有关。除添加焦糖色外,褐变是酱油生产过程主要与色率增加有关的反应[2-3]。适度的褐变有助于酱油形成诱人的红褐色,而褐变过度则会使酱油发黑,影响其感官和使用价值[4-5]。因此,研究酱油发酵过程褐变规律与机制对调控酱油颜色的形成具有重要意义。
酱油在发酵过程的褐变包括酶促褐变反应和非酶褐变反应。多酚氧化酶是催化酶促褐变反应的主要酶类,它可将酪氨酸等酚类物质氧化为醌类物质。醌类物质继续与酚类和蛋白质等物质反应生成黑色素,形成酱油的褐变[6-7]。美拉德反应和焦糖化反应是食品加工过程非酶褐变的主要反应类型。由于高盐稀态酱油发酵在常温(15～30 ℃)下进行,不具备焦糖化反应的温度条件(120 ℃),因此美拉德反应被认为是酱油发酵过程中非酶褐变的主要反应类型[8]。美拉德反应是还原糖和氨基化合物经Amadori重排等一系列反应后最终形成类黑精等数百种化合物的过程。该反应受温度、pH值、糖和氨基酸种类、金属离子及盐浓度等多种因素的影响[9-10]。有研究发现,酶促褐变反应在泰国黄豆酱发酵前3 d活跃,美拉德反应则是在整个黄豆酱发酵过程中维持较恒定的速率[11]。酶促褐变反应仅在较短时间内发挥作用可能与发酵体系理化因素和美拉德反应产物对多酚氧化酶的抑制作用有关[6,12]。虽然酱油发酵过程酱醪中通过美拉德反应影响酱油颜色能力最强的糖类是木糖,但由于酱油发酵体系中木糖含量较低,前期研究认为葡萄糖和酸性氨基酸是美拉德反应的主要前体,并且是影响酱油褐变的主要因素[13]。由于酱油中含有丰富的还原糖和氨基酸,贮藏过程中美拉德反应也会持续进行,致使酱油的颜色进一步加深[14]。因此,控制酱油生产和贮存过程褐变的关键在于控制美拉德反应的前体物质。氨基酸含量是酱油品质相关的重要指标,控制美拉德反应的前体物质主要应着眼于对体系中还原糖的控制。已有研究证实,在枯草芽孢杆菌中表达漆酶和木糖还原酶,可使菌株在模拟美拉德反应体系中显著降低褐变水平[15]。通过减少美拉德反应前体进而减弱酱油发酵过程的褐变还需进一步证实。
本研究将研究高盐稀态酱油发酵过程的褐变规律,在初步确定酱油发酵过程褐变主要反应类型的基础上,研究影响酱油褐变反应的相关物质,为后续对酱油褐变的调控及进一步揭示酱油颜色的形成机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 试剂
氢氧化钠、葡萄糖、盐酸、硫酸、三氯化铁、冰醋酸、三乙胺、三氯乙酸、四氢呋喃、无水乙酸钠,国药集团化学试剂有限公司;邻苯二酚、地衣酚、甲醇、乙腈,麦克林试剂有限公司;木糖、交联聚乙烯基吡咯烷酮,生工生物工程有限公司;邻苯二甲醛试剂,美国安捷伦公司。
1.2 仪器与设备
恒温恒湿培养箱、恒温培养箱,上海博迅医疗生物仪器有限公司;恒温金属浴,杭州博日科技有限公司;UVmini-1280分光光度计,日本岛津公司;酶标仪、Agilent 1260高效液相色谱仪,美国安捷伦公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酱油发酵方法
酱油发酵:将豆粕或谷朊粉与去离子水以质量比1∶1.4混匀,润料4 h,随后121 ℃灭菌20 min。冷却至室温后将豆粕或谷朊粉与面粉以质量比6∶4拌匀,再加入0.15%(质量分数)酱油曲精,充分拌匀后在恒温恒湿培养箱(温度为30 ℃,湿度为95%)培养48 h,间歇翻曲(每16 h一次)。将成曲与盐浓度190 g/L的盐水以质量比1∶2.5混合,30 ℃恒温发酵50～60 d。谷朊粉替换豆粕时控制用于酱油发酵原料中总氮含量一致。50%谷朊粉和100%谷朊粉组别是指分别用谷朊粉替换50%或100%豆粕(替换比例以总氮含量比例换算)。
1.3.2 颜色指标的测定
酱油褐变指数、色率和颜色指数分别采用修改后的孙佳贺等[14]和李玉斌等[16]的方法。取2 g酱醪于5 mL离心管中,12 000 r/min离心5 min。取上清液过0.45 μm滤膜,稀释10倍后测定其在420、460、510、610 nm处的吸光值,并根据公式(1)～公式(4)计算。美拉德反应模型采用修改后的李玉真[17]的方法。将1 mL含有糖和氨基酸的溶液在90 ℃下反应4 h,迅速冷却至室温后测定其在420 nm处的吸光值,并根据公式(1)计算褐变指数。
褐变指数=OD420
(1)
色率
(2)
红色指数
(3)
黄色指数
(4)
1.3.3 氨基酸态氮、总酸和游离氨基酸含量的测定
酱油总酸和氨基酸态氮采用GB/T 18186—2000《酿造酱油》中的方法进行测定。酱油中游离氨基酸的含量使用邻苯二甲醛柱前衍生法测定[18]。液相系统:安捷伦1260,色谱柱:Hypersil ODS-2(250 mm×4.6 mm, 2.5 μm);流动相A:无水乙酸钠5 g,四氢呋喃5 mL,三乙胺200 μL,超纯水1 L,使用冰醋酸调节pH值至7.2;流动相B:无水乙酸钠5 g,超纯水200 mL,甲醇400 mL,乙腈400 mL。进样体积10 μL,洗脱速度1 mL/min,洗脱时间40 min,柱温40 ℃;检测器UV338 nm。
1.3.4 多酚氧化酶提取及酶活力检测
多酚氧化酶的提取和检测采用修改后的汤凯等[19]和SIDDIQ等[20]的方法。提取:准确称取30 g酱油成曲于研钵中,加入0.6 g交联聚乙烯基吡咯烷酮。冰浴研磨均匀后转移至烧杯中,加入60 mL于4 ℃预冷的PBS缓冲液(pH 6.8),在4 ℃冰箱中浸提12 h。随后于4 ℃、9 000 r/min离心30 min,取上清液获得多酚氧化酶粗酶液。
酶活力测定:在5 mL离心管中加入3.8 mL邻苯二酚溶液(0.3 mol/L)和0.2 mL粗酶液,于40 ℃连续监测20 min其在420 nm处的吸光值,以每分钟吸光值增加0.001为1个酶活力单位。空白对照为3.8 mL 邻苯二酚溶液中添加0.2 mL经100 g/L三氯乙酸处理后的粗酶液。取直线部分计算酶活力,计算如公式(5)所示:
酶活力
(5)
式中:V,粗酶液体积,mL;t,反应时间。
1.3.5 葡萄糖、木糖和戊聚糖含量分析
使用高效液相色谱法对葡萄糖和木糖的含量进行测定[21]。液相系统:岛津20A,色谱柱:ThermoFisher 69008-307780(300 mm × 7.7 mm, 8 μm);流动相:5 mmol/L H2SO4,进样体积10 μL,洗脱速度0.6 mL/min,洗脱时间15 min,柱温40 ℃,示差检测器。以木糖作为标准品,使用地衣酚—盐酸法测定戊聚糖含量[22]。样品制备:准确称取0.1 g样品,加入20 mL 2 mol/L HCl沸水浴2 h,过滤稀释10倍后备用。检测:取处理后样品3 mL,加入3 mL 1 g/L的FeCl3(溶于浓盐酸)和0.3 mL的10 g/L地衣酚(溶于无水乙醇)并混匀,沸水浴30 min,冷却后加入3.7 mL去离子水。混匀后于580 nm和670 nm波长下测定吸光值,根据两者的差值带入标准曲线公式计算戊聚糖含量。
1.4 统计学方法
使用IBM SPSS Statistics 26和Excel 2021进行数据处理,用Origin 2017作图,所有实验均包含3个平行样。
2 结果与分析
2.1 高盐稀态酱油发酵过程褐变指数的变化
为研究高盐稀态酱油发酵过程的褐变规律,考察了酱油发酵过程褐变指数的变化。结果如图1所示,酱油发酵过程的褐变主要分为2个阶段。阶段Ⅰ:酱油发酵的0～4 h,这期间酱油褐变指数呈指数级增加,4 h内褐变指数增加了0.252。阶段Ⅱ:酱油发酵的4 h～55 d,此期间酱油的褐变指数呈线性增加,在第55天时达到0.653。反应速率快是酶促反应的特点,阶段Ⅰ褐变指数的迅速增加,说明酶促褐变反应可能参与了这一时期的褐变。阶段Ⅱ酱油褐变指数稳定且缓慢增加,这与美拉德反应在酱油发酵过程中速率恒定的特点较为吻合。这些结果初步说明,酶促褐变和非酶褐变反应均参与了发酵过程酱油的褐变。
图1 酱油发酵过程褐变指数的变化
Fig.1 Changes in the browning index of soy sauce during fermentation
2.2 高盐稀态酱油发酵过程褐变反应分析
为进一步确定高盐稀态酱油发酵过程的褐变类型,采用添加酶促褐变反应抑制剂的方法区分酶促褐变反应和非酶褐变反应。本研究采用的酶促褐变抑制剂为半胱氨酸,它是一种还原剂,也能通过与Cu2+螯合等方式抑制多酚氧化酶的活性从而抑制酶促褐变[23]。如图2-a所示,浓度较低的5 mmol/L和10 mmol/L的半胱氨酸在抑制率上并没有显著区别,这可能与酱油粗酶液的成分较为复杂,存在影响半胱氨酸抑制效果的物质有关。但当体系中半胱氨酸的浓度达到50 mmol/L时,其对酱油成曲多酚氧化酶粗酶活性的抑制率可以达到94.5%。因此,本研究考察了在包含褐变反应阶段Ⅰ和阶段Ⅱ的一段时间内(0～48 h)添加50 mmol/L的半胱氨酸对酱油发酵过程多酚氧化酶的活性和褐变指数的影响。由图2-b可知,在酱油发酵初期多酚氧化酶活力逐渐增加,到第4 h其酶活力水平达到25.2 U/mL。而添加50 mmol/L半胱氨酸后,阶段Ⅰ酱醪中97%以上的多酚氧化酶活力被抑制,阶段Ⅱ多酚氧化酶活性被抑制了76%～95%。由图2-c可知,由于多酚氧化酶的活性被抑制,添加半胱氨酸的发酵组褐变指数明显低于对照,在前30 min时褐变指数的差值逐渐增大至28.4%,随后渐渐缩小到5%左右。因此,在阶段Ⅰ褐变指数的差值可以认为是非酶褐变反应对褐变的贡献,约占褐变的71.6%～92.7%。阶段Ⅱ中添加了半胱氨酸的发酵组多酚氧化酶活性处于较低水平,且其褐变指数比对照低约5%,说明这一时期的褐变也以非酶褐变反应为主。由此,初步确定非酶褐变反应是酱油发酵过程主要的褐变反应类型。
a-半胱氨酸浓度对成曲多酚氧化酶的抑制作用;b-半胱氨酸对酱醪中多酚氧化酶活性的影响;c-半胱氨酸对酱油发酵过程褐变指数的影响
图2 半胱氨酸对多酚氧化酶活性和酱油褐变指数的影响
Fig.2 Effect of cystine on polyphenol oxidase activity and browning of soy sauce
2.3 参与美拉德反应的主要糖类物质
2.3.1 酱油中主要糖类与氨基酸的褐变反应分析
为确定影响酱油美拉德反应的主要糖类,本研究首先考察了酱油中主要糖类与各种氨基酸(均为10 g/L)在发酵体系外通过美拉德反应产生褐变的能力。高盐稀态酱油发酵中添加的盐水质量浓度一般在180 g/L左右,为了更加贴合实际情况,本研究选用180 g/L的盐水而不是去离子水作为反应体系。如图3所示,在盐质量浓度180 g/L的反应体系中,通过美拉德反应产生褐变能力最强的是木糖,其次是阿拉伯糖、果糖和葡萄糖。参与美拉德反应产生褐变能力较强的氨基酸依次为赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
图3 糖与氨基酸种类对褐变指数的影响
Fig.3 Effect of sugars and amino acids on browning index
2.3.2 影响美拉德反应的主要糖类
为确定木糖是否为高盐稀态酱油发酵过程中通过美拉德反应产生褐变的主要糖类,本研究首先分析了发酵过程木糖与葡萄糖的含量变化。如图4所示,酱油发酵0～30 d葡萄糖含量从2.2 g/L逐渐增加到54.8 g/L,这期间木糖含量由0.3 g/L增加到3.5 g/L。因此,高盐稀态酱油发酵过程葡萄糖的含量显著高于木糖,酱醪中前者的含量约为后者的15.7倍。图3结果表明,木糖褐变能力显著高于相同浓度的葡萄糖。为进一步明确酱醪体系中通过美拉德反应产生褐变的主要糖类物质,比较了不同质量浓度木糖和50 g/L葡萄糖在美拉德反应模型中的褐变能力。如图5所示,2.5 g/L木糖的褐变能力已经显著高于50 g/L葡萄糖的,而3.5 g/L木糖的褐变能力比50 g/L葡萄糖的高40%。这说明酱油发酵过程中由木糖通过美拉德反应产生的褐变显著高于葡萄糖,即木糖是高盐稀态酱油发酵过程中产生褐变的主要糖类前体。
a-葡萄糖含量;b-木糖含量
图4 酱油发酵过程中葡萄糖和木糖含量变化
Fig.4 Changes of glucose and xylose in soy sauce moromi during fermentation
图5 木糖与葡萄糖褐变能力的比较
Fig.5 Comparison of the browning capacity of xylose and glucose
注:*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。
2.4 戊聚糖含量对酱油颜色及理化指标的影响
为了证实木糖对酱油发酵过程褐变的主要贡献,本研究考察了采用不同戊聚糖含量原料进行发酵对高盐稀态酱油褐变过程和颜色变化的影响。由图6-a可知,可用于酱油酿造的几种原料中戊聚糖含量由高到低依次为豆粕、面粉、玉米蛋白粉和谷朊粉,其中谷朊粉的戊聚糖含量比豆粕低90.2%。采用谷朊粉部分替换(50%谷)豆粕和完全替换(100%谷)豆粕进行酱油发酵,可使酱醪中木糖含量分别降低22%～30%和51%～60%,葡萄糖含量则分别增加52%～94%和79%～150%(图6-b)。虽然用谷朊粉替换豆粕发酵的酱醪中葡萄糖含量有显著增加,由于木糖含量的减少,50%谷和100%谷实验组的褐变指数分别比对照降低14%～25%和42%～56%(图6-c)。此外,用50%谷和100%谷替换豆粕发酵的酱油中美拉德反应的另一前体氨基酸的总量显著高于对照组(图6-d)。能观察到100%谷实验组所得酱油的颜色明显淡于对照(图7)。在最终所得酱油中,50%谷和100%谷实验组的褐变指数分别比对照低21%和44%,色率比对照低19%和39%,并且50%谷实验组的红色指数和黄色指数也高于对照(表1)。上述结果说明,木糖是高盐稀态酱油发酵过程中通过美拉德反应产生褐变的主要糖类前体,而在酱油发酵过程中通过减少木糖含量可显著减弱酱油的褐变。
表1 酱油理化及颜色指标比较
Table 1 Comparison of physiochemical and color properties of soy sauce
组别氨基酸态氮/(g/100 g)总酸/(g/100 g)褐变指数色率/EBC红色指数黄色指数对照0.86±0.010.83±0.040.88±0.0236947±4533.39±0.115.91±0.0550%谷1.01±0.010.84±0.010.69±0.0130105±2103.41±0.086.04±0.10100%谷1.12±0.020.66±0.010.49±0.0122868±5792.84±0.135.61±0.12
a-不同原料的戊聚糖含量;b-原料替换酱油发酵过程中葡萄糖和木糖含量的变化;c-原料替换酱油发酵过程中褐变指数的变化;d-原料替换酱油中氨基酸的种类与含量
图6 酿造原料戊聚糖含量分析及其对酱油颜色相关指标的影响
Fig.6 Analysis pentosan content in fermentation materials and investigation of the effect of materials on color-related indexes of soy sauce
图7 酿造原料对酱油颜色的影响
Fig.7 Effect of materials used for fermentation on the color of soy sauce
3 结论
酱油发酵过程的褐变反应是其颜色形成的主要反应之一,包括酶促褐变反应和非酶褐变反应等。研究发酵过程的褐变反应有助于调控酱油颜色的形成,提升酱油品质。本研究通过研究酱油发酵过程的褐变规律和分析反应类型,确定了非酶褐变反应是高盐稀态酱油发酵过程中主要的褐变反应类型。在此基础上考察了不同前体物质产生褐变的能力,并研究了用不同原料发酵调控体系中木糖含量对酱油褐变的影响,证实了木糖是高盐酱油发酵过程中通过美拉德反应产生褐变的主要糖类。本研究结合酱油发酵过程的实际情况,确定了酱油发酵过程的主要褐变类型与影响褐变的主要糖类,并在酱油发酵过程中通过减少美拉德反应的前体减弱了酱油的褐变,对今后在发酵过程调控酱油颜色的生成和进一步揭示酱油颜色形成机制具有重要参考价值。
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