复合柑橘精油透明微乳的制备及相关机理探究

柑橘是我国产量最大的水果之一,柑橘果皮中富含的柑橘精油(citrus essential oil,CEO),具有清新的香气和抑菌特性,被美国食品药品监督管理局认为是普遍安全的[1],因此在食品、饮料及化妆品中被广泛应用[2]。柑橘精油丰富的香气90%源自疏水性香气化合物,然而这些物质难溶于水,因此柑橘精油在水溶性体系尤其是透明饮料中的应用受到了极大的限制。

在实际生产中,为了增强柑橘精油的水溶解度,工厂选择水洗法来洗去精油中的难溶于水的萜烯类物质,用醇类溶解剩余的香料,制成水溶性香精[3]。但水溶性香精失去了油溶性的萜烯类物质,香气丰富度大大降低。此外乙醇等溶剂还有刺鼻的味道,生产过程中面临有机溶剂处理和安全的问题。封装复合柑橘精油能够改善以上问题,封装能够增加精油对产品的适用度和安全性。纳米乳液和微乳液是常见的疏水性化合物的溶解体系。纳米乳液粒度在200 nm左右,通过高压均质[4]、超声[5]、微射流[6]、自乳化[7]等方法制备,存在香气化合物发生降解或氧化的问题,且纳米乳液热力学不稳定,应用到产品中时易引起浑浊,改变产品性状,降低产品品质。

与纳米乳液不同,微乳液在成分和环境条件的特定组合下具有热力学稳定性,并且可以通过低能量法制备,如搅拌,混合水、油、助表面活性剂和表面活性剂就能形成。因此,微乳液具有耐贮存和降低生产成本等优点[8]。

微乳液的粒度通常在2～50 nm的范围内,具有良好的透明度,因此被广泛应用在药物、化妆品和石油回收等领域[9]。微乳香精中存在大量的油水界面,一般需要20%～50%的食品级非离子表面活性剂来稳定,而大量的表面活性剂不仅生产成本高且不利于绿色生产,因此降低表面活性剂的用量及提高微乳增溶量成为了人们的研究重点。

胶束溶油的趋势取决于其形状和大小。非球形胶束(如椭球形或圆柱形胶束)可以增强油的溶解性[10]。影响胶束相和水相之间分子分配的主要因素是log P[11]。根据目前的报道发现,亲水分子(log P<2)位于胶束的极性头部基团中,对胶束形状和大小影响不大;具有中间极性的分子(2P<3.5)位于栅栏层中,降低胶束曲率改变胶束形状;而疏水分子(log P>3.5)溶解在胶束核心中,增加曲率引起胶束膨胀[12]。之前的研究大多都局限于单一油相的亲疏水性[13]、饱和度[14]以及极性[15]对胶束增溶的影响。目前尚未发现复合柑橘精油的性质对表面活性剂自组装影响规律的研究。

本研究选取了甜橙精油(sweet orange essential oil,SEO)、瓯柑精油(tangerine essential oil,TEO)和柠檬精油(lemon essential oil,LMO)3种柑橘精油,3种精油在相同条件下的最大增溶量存在显著差别。本研究以log P值为核心衡量标准,探究了其对表面活性剂自组装的影响机制并对这3种透明微乳进行了表征,并探讨了天然复合柑橘精油微乳的增溶机制,揭示了复合油类对表面活性剂作用机制的深刻影响。这一研究成果对于推动天然精油在水溶性体系中的广泛应用及产业化贡献方面具有重要的理论意义和实践价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

吐温-80(化学纯)、1,2-丙二醇(分析纯),上海国药试剂;SEO、TEO、LMO,吉水县健民天然香料油厂;实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

TU-1810型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;LSA100视频光学接触角张力测量仪,德国LAUDA Scientific公司;VP-ITC等温滴定量热仪、ZETASIZER PRO纳米粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;SAXS point 2.0小角X射线散射仪,奥地利安东帕公司;7890B GC System-5977B GC/MSD气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦公司;密度计,上海华辰医疗器械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 柑橘精油微乳的制备

在质量分数为10%吐温-80中分别加入质量分数为2%～10%的3种精油,搅拌均匀为油相。在水相中加入质量分数为3%的丙二醇,剩余为蒸馏水。磁力搅拌器设置为40 ℃,采用注射器将油相滴入搅拌中的水相,滴定后持续搅拌4 h以保证体系的稳定。

1.3.2 最大增溶量的测定

柑橘精油在质量分数为5%吐温-80胶束溶液中的最大增溶量使用紫外可见分光光度计来测量[16]。将3种精油分散在吐温-80溶液中,以空白的吐温-80溶液调零,在紫外分光光度计中测量3种精油的吸光度,并制备相应标准曲线。室温下,将过量的精油加入质量分数为5%的吐温-80水溶液中,平衡3 d,然后取下层水相,测定吸光度进行定量,计算出3种精油在质量分数为5%的吐温-80水溶液的最大增溶量。

1.3.3 精油基本性质的测定

在室温25 ℃下,使用密度计测定所有液体的密度值;使用接触角张力仪测量精油的油水界面张力,取稳定1 h后的值为油水界面张力;辛醇-水分配系数的测定:溶剂的预饱和;将正辛醇和水在振荡器上混合,24 h后静置分层,分出被正辛醇饱和的水和被水饱和的正辛醇,备用。试样的处理;分别称取约1 g精油置于250 mL具塞锥形瓶中,加入一定体积经水饱和的正辛醇充分溶解后,选择正辛醇与水的1∶1体积比进行精油的分配系数试验,每组设置2个平行。将上述试样的锥形瓶置于已恒温至25 ℃的摇床中振荡24 h,使精油在两相中充分溶解并达到平衡后转入分液漏斗中静置分层,分离两相,采用紫外分光光度计的定量法测定水相中精油的浓度。通过接触角张力仪测量了吐温-80的临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)。在不同浓度的吐温-80溶液中分别加入质量分数为1%的精油,并对吐温-80的CMC进行测定。

1.3.4 等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)

使用等温滴定微量热计研究吐温-80分子增溶质量分数为1%精油水溶液的热力学参数变化。对于分配实验,量热计的样品池最初加入质量分数为1%精油水溶液(1 400 μL),然后通过注射器将质量分数为10%吐温-80水溶液以10 μL的每一部分连续注入搅拌的样品池中。在滴定过程中,用推进器以50 r/min搅拌样品池中的溶液,2次进样之间的间隔足够长以使信号返回基线。观察到的焓变化(ΔH)是通过对热功率对时间的曲线图中的峰面积进行积分而获得的。实验的重现性在4%以内。在(25.00±0.01)℃下记录所有测量值。

1.3.5 小角X射线衍射(small angle X-ray scattering,SAXS)

通过SAXS研究了负载质量分数为1%精油的微乳样品。使用SAXS point 2.0进行实验,探测器为Eiger 1M。对溶剂的背景散射进行校正,使用SAXS analysis软件分析散射图案并归一化数据。通过Sas View软件进行圆球和椭球模型拟合,得到微乳粒子相关半径[17]。

1.3.6 动态散射光(dynamic light scattering,DLS)

通过纳米粒度仪在背散射光下研究了精油微乳粒径大小。测量前使用去离子水将微乳稀释100倍。表观流体动力学半径Rh通过Stokes-Einstein关系由扩散系数获得,按公式(1)计算:

式中:k,玻尔兹曼常数;T,绝对温度;η,溶剂黏度,这里近似为水的黏度。

采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)的方法萃取3种精油的挥发性成分。将精油样品在己烷中以1∶100的液液比稀释,将样品(10 mL)置于20 mL SPME瓶中,同时将萃取头插入顶空瓶中吸附50 min,解析时间3 min。色谱条件:HP-5MS色谱柱,在40 ℃保持2 min,以10 ℃/min的速率升温至280 ℃,保持15 min,分流比10∶1,进样口温度250 ℃,载气高纯氦,流速1.2 mL/min。质谱条件:EI电离源,离子源温度280 ℃,传输线温度280 ℃,电子轰击能量70 eV,全扫描模式,质量范围33～350。

实验数据通过Excel 2013软件进行数据处理,采用Origin 2020绘图。

2 结果与分析

2.1 三种精油的最大增溶量

在室温25 ℃的条件下测定了3种复合柑橘精油的最大增溶量,如图1所示。将相同质量的3种复合精油分别添加到含有质量分数为10%吐温-80的水溶液中,静置24 h。除去表面漂浮的精油,利用紫外分光光度计测量吐温-80水溶液中精油的最大增溶量。结果显示,SEO的最大增溶量为7.5 g/L,TEO的最大增溶量12.8 g/L,LMO的最大增溶量为23.1 g/L。3种复合精油的最大增溶量的顺序为:SEO

2.2 复合柑橘精油组成

使用GC-MS技术对3种精油的挥发性成分进行分析,如图2-a所示。通过将复合精油分离成单个组分来确定分离成分的含量和化学组成,并与观察到的增溶行为相关联。GC-MS结果表明,3种复合精油中都大约存在40种物质,主要成分为D-柠檬烯、β-月桂烯、γ-松油烃、柠檬醛和芳樟醇等,与BORA等[18]的研究结果一致。柑橘精油是一种非常复杂的混合物,其90%～95%都为可挥发性化合物(单萜和倍半萜烃及其氧化衍生物以及脂族醛、醇酯),按照官能团可将其分成萜烯烃、酯、醇和醛。烃类物质是柑橘精油的主要组成化合物,SEO的烃类物质含量为96.41%,TEO为95.36%,LMO为85.76%。D-柠檬烯是3种精油中含量最多的萜烯烃,SEO的含量为89.92%,TEO的含量为86.83%,LMO的含量为78.29%。AKAMATSU等[19]发现,D-柠檬烯增溶在胶束的疏水核心。SEO中含有少量的醇、醛、酯,含量分别为1.14%、1.31%、0.74%,总量为3.19%,是3种复合精油中含氧化合物含量最少的。TEO中含有2.3%的醇,醛和酯的含量分别为1.33%和0.29%,总量为3.92%。LMO中含有12.25%的醛类物质,其中柠檬醛占精油组成的9.94%。LMO中还含有0.9%的醇类物质,几乎不含有酯类物质,总量为13.15%。3种精油化合物组成不同导致其水溶解度各不相同,精油中的主要物质D-柠檬烯,难溶于水,而醛、酯以及醇等这类化合物微溶于水。根据图2-b可得3种精油的水溶解度的顺序为:SEO

2.3 复合柑橘精油的增溶位点

辛醇-水分配系数(log P)是一个广泛使用的热力学参数,用于衡量被增溶溶质疏水性的量度,log P不同,精油在胶束中增溶的位置也不同。如图3-a所示3种柑橘精油中SEO的疏水性最强,其次是TEO,最后是LMO;3种精油密度大小与精油中含氧基团的含量成正相关的关系,如图3-b所示SEOH大小顺序为LMO>TEO>SEO,这是因为疏水相互作用越强,香气化合物越倾向于增溶在胶束核心,ΔH越小。当胶束化合物增溶在胶束核心时,胶束的有序度被打乱。香气化合物在胶束核心增溶量越大,混乱程度越高。表1显示熵增SEO>TEO>LMO,证明SEO精油在胶束核心增溶的量最多。对3种精油增溶的自由能进行了计算,发现其大小与其疏水性一致,SOFRONIOU等[20]发现具有较高对数log P值(即较高疏水性)香气化合物更能驱动O/W微乳的形成。因此精油疏水性越强,增溶越自发,ΔG的大小顺序为SEO

2.4 复合柑橘精油的界面特性

对3种精油的油水界面张力进行测量,如图4-a所示,精油油水界面张力的大小顺序:SEO>TEO>LMO。因为SEO疏水性强,所以油水界面张力最大;TEO及LMO中含有醇酯醛等两亲物质,可定位在界面减小界面张力。复合柑橘精油的log P与油水界面张力成正比。吐温-80的临界胶束质量浓度为1.4 mg/L。当增溶复合精油时,吐温-80的含量要达到其CMC,才可起增溶作用,因此测定了溶液中含有质量分数为1%(下同)三种不同种类精油时吐温-80的CMC,依次如图4-b～图4-d所示。当在不同浓度的吐温-80溶液中加入1%的精油之后,溶液中疏水面积增加,3种精油的吐温-80的临界胶束浓度增加。3种精油中,含SEO的吐温-80 CMC最高,为2.4 mg/L;含TEO的CMC较含SEO的低,为2.2 mg/L。而含LMO的CMC最低,为2.0 mg/L。吐温-80的CMC与油水界面张力有关。当油水界面张力低时,油更容易在界面处结合,表面活性剂临界胶束浓度降低。吐温-80的CMC也受化合物增溶位置的影响。EDRIS发现萜烯类增溶在胶束核心,引起胶束核心膨胀,聚集数增大[21]。SEO中大部分化合物都增溶在胶束核心,因此胶束聚集数大,临界胶束浓度高。精油中的两亲化合物如萜烯醇等可以增溶在胶束栅栏处,因此TEO和LMO胶束聚集数小,临界胶束浓度低。LMO的log P为2.63,其胶束核心的体积需求量最少;LMO中醛类物质的含量为12.25%,FAN等[12]认为,log P范围为2～3.5的能增加体系中胶束的数量,因此LMO的CMC最低。

2.5 增溶胶束的微观结构

将质量分数为1%的3种复合精油增溶到质量分数为10%的吐温-80胶束后,通过SAXS得到的散射强度如图5所示。当SEO和TEO增溶在吐温-80胶束中时,仅散射强度略有增加,表明精油进入胶束内核使其溶胀。当加入LMO时,散射峰变向低q区偏移,此现象表明聚集体之间的相互作用减小,有更大的聚集体形成。同时将归一化后的数据用Sas View软件的模型拟合,图5显示了X射线散射强度I(q)和GIFT拟合(实线),可以看出,SEO和TEO的胶束与圆球模型拟合良好,LMO的胶束与椭球模型拟合良好,说明SEO和TEO胶束为球形,LMO胶束为椭球形。当精油中的两亲性分子的极性基团优先位于胶束表面时促进了较低平均表面曲率的聚集体(棒状、盘状)的形成[22]。因为LMO中有较多的醛类物质增溶在胶束的栅栏处,降低了胶束的曲率,界面膜柔韧性变高,使胶束呈现椭球形。而SEO和TEO大多数香料分子增溶在胶束核心,胶束的曲率变化不大,呈球形。

因此如表2模型参数所示,LMO核心增溶物较少,疏水半径最小,亲水壳最厚;SEO的疏水半径最大,亲水壳最小。TEO介于两者之间。与图6粒径测量结果一致,图6显示了精油浓度对微乳粒径的影响。质量分数为10%吐温-80溶液空胶束的粒径是10 nm。微乳的粒径随着增溶油浓度的增加而增加。当体系中分别增溶了质量分数为2%的精油之后,3种微乳粒径差异较小,显示的规律为复合精油疏水性越强,胶束粒径越大。当胶束溶液中增溶质量分数为8%的精油之后,3种微乳粒径大小差异增加。SEO微乳的粒径增长得最快,可能是因为其聚集数最大,胶束生长最明显;TEO微乳的粒径小于SEO微乳;LMO微乳的粒径最小,这与它们的log P和SAXS拟合结果变化趋势一致。

3 讨论与研究

3.1 复合柑橘精油的log P调控规律

针对传统微乳配方设计中依赖经验筛选的局限性,本研究旨在建立基于复合柑橘精油理化性质的理性设计框架。前人通过拟三元相图法筛选表面活性剂时[17,23-24],主要关注界面张力与HLB值的匹配。与之不同,本研究首次建立了复合精油log P值与胶束增溶效率的关系。本文从复合精油的性质出发,调查了复合精油的log P对增溶位点的调节规律。将柑橘精油的log P与最大增溶量联系起来,发现log P越小,最大增溶量越大。通过调节油相的log P可有效提高表面活性剂增溶效率,有助于科学设计配方。

3.2 复合柑橘精油的log P调控机制

为解析多组分精油协同调控胶束行为的分子机制,本研究明确了增溶位点与胶束结构的关联规律。相较于传统单一组分增溶体系[12-15],本文探究了化合物组成相似但含量不同的3种复合柑橘精油通过萜烯醇/酯/醛类分子对吐温-80自组装的调控机制。首先通过ITC的热力学数据揭示了3种复合精油在吐温-80胶束中增溶位点。3种复合精油增溶时的热力学参数差异证实了疏水性强的SEO大部分香气化合物由于疏水相互作用增溶在胶束核心;而具有较好亲水性的TEO和LMO由于含氧基团的界面活性,部分两亲香气化合物增溶在胶束栅栏或表面,调节增溶位点,增加增溶面积;进一步,发现香气化合物增溶位点对吐温-80胶束的界面特性调控作用,增溶在栅栏处的香气化合物相较于增溶在核心的香气化合物可有效降低胶束聚集数,进而降低CMC;最后通过SAXS和粒径的测量结构证实了胶束的微观结构变化,可以充当助表面活性剂作用的精油改变了胶束的形状,促进了胶束从球状到棒球状的形状转变,使得胶束的增溶能力大大提高。且粒径结果显示,复合精油的疏水性越强,其微乳体系的粒径越大。

3.3 总结

复合精油的log P作为亲疏水性的关键指标影响了精油的增溶位点、界面特性以及微观结构,而这些特性又与精油的增溶量有关,因此复合精油的log P很大程度上决定了其在胶束中的增溶量,这一发现为理解复合精油在表面活性剂胶束中的增溶机制提供了重要线索。揭示log P调控的普适性规律有助于拓展至其他多组分天然油体系,也为天然复合精油在透明饮料中的高效应用提供了科学依据和理论指导。

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