烟熏液,亦称烟熏香味料。是由诸如梨木、核桃壳等天然植物为原料,经过干馏与提纯工艺精炼而得。在使用时,可以通过添加、喷淋、浸渍等方式将这种液体烟熏香味料加入到所需熏制处理的食品中,如肉类、鱼类、蔬菜等。它可以为食品提供独特的烟熏香味,增加食品的口感和风味,同时还可以起到防腐、抗氧化等作用[1]。烟熏液这种液体香料含有许多化学成分,主要包括酚、醛、酮、醇、酸、酯和呋喃类等化合物。这些化合物的相互作用使得烟熏液具有独特的烟熏风味。相较于传统烟熏工艺,烟熏液有效地解决了焚烧木材时产生的大量烟雾对环境的污染问题,同时消除消费者在烟熏过程中接触到的3,4-苯并(a)芘等多环芳烃类致癌物质对健康的潜在威胁[2]。
目前,我国的烟熏液品种较为有限,其中唯一获得国家批准使用的烟熏液为山楂核烟熏香味料[3]。因此,为了丰富烟熏液的品类,促进果木资源的高效利用。本研究以新疆特色果木香梨木、海棠木、核桃壳和红柳枝为原料,采用干馏热解法的方式制备烟熏液,通过分析其理化性质和挥发性风味物质的差异,为烟熏液的研究及其在未来食品工业中的推广应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香梨木,采自新疆巴音郭楞蒙古自治州库尔勒沙依东园艺场;海棠木,采自新疆昌吉回族自治州玛纳斯;核桃壳,采自新疆阿克苏地区;红柳枝,采自新疆巴音郭楞蒙古自治州尉犁县。
盐酸羟胺、氢氧化钾、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、无水碳酸钠均为国产分析纯级,天津市致远化学试剂有限公司;乙腈、二氯甲烷、正己烷、甲苯(色谱纯),天津市大茂化学试剂厂;福林酚试剂,索莱宝专业生化试剂厂;苯并(a)芘分析标准品、大孔吸附树脂XAD-4,上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
定制电热套,海宁市华星仪器厂;Color i7色差仪,美国X-rite公司;xMark酶标仪,美国Bio-Rad公司;D-9403B紫外仪,北京市六一仪器厂;SHZ-B水浴恒温振荡器,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;SZCL数显智能控温磁力搅拌器,上海力辰邦西仪器科技有限公司;LC-20A高效液相色谱仪、荧光检测器、Shim-pack GIST C18液相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm),日本岛津公司;FlavourSpec®风味分析仪,德国G.A.S 公司;摇摆式高速万能粉碎机,北京市永光明医疗仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大孔吸附树脂的预处理
将适量的大孔吸附树脂放入锥形瓶中,加入95%(体积分数)的乙醇进行24 h的浸泡处理,以实现大孔吸附树脂的完全溶胀。然后,采用95%的乙醇进行清洗,直至清洗液与水体积比为1∶5混合后无白色沉淀出现。用蒸馏水进行清洗,直至无乙醇气味。分别用3倍体积的5%(体积分数)HCl溶液和2%(体积分数)NaOH溶液进行2 h的浸泡,再用蒸馏水清洗至中性,备用[4-5]。
1.3.2 烟熏液制备工艺
以香梨木、海棠木、核桃壳和红柳枝为原料,对其进行清洗整理锯成4 cm的木条,平铺整齐放于鼓风干燥箱中100 ℃烘干至含水量为5%～10%,再将其放入粉碎机中粉碎,过10目筛。将300 g的香料粉末放入容量为1 L的圆底烧瓶中,随后将其置于电热套内并连接冷凝装置。升高温度至450 ℃,并进行干馏过程,直至无烟雾释放。最后,通过冷凝收集烟熏原液。将烟熏原液在-5 ℃环境下静置24 h,以实现烟熏成分与焦油的完全分离。在取出样品后,将其恢复至室温,并采用双层滤纸实施缓慢过滤[6-7]。经过12 h的静置,再次进行过滤以实现精制过程的完成。将10 mL过滤精制的烟熏液加入1 g预处理过的XAD-4大孔吸附树脂,在32 ℃条件下,利用摇床以120 r/min的速率进行 24 h的振荡。随后,采用双层滤纸对大孔吸附树脂进行慢速过滤,得到精制烟熏液,以便进行各项指标的测定。
1.3.3 pH值测定
将10 mL烟熏液倒入烧杯,然后将酸度计垂直置于烟熏液中,确保其电极完全浸泡,持续直至酸度计显示稳定测量值,随后记录所测数值。该操作重复3次,取其平均值。
1.3.4 色泽测定
将色差仪精准置于洁净且干燥的操作台面上,遵循标准程序对设备进行校准。在样品充分混合之后,将其注入石英比色皿,并将比色皿置于检测池以开展测试。通过仪器分别测定L*值、a*值和b*值[8]。
1.3.5 可溶性固形物测定
参照ISO 2173—2003《水果和蔬菜制品可溶性固形物含量的测定》测可溶性固形物含量。
1.3.6 酚含量测定
参考高志远等[9]和周兵[10]的方法,采用福林酚法测定酚含量,略作修改。将烟熏液稀释至100倍,配制1 mg/mL没食子酸母液,再分别配制质量浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的没食子酸标准液。吸取样液或没食子酸标准液200 μL,加入1 mL 15%(体积分数)福林酚试剂,充分混合,反应10 min。随后,加入800 μL 50 g/L的碳酸钙溶液,再次充分混合。将混合物置于室温下,并在避光条件下放入摇床,以120 r/min的速度振荡2 h。接着,在96孔板中每孔加入250 μL混合物,利用酶标仪在765 nm波长下测定吸光度。酚含量计算如公式(1)所示:
酚含量/(mg/mL)=d×X×0.001
(1)
式中:d为稀释倍数;X为样品根据没食子酸标准曲线换算结果,μg/mL;0.001为换算系数。
1.3.7 羰基化合物测定
参照GB 1886.127—2016《食品安全国家标准 食品添加剂 山楂核烟熏香味料Ⅰ号、Ⅱ号》中的盐酸羟胺法测羰基化合物含量。
1.3.8 3,4-苯并(a)芘测定
参照GB 5009.27—2016《食品安全国家标准 食品中苯并(a)芘的测定》进行检测操作。将样液按照国标中油脂及其制品的制备、提取及净化进行操作,在经过0.45 μm微孔滤膜过滤后,采用高效液相色谱法检测烟熏液中苯并(a)芘含量。
采用C18液相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为V乙腈∶V水=88∶12,流动相流速设定为1.2 mL/min。荧光检测器的激发波长为384 nm,发射波长为406 nm;柱温控制为30 ℃;进样量为10 μL。
1.3.9 气相离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)分析条件
样品处理:分别取出10 μL的待测烟熏液样本,将其稀释至10 mL,接着取1 mL稀释液置于20 mL顶空瓶内,然后在60 ℃的条件下孵育10 min,最后进样分析。
气相离子迁移谱单元条件:色谱柱类型 FS-SE-54-CB-0.5 15 m ID:0.53 mm;柱温60 ℃;载气/漂移气N2;IMS温度45 ℃。
自动顶空进样单元:进样体积1 mL;孵育时间10 min;孵育温度60 ℃;进样针温度65 ℃;孵化转速500 r/min。
1.3.10 定量描述感官评价法
采用定量描述感官分析法(quantitative descriptive analysis,QDA),由实验团队中经过感官培训的12位同学(6男,6女)组成感官评定小组,结合烟熏液的感官特点及消费者用语习惯建立烟熏液感官描述词术语(如烟味、灰烬味、木味、霉味、土味、焦味、呛鼻、刺鼻、石油味、沥青味、香柏味、苦味、金属味和酸味等)[11]。经过2～3轮的筛选,全体评估成员通过讨论最终确定5个描述性词汇表,根据术语表中感官属性的定义对烟熏液样品进行定量描述分析。
1.4 数据处理
采用GC-IMS仪器配套的分析软件Libraries search及3款插件,从多角度对样品展开分析。Libraries search软件用于解析分析谱图及数据定性定量,利用内置NIST数据库和IMS数据库实现物质定性分析;Reporter插件用于直接比较样品间的谱图差异;Gallery Plot插件用于指纹图谱比对,直观且定量评估不同样品间挥发性有机物的差异;Dynamic PCA插件实施动态主成分分析(principal component analysis,PCA),以实现样品聚类分析及未知样品种类的快速鉴定。使用OriginPro 2021软件绘制折线图;使用SPSS 26软件进行基本的数据处理。
2 结果与分析
2.1 不同烟熏液理化指标分析
2.1.1 不同烟熏液物理指标分析
烟熏液pH值和产品的酸度有关,pH值越低,产品的酸度越低,越有利于其抗氧化性和抑菌性。目前市面上的烟熏液通常为酸性,其pH值为1.5～5.5,如赵冰等[12]研究了市面上的4种烟熏液pH值为2.24～2.56。如表2所示,自制的4种烟熏液的pH值为2.15～2.94,都呈酸性,与市面上的烟熏液差别不大。烟熏液的酸性特质主要取决于其生产工艺,生物质材料在高温环境下分解产生有机酸,使烟熏液呈现酸性[13]。
亮度值L*描述烟熏液中的明暗程度,即色泽深浅[14]。4种烟熏液产品的L*值为11.08～19.97,核桃壳烟熏液L*值最高为19.97,香梨木烟熏液L*值最低为11.08。红度值a*为4.66～13.87。其中,海棠木烟熏液的a*值最低,为4.66,而核桃壳烟熏液的a*值最高,达到13.87。此外,4种烟熏液产品的黄度值b*分布在7.25～22.45,香梨木烟熏液的b*值最低,为7.25,核桃壳烟熏液的b*值最高,为22.45。
可溶性固形物是衡量烟熏液中有机化合物含量的一个指标[15]。4种烟熏液中可溶性固形物含量为10.33%～18.67%,4种烟熏液的可溶性固形物含量大小为红柳枝烟熏液>核桃壳烟熏液>香梨木烟熏液>海棠木烟熏液。
2.1.2 不同烟熏液中总酚含量分析
研究发现,许多熏制产品和烟熏液中都含有酚类化合物,这些化合物被认为是烟熏风味的主要成分[16]。因此,烟熏风味的浓郁程度在一定程度上取决于酚类化合物含量的多少。由表1可知,红柳枝制备的烟熏液总酚含量最高,达到了17.88 mg/mL,其次为核桃壳烟熏液,海棠木烟熏液总酚含量最低,为12.50 mg/mL。相较于赵冰等[12]的研究以及市场上购买的4种烟熏液(4.15～9.80 mg/mL的酚含量),自制烟熏液具有较高的总酚含量。
图1 烟熏液中总酚含量(以没食子酸表示)
Fig.1 Total phenol content in smoke liquid (expressed by gallic acid)
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
表1 烟熏液的感官评价表
Table 1 Sensory evaluation table for smoke liquid
感官评价指标定义评分尺度(0^6表示气味值由弱至强)烟味 一种由木材熏制而产生的特定风味,可能具有刺鼻、呛鼻等风味、略带灰烬味木味 一种与木材、树皮相关的特定风味,往往具有霉味等风味(如木香味)焦味 一种由食品经过度加热变焦发黑而产生的特定风味,往往具有尖锐、苦和酸的感觉酸味 以柠檬酸为典型代表(如牛奶和酸水果味)香柏味一种与香柏相关的特定风味,往往具有轻微的甜和煳味的感觉0 不存在;1 可识别;2 气味弱;3 气味中等;4 气味稍强;5 气味强;6 气味浓郁
表2 不同烟熏液物理指标测定
Table 2 Determination of physical indicators of different smoke liquids
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
类别pH值亮度值L∗红度值a∗黄度值b∗可溶性固形物/%香梨木2.91±0.01b11.08±0.20c7.61±0.08c7.25±0.10d12.17±0.28c海棠木2.94±0.00a15.27±0.59b4.66±0.39d15.06±0.79c10.33±0.28d核桃壳2.62±0.02c19.97±0.63a13.87±0.67a22.45±1.34a16.83±0.28b红柳枝2.15±0.01d19.44±1.30a12.16±0.73b19.16±1.80b18.67±0.28a
2.1.3 不同烟熏液中羰基化合物分析
烟熏过程中的主要色泽形成反应是醛和氨类化合物之间的反应,因此,烟熏液中羰基化合物的含量与产品的颜色有着密切的关系[17]。烟熏液的羰基含量如图2所示,核桃壳的羰基含量最高,达到了18.57 g/100 mL,其次为红柳枝,海棠木和香梨木次之,香梨木的羰基含量最低,为14.96 g/100 mL。自制烟熏液的羰基化合物含量显著高于赵冰等[12]所提及的市售四种烟熏液,范围为3.16～8.22 g/100 mL。
图2 烟熏液中羰基化合物含量(以庚醛表示)
Fig.2 Carbonyl compound content in smoke liquid (represented by heptyl aldehyde)
2.1.4 不同烟熏液中3,4-苯并(a)芘分析
众多研究表明,大部分烟熏食品中都发现了对人体具有危害性的多环芳烃化合物,如苯并(a)芘等[18]。这主要是因为烟熏材料在燃烧过程中会产生各种多环芳烃。现阶段,研究的核心与难题在于如何有效调控烟熏和烧烤食品中苯并(a)芘的含量[19]。在本研究中,烟熏液制备过程采用XAD-4大孔吸附树脂进行吸附处理。因此,采用高效液相色谱法按照国家标准对产品中的苯并(a)芘进行检测,结果发现在4种烟熏液中均未检测到苯并(a)芘的存在。
2.2 不同烟熏液感官评价分析
图3是4种烟熏液的感官评估结果,由图3可以观察到,不同木材制备的烟熏液在感官评价上有显著的差别,特别是酸味、焦味和木味这3个方面表现尤为突出。由于红柳、香梨木、海棠木和核桃壳各自独特的木质香气,它们制成的烟熏液都带有特定的木味和焦味。然而,红柳枝烟熏液的木味和焦味比其他木材的烟熏液更浓烈。香梨木烟熏液由于源自果木,其清甜和香柏味超过了其他木材的烟熏液。海棠木烟熏液的酸味更浓,而木味和焦香味则比其他烟熏液低。核桃壳烟熏液的香气分布均匀,风味多样,因此在感官评价中,核桃壳烟熏液更受欢迎。
图3 4种烟熏液的感官评价结果
Fig.3 Sensory evaluation results of four smoke liquids
2.3 不同烟熏液挥发性风味物质分析
2.3.1 不同烟熏液挥发性化合物定性结果
根据GC-IMS检测数据,4种烟熏液中鉴定出71种挥发性物质,其中65种成分被定性,另有6种成分未能在数据库中匹配,故无法定性,具体数据见附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038988)。在这些挥发性成分中,包括酚类化合物2种、醛类化合物12种、酯类化合物7种、酮类化合物10种、醇类化合物15种、酸类化合物3种、呋喃类化合物4种、吡嗪类化合物4种等。这些挥发性有机化合物共同形成了4种烟熏液的独特风味特征。
2.3.2 不同烟熏液GC-IMS指纹图谱分析
为了揭示烟熏液样品中差异存在的具体成分,图4展示了选取所有峰进行指纹图谱比对的结果。整个指纹图谱展示了各样品的完整挥发性有机物信息,以及样品之间在挥发性有机物方面的差异情况。在指纹图谱中,每一行代表一个样品中选取的全部信号峰,每一列则表示同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰。
图4 4种烟熏液的挥发性有机物的指纹图谱
Fig.4 Gallery plot of volatile organic compounds in four smoke liquids
注:图中物质从左到右中文名称:(1)-甲乙酮;(2)-糠醛;(3)-异戊醛;(4)-3-羟基-2-丁酮;(5)-乙醇;(6)-丙醛;(7)-正丁醛;(8)-环戊酮; (9)-2,5-二甲基吡嗪;(10)-反式-2-戊烯醛;(11)-3-戊酮;(12)-4-甲基噻唑;(13)-5-甲基-2-糠醛;(14)-2-戊酮;(15)-2-甲基丙烯醛; (16)-环戊酮;(17)-2-甲基-3-甲硫基呋喃;(18)-#[68](未定性);(19)-糠醇;(20)-2-甲基吡嗪;(21)-乙酰乙酸乙酯;(22)-2-甲基-2-戊烯醛; (23)-#[66](未定性);(24)-2-乙基呋喃;(25)-#[67](未定性);(26)-#[70](未定性);(27)-二丙基硫醚;(28)-丁酸;(29)-#[69](未定性); (30)-四氢呋喃;(31)-2,5-二甲基呋喃;(32)-正丙醇;(33)-2-乙酰基-1-吡咯啉;(34)-#[71](未定性);(35)-2-乙基吡嗪;(36)-2-甲基丁酸; (37)-异丙叉丙酮;(38)-1-戊烯-3-醇;(39)-糠醇;(40)-3-甲硫基丙醛;(41)-乙二醇二甲醚;(42)-1-辛烯;(43)-正丁醇;(44)-乙酸甲酯; (45)-3-己酮;(46)-正戊醛;(47)-正戊醇;(48)-丙酸乙酯;(49)-正己醛;(50)-四氢噻吩(THT);(51)-乙酸乙酯;(52)-2,3-戊二酮;(53)-乙苯; (54)-苯乙烯;(55)-异丁醇;(56)-2-甲基-1-戊醇;(57)-2,3,5-三甲基吡嗪;(58)-二烯丙基硫醚;(59)-3-甲基-2-环戊烯-1-酮;(60)-正己醇; (61)-反式-3-己烯-1-醇;(62)-3-甲基-1-戊醇;(63)-乙酸异丁酯;(64)-丙酸;(65)-醋酸异丙酯;(66)-仲丁醇;(67)-3-甲基-2-丁醇; (68)-3-甲硫基丙酸甲酯;(69)-愈创木酚-M;(70)-愈创木酚-D;(71)-苯甲醛。
如图4所示,这4种烟熏液中检测出共71个信号峰,其中定性出65种挥发性物质,a区域为4种烟熏液的共有风味特征峰区域,有14种挥发性物质,分别是甲乙酮、糠醛、异戊醛、3-羟基-2-丁酮、乙醇、丙醛、正丁醛、环戊酮、2,5-二甲基吡嗪、反式-2-戊烯醛、3-戊酮、4-甲基噻唑、5-甲基-2-糠醛、2-戊酮。烟熏液中的羰基化合物主要贡献在于对产品色泽的深浅起决定作用,同时也对风味产生一定的影响,如糠醛及5-甲基-2-糠醛作为肉制品风味构成的关键成分,分别具有甜味、木香、焦糖香和烘烤食品气息的特性,同时在提升烟熏风味方面亦发挥作用。其中含量较高的甲乙酮具有刺激性气味、水果香气和新鲜清香香气[20]。感官评价结果也显示具有木香味、焦香味浓烈的特征[21]。
苯乙烯、异丁醇、2-甲基-1-戊醇、2,3,5-三甲基吡嗪、二烯丙基硫醚、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、正己醇、反式-3-己烯-1-醇、3-甲基-1-戊醇、乙酸异丁酯、丙酸、醋酸异丙酯、仲丁醇、3-甲基-2-丁醇、3-甲硫基丙酸甲酯、愈创木酚、苯甲醛等构成b区域,为香梨木烟熏液风味特征峰,其醇类化合物和酯类化合物较为丰富,与有机酸一样,这类化合物也具有杀菌的功效[22]。然而,醇类化合物和酯类化合物在烟熏液中的含量较为稀少,因此对于烟熏液风味的贡献相较于酚类和醛类而言微乎其微[23]。这类化合物在烟熏液的整体香气中主要扮演着协同和调和的角色。如其中异丁醇呈苹果、麦芽香气[24];2-甲基-1-戊醇具有淡淡的青草香气;
丁酸、四氢呋喃、2,5-二甲基呋喃、正丙醇、2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙基吡嗪、2-甲基丁酸构成c区域,为海棠木烟熏液风味特征峰,而其中丁酸和2-甲基丁酸常见的酸性香气物质[25],感官评价结果也表明海棠木烟熏液酸味更重一些。正丁醇、乙酸甲酯、3-己酮、正戊醛、正戊醇、丙酸乙酯、正己醛构成d区域,为核桃壳烟熏液和红柳枝烟熏液的共有风味特征峰,而这些化合物大多呈果香和青草香。1-戊烯-3-醇(水果香味)、糠醇(焦香)、3-甲硫基丙醛(蔬果香)、乙二醇二甲醚构成e区域,为红柳枝烟熏液的风味特征峰,其中糖醇具有焦糖的香气[26],红柳枝烟熏液在这几种烟熏液中糖醇阙值要高一些,和感官评价结果一致,红柳枝烟熏液的焦糖香气更重一些。
2.3.3 不同烟熏液GC-IMS PCA
图5展示了4种烟熏液的PCA结果。PC1和PC2的方差贡献率分别为46%和30%,累计方差贡献率为76%,说明PCA的有效性。由图5明显观察到,除了香梨木烟熏液重复性较低,其他样本的3次重复试验结果紧密堆积在一起,这表明实验的可重复性非常高,具有很强的说服力。该图直观地揭示了各个样品之间的差异程度,样品之间的紧密程度越高,说明差异越小;反之,距离较远则表示差异较为显著[27]。这4个样品的间隔较小说明风味物质比较相似,但仍有差异,与指纹图谱分析的结论相符。
图5 4种烟熏液PCA图
Fig.5 PCA charts for four types of smoke liquid
3 结论
随着市场上对烟熏食品需求的逐年增长,果木烟熏液作为一种新型的烟熏剂,可以满足消费者对食品口味和健康的需求,因此本研究以香梨木、海棠木、核桃壳和红柳枝为原料分别制备烟熏液。相较于市面上的烟熏液产品,这4种烟熏液在pH值、羰基化合物含量、酚类化合物含量、以及苯并(a)芘浓度等方面具有更出色的品质。在所检测的4种烟熏液中,共鉴定出65种挥发性成分,主要包括酚类、醛类、酮类、醇类和酯类。关键风味成分主要为糠醛和5-甲基-2-糠醛,分别带有甜味、木香、焦糖香气和烘烤食品的气味,有助于增强烟熏风味。其中香梨木烟熏液中酯类和醇类较多,而糠醛在核桃壳烟熏液中含量较高,具有浓郁的焦糖香气。这4种烟熏液的挥发性有机物质存在差异,聚类热图分析直观地验证了指纹图谱及主成分分析结果。通过感官评价结果可知,核桃壳烟熏液的香气分布均匀,风味多样,更受欢迎。总的来说,核桃壳是核桃仁加工过程中的副产品,通常这些核桃壳被当作废弃物丢弃或焚烧,导致资源浪费。为了充分利用这种生物资源,可以通过干馏方法将其转化为核桃壳烟熏液,这不仅丰富了烟熏液的种类,还为核桃壳资源的高效利用开辟了新的道路。
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