母乳作为婴儿营养的黄金标准,能够提供哺乳期婴儿发育所需的全部营养素。其中,母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是第三大固体成分(5～24 g/L),其含量仅次于乳糖(55～70 g/L)和脂类(16～39 g/L)[1-3]。目前研究者们已经从母乳中分离了约250种HMO分子,并通过质谱、核磁共振及色谱分析技术对其中200余种进行了化学结构表征[4]。HMOs其独特的结构多样性使其具有抗感染[5]、增强肠道黏膜屏障[6]、调控免疫系统[7]和促进神经系统发育[8]等生理功能。此外,其对胃酸和消化酶具有高度耐受性,能够完整地到达结肠,作为益生元选择性促进有益菌(如双歧杆菌)定植,从而促进肠道微生物群建立[3,9]。目前中国已批准2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)和乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose, LNnT)作为营养强化剂用于婴幼儿配方食品,并且乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose,LNT)作为LNnT的同分异构体在美国和欧盟等地区也被批准用于婴幼儿配方食品。2′-FL和LNT、LNnT分别是岩藻糖基HMOs和中性非岩藻糖基HMOs的代表性组分[10]。其中,2′-FL对菌株具有高度选择性[5,11],而LNT是构成Ⅰ型母乳低聚糖的核心结构,超过一半的母乳低聚糖都是LNT及其衍生物[12]。两者在结构上的互补性共同构建了HMOs多种生理功能,且这种协同作用具有塑造婴儿肠道菌群的早期演替轨迹的潜力[8]。
双歧杆菌是存在于人类肠道中的重要益生菌之一,其在0～6月龄足月顺产且母乳喂养婴儿的肠道中占据主要地位,并对早期生命健康发育具有重要作用。目前从婴儿粪便中分离出来的双歧杆菌包括长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum,BLL)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis,BLI)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve,BBR)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,BBF)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium,BDT)等其他较小的分类群[13]。其中,BLI和BBF中具有HMOs水解的多种糖苷酶,具有很强的HMOs利用能力,而其他种双歧杆菌对HMOs的利用具有极强的菌株特异性[14]。
双歧杆菌对代表性HMO的利用机制已被多篇研究详细报道。2′-FL首先会在α-L-岩藻糖苷酶(GH95和GH29)作用下水解生成L-岩藻糖和乳糖,随后分别在岩藻糖酶和β-半乳糖苷酶的作用下进一步分解代谢,最终生成乙酸盐、乳酸等代谢产物[14-15];而LNT代谢涉及多个GH家族(GH2、GH42、GH20、GH112、GH136等)的协同作用与种间特异性调控。其中间代谢产物主要有N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)、半乳糖等[14]。HMOs分解产生的中间代谢物(如L-岩藻糖、GlcNAc)以及终产物(如乙酸盐、乳酸)能够在双歧杆菌种间形成交叉喂养网络。例如,短双歧杆菌可在双歧杆菌群落中通过L-岩藻糖形成竞争优势[16]。
目前研究多聚焦于单一HMO组分的代谢机制,而对混合HMOs的协同利用特性及菌株互作规律仍缺乏系统解析。此外,关于不同双歧杆菌代谢动力学差异(如底物消耗速率、中间产物积累规律)的定量研究有待进一步补充。基于此,本研究选取来自婴儿肠道中的5株双歧杆菌(BLI_FHBSJZ50M1、BLL_CCFM752、BBF_FJSWX9M8、BBR_FHuNCS1M5、BDT_FGZ15I1M1),通过动态监测其对等比例混合HMOs(2′-FL与LNT)的代谢特征,结合中间产物积累分析,揭示菌株特异性代谢途径及潜在交叉喂养规律。研究结果可为婴幼儿配方食品中合生元的精准配伍提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
5株双歧杆菌均分离自中国不同地区的婴儿粪便,现用30%(体积分数)甘油保藏于江南大学食品微生物菌种保藏中心。L-岩藻糖、乳糖、乳酸、GlcNAc、氢氧化钠、盐酸溶液、无水乙醇、及配制培养基所需试剂纯度为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;甲醇、乙腈和乙酸铵纯度为色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司;2′-FL和LNT纯度分别为92%、83.4%,菲仕兰(中国)有限公司;TaqMasterMix,康为世纪生物科技有限公司;细菌DNA提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司;DNA胶回收试剂盒,美国赛默飞世尔科技公司;溶菌酶溶液(50 mg/mL)、溶菌酶,上海生工有限公司。
1.2 仪器与设备
ME3003电子天平,上海衡平仪器仪表厂;Infinite F50全自动酶标仪系统,瑞士Tecan公司;GPR-9160隔水式恒温培养箱、DK-S12恒温水浴锅、DGG-9123A鼓风干燥箱,上海森信实验仪器有限公司;R小型台式冷冻离心机,德国艾本德股份公司;GR60DA立式压力蒸汽灭菌器,致微(厦门)仪器有限公司;IKAC-MAGHS7磁力加热搅拌器,德国艾卡公司;MX-S涡旋振荡器,大龙兴创实验仪器股份公司;DYCP电泳仪,北京六一生物科技有限公司;UV-2000切胶仪,上海天能生命科学有限公司;MULTISKAN GO全波长自动酶标仪、Q Extractive液质联用仪,美国赛默飞世尔科技公司;S1000 Touch基因扩增仪,美国Bio-Rad公司;AW500SG-7152厌氧工作站,英国Electrotek 400TG公司;W-CJ-1FD超净工作台,苏州净化设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 双歧杆菌的生长特征测定
菌株活化与培养:采用无菌接种环从-80 ℃冻存的甘油管中蘸取双歧杆菌菌液,在固体mMRS培养基表面进行三区划线分离,放置于厌氧工作站,37 ℃恒温培养48 h。培养结束后,从平板上挑取形态典型的单菌落,接种于5 mL液体mMRS培养基中,在37 ℃厌氧条件下培养24～36 h。随后,再以2%(体积分数)的接种量进行一代传代培养。
混菌培养:实验前将5株双歧杆菌分别培养至对数生长期(OD600值=0.7±0.1),通过离心(6 000×g,10 min)和新鲜培养基重悬实现菌体标准化(OD600值=0.6±0.05)。接种时按体积百分比法控制菌株比例:每株菌以0.2%(体积分数)的终浓度同步接入mMRS灭菌培养基,混合体系通过涡旋振荡(2 000 r/min,30 s)确保菌体均匀分布。
生长曲线测定:将活化好的菌液按照按1%(体积分数)的接种量分别接种至5 mL不同碳源[(1%(质量分数)2′-FL/LNT/2′-FL+LNT]-mMRS液体培养基的试管中,充分混匀。取300 μL各培养液分别加入96孔板中,每个样本设置3个生物学重复。将96孔板置于37 ℃恒温厌氧培养箱中培养48 h,期间每隔4 h使用酶标仪测定600 nm波长处的吸光度值(OD600值)。其中,以葡萄糖-mMRS培养基作为阳性对照,无糖-mMRS培养基作为阴性对照。
生长代时计算:微生物生长代时是指当微生物处于生长曲线的指数期时,细胞每分裂一次所需的平均时间。生长曲线对数期代时简化后的公式(1)如下所示:
生长代时
(1)
式中:T1和T2是对数期2个时间点,OD2和OD1分别为T2和T1时菌液的OD600值。
1.3.2 母乳低聚糖及其代谢物含量测定
样品制备:发酵液样品保存于-20 ℃。制样时,精确吸取1 mL发酵液,在4 ℃条件下以10 000×g离心2 min,收集上清液。取200 μL上清液转移至1.5 mL离心管中,加入800 μL甲醇-乙腈混合溶液(1∶1,体积比),充分混匀后置于4 ℃冰箱中过夜以沉淀蛋白质。随后在4 ℃条件下以12 000 r/min离心20 min,收集上清液并于-20 ℃保存备用。临上机检测前,使用50%(体积分数)乙腈溶液将样品梯度稀释至适宜浓度,采用高效液相色谱质谱联用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)测定发酵液中2′-FL、LNT、L-岩藻糖、GlcNAc、乳糖及乳酸的含量。
检测方法:参照的ZHOU等[17]报道并优化部分参数,具体仪器参数设置如下:采用Waters ACQUITY UPLC®BEH Amide(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱,柱温60 ℃,自动进样器温度设为10 ℃,流速为0.3 mL/min,进样量为2 μL,流动相A和B分别为80%乙腈和30%乙腈,梯度洗脱:0～7.00 min,20% B;7.00～8.00 min,40% B;8.00～8.10 min,40% B;8.10～10.00 min,20% B。
1.3.3 双歧杆菌种水平测序
使用TIANamp细菌DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取细菌基因组DNA,基于双歧杆菌groEL基因测序分析群落相对丰度[18]。扩增产物通过Illumina MiSeq平台测序,原始数据经QIIME 2处理。PCR引物与扩增条件参照文献[19]。
2 结果与分析
2.1 不同种双歧杆菌在等比例HMOs(2′-FL和LNT)中的生长特性
本研究系统评估了5株双歧杆菌及其等比例混合菌群在以2′-FL和LNT(1∶1,质量比;下同)为唯一碳源的mMRS培养基中的生长动力学特征(图1)。结果显示,所有受试菌株及混合菌群均能在该混合HMOs-mMRS培养基上生长,稳定期OD600值为1.0～1.8。值得注意的是,混菌表现出显著的生长优势,其对数生长期的起始时间(8 h)早于所有单菌,并于16 h率先到达稳定期。单菌的48 h生长曲线(图1-a)显示,BLI_FHBSJZ50M1和BDT_FGZ15I1M1的延滞期长于其他菌株,这表明其对该发酵体系的适应性较弱。而BBF_FJSWX9M8、BBR_FHuNCS1M5和BLL_CCFM752在24 h即达稳定期,表现出典型的三阶段生长特征:0～16 h为延滞期,16～24 h为指数期,24 h后进入稳定期。此外,本研究注意到BLL_CCFM752在8～12 h时表现出了轻微的生长,且在12 h 的OD600值高于其他单菌,说明其可能通过优先效应在群落中占据优势[16]。进一步分析对数期代时显示:BBF_FJSWX9M8[(1.13±0.2) h]和BBR_FHuNCS1M5[(1.73±0.06) h]的生长代时显著低于其他菌株,并与混合菌群[(1.82±0.15) h]无统计学差异(P>0.05)。该结果提示2株菌在HMOs混合碳源中具有竞争优势,可能通过代谢互补机制主导混合培养体系的生长动态[16]。这种现象与文献报道的HMOs对特定双歧杆菌菌株的促生长效应相吻合[20]。
a-生长曲线;b-生长代时
图1 双歧杆菌在等比例HMOs(2′-FL/LNT)中的生长特征
Fig.1 Growth characteristics of bifidobacteria in equal proportions of HMOs (2′-FL/LNT)
注:A,B表示菌株间具有显著性(P<0.05)。
2.2 不同种双歧杆菌对等比例HMOs(2′-FL/LNT)的动态消耗特征
本研究通过HPLC-MS技术系统解析了5株双歧杆菌在等比例HMOs(2′-FL和LNT)发酵体系(0～48 h)中的动态代谢特征(图2)。结果显示,在发酵前期菌株对2′-FL的利用效率普遍高于LNT,这与文献报道的低聚合度的低聚糖会被优先消耗结果一致[21]。值得注意的是,BBF_FJSWX9M8表现出独特代谢优势,在24 h内完成低聚糖的完全消耗,并伴随特征性代谢产物积累:L-岩藻糖[(2.69±0.59) mmol/L,36 h]和乳酸[(11.64±0.63) mmol/L,24 h]。BLL_CCFM752呈现出阶段性代谢特征,24 h优先利用完2′-FL,其L-岩藻糖[(3.09±0.31) mmol/L]和乳酸[(10.05±1.17) mmol/L]峰值较其他菌株提前至12 h(与生长曲线对应),该现象或与其α-L-岩藻糖苷酶的底物特异性有关[13]。而BLI_FHBSJZ50M1中的HMOs完全代谢延迟至36 h,且后期出现代谢物再利用现象,说明其在群落中可以与其他菌株形成交叉喂养。除BDT_FGZ15I1M1外,其余菌株都是到达稳定期时,发酵液中的2′-FL和LNT才被完全消耗。BBR_FHuNCS1M5虽在24 h内同步完成2′-FL和LNT的代谢,但仅检测到乳酸线性积累[(11.95±0.39) mmol/L,36 h],这可能与其β-半乳糖苷酶的高效表达有关。整个发酵过程中GlcNAc检测到的最高含量低于0.2 mmol/L,可视为没有。综上所述,双歧杆菌对HMOs的代谢存在种间动力学差异,优势菌株的快速代谢能力可能通过代谢产物交叉喂养影响群落组成。
a-2′-FT和LNT质量浓度变化;b-发酵过程中L-岩藻糖、GlcNAc、乳糖和乳酸含量的动态变化
图2 双歧杆菌对等比例HMOs(2′-FL/LNT)利用的动态消耗特征
Fig.2 Dynamic metabolism of bifidobacteria utilizing equal proportions of HMOs (2′-FL/LNT)
2.3 双歧杆菌对单一HMO的动态代谢及机制解析
为进一步分析不同种双歧杆菌分别对这2种HMO的动态消耗,本研究分别以1%(体积分数)2′-FL 和LNT为唯一碳源对上述菌株进行培养,利用HPLC-MS对发酵过程(0、8、12、24、36、48 h)中上清液中碳源以及代谢物的含量进行测定。
2.3.1 双歧杆菌对2′-FL的动态代谢及机制解析
通过HPLC-MS对发酵过程中2′-FL及其代谢产物的动态监测发现,除BDT_FGZ15I1M1外,其余受试菌株均能在24 h内完全消耗培养基中的2′-FL,并进入生长稳定期(图3)。其中,BBF_FJSWX9M8与BLL_CCFM752表现出显著的2′-FL利用效率,在发酵8 h时消耗率分别达51.35%(3.97 mg/mL)和52.97%(4.12 mg/mL),这可能与高浓度2′-FL促进菌株代谢关键酶(如α-岩藻糖苷酶)的快速激活有关。相比之下,BLI_FHBSJZ50M1、BBR_FHuNCS1M5、BDT_FGZ15I1M1对2′-FL的代谢主要集中于8～12 h阶段。值得注意的是,BDT_FGZ15I1M1的2′-FL代谢活性显著低于其他菌株,其消耗过程仅发生于0～12 h,且12 h后上清液中残留量无显著变化(P>0.05),提示其代谢通路可能存在底物特异性限制。
a-2′-FL动态相对消耗率;b-L-岩藻糖;c-乳糖;d-乳酸
图3 双歧杆菌利用2′-FL的代谢物动态变化
Fig.3 Dynamic metabolite changes in bifidobacteria utilizing 2′-FL
在代谢中间产物分析中,BLI_FHBSJZ50M1、BBF_FJSWX9M8、BLL_CCFM752及BBR_FHuNCS1M5的发酵液中均检测到L-岩藻糖的阶段性积累。BLI_FHBSJZ50M1的L-岩藻糖含量在24 h达到峰值后于36 h显著降低,表明其具备完整的L-岩藻糖代谢通路。而其他3株菌的L-岩藻糖含量在24 h后趋于稳定,同时伴随乳糖利用率提升及乳酸持续积累,推测其岩藻糖苷酶活性不足或转运效率受限,导致中间产物滞留[14]。这与双歧杆菌代谢HMOs时常见的底物优先利用策略一致,即优先分解简单糖类(如乳糖),而复杂寡糖(如L-岩藻糖)的代谢滞后[15,21]。
2.3.2 双歧杆菌对LNT的动态代谢及机制解析
通过动态监测发现,双歧杆菌对LNT的代谢主要集中于前12 h,并在24 h左右进入稳定期(图4)。其中BBF_FJSWX9M8表现出最强的LNT利用能力(最终消耗率100%),随后依次为BLI_FHBSJZ50M1(96%)、BBR_FHuNCS1M5(86%)、BLL(85%)、BDT(79%)。值得注意的是,前8 h仅BBF_FJSWX9M8启动对LNT的代谢,而其余菌株对LNT的利用皆延迟至8～12 h阶段。
a-LNT动态相对消耗率;b-GlcNAc;c-乳糖;d-乳酸
图4 双歧杆菌利用LNT的代谢物动态变化
Fig.4 Dynamic metabolite changes in bifidobacteria utilizing LNT
在代谢产物分析中,GlcNAc是LNT重要中间代谢产物之一,其积累特征呈现显著的菌株特异性。本研究仅在BLI_FHBSJZ50M1的发酵液中检测到GlcNAc的积累,这提示该菌株可能通过β-N-乙酰己糖胺酶介导的水解通路代谢LNT。而其余4株双歧杆菌缺乏GlcNAc积累的现象,则暗示其更可能通过其他通路进行LNT代谢,该通路可能涉及不同的酶系作用机制[22-23]。所有菌株在LNT发酵过程中均检测到微量乳糖,但其含量在0～8 h中无显著性变化,8 h后乳糖含量略有下降。代谢动力学分析表明,初始培养基中的少量乳糖在发酵初期被快速消耗作为主要碳源,而随着LNT代谢的启动,菌株通过胞外β-半乳糖苷酶(GH2/GH42家族)逐步水解LNT从而生成乳糖。乳糖的生成速率与其胞内转运代谢速率(通过lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶磷酸化进入糖酵解)达到动态平衡,从而导致胞外乳糖浓度维持在1～2 mmol/L且0～8 h无显著波动。此外,所有菌株在发酵过程中乳酸含量持续增加,这种代谢终产物的持续生成具有重要生态意义。据报道,乳酸可作为肠道内丙酸杆菌等次级代谢菌群的碳源,驱动微生物间的交叉喂养作用,进而维持肠道菌群稳定[24]。
2.4 不同双歧杆菌对等比例HMOs(2′-FL/LNT)的竞争利用
将5株双歧杆菌以相同接种量(0.2%)接种于等比例2′-FL和LNT组成的混合HMOs培养基中进行共培养,系统探究菌株对母乳低聚糖的竞争性利用特性。代谢动力学分析(图5-a、图5-c、图5-d和图5-e)表明,在初始0～2 h阶段,2′-FL和LNT的消耗率无明显差异(分别为42.64%和42.82%),同时乳糖含量也呈现下降趋势;2～6 h期间菌株代谢偏好发生显著转变,2′-FL消耗率提升41.56%,并伴随L-岩藻糖的积累,表明此阶段菌株优先分解2′-FL代谢产物;而LNT在此期间的消耗率增幅仅为25.55%。8～10 h阶段菌群代谢策略再次调整,LNT成为主要碳源,其10 h时消耗率达88.54%。12 h左右HMOs基本耗尽,菌群转向利用次级代谢产物L-岩藻糖、N-乙酰氨基葡萄糖和乳酸。值得注意的是,GlcNAc虽被检出但含量很低(与2.2节结果一致),说明其不是菌群形成交叉喂养的主要物质。
a-HMOs动态相对消耗率;b-48 h内5种双岐杆菌的相对丰度变化;c-L-岩藻糖;d-GlcNAc;e-乳糖;f-乳酸
图5 不同种双歧杆菌对等比例HMOs(2′-FL/LNT)的竞争性利用
Fig.5 Competitive utilization of equal proportions of HMOs (2′-FL/LNT) by different species of bifidobacteria
菌群结构动态监测显示,48 h时BLL_CCFM752成为同时培养的优势物种(相对丰度86.25%),其次是BBF_FJSWX9M8(相对丰度7.89%)和BLI_FHBSJZ50M1(相对丰度5.67%),而BBR_FHuNCS1M5和BDT_FGZ15I1M1的相对丰度低于1%。BLL_CCFM752在初始2 h内快速生长成为优势菌,其机制可能源于对2′-FL的高效利用,而BLL与BBF间呈现动态竞争关系,其相对丰度变化存在负相关,且本研究中混菌丰度变化结果与出生前1个月内母乳喂养婴儿肠道中双歧杆菌组成也类似[25]。需特别指出的是,为避免真实肠道环境中双歧杆菌群落组成由多种因素共同调控的影响,本研究通过简化培养基排除了其他碳源和肠道内微生物等因素的干扰,目的是更聚焦于双歧杆菌对单一或混合HMOs(2′-FL和LNT)的竞争性代谢机制。
3 结论
本研究探究了5株双歧杆菌及其等比例混合菌群在单一底物(2′-FL、LNT)和等比例混合HMOs(2′-FL∶LNT=1∶1,质量比)中的生长及动态代谢。结果显示,所有受试菌株及混合菌群均能在以上2种低聚糖中生长,但代谢效率存在显著的菌株特异性差异。其中,BBF_FJSWX9M8与BLL_CCFM752表现出突出的2′-FL代谢优势,在发酵前8 h即完成50%以上的底物消耗,且前者还同时具备最强的LNT分解能力。进一步分析混菌对混合HMOs发酵结果发现,BLL_CCFM752和混合菌群对2′-FL皆表现出优先利用特性。其中,混合菌群发酵过程中BLL_CCFM752的相对丰度最大,其竞争优势在于:将2′-FL转运至细胞内代谢,规避了细胞外竞争;利用BBF_FJSWX9M8胞外水解产生的中间代谢产物(L-岩藻糖、乳糖等)形成交叉喂养。综上所述,等比例2′-FL和LNT组合可协同调控双歧杆菌代谢,促进长双歧杆菌为主的双歧杆菌群落形成,未来可利用无菌小鼠模型进一步验证此HMOs和双歧杆菌组合在体内的变化,展开临床婴儿队列研究,验证其对双歧杆菌缺乏的个体(如剖腹产婴儿)的微生态矫正效能。推进下一代合生元产品转化,帮助婴幼儿及特殊人群健康肠道管理。
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