水产类食品的全球流通越来越普遍。然而,不适当的运输和贮存可能导致微生物增殖,这些微生物可以通过脱羧分解蛋白质中的氨基酸产生生物胺,降低水产品新鲜度,危害人体健康[1]。例如虾变质过程中会产生碱性化合物,俗称挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N),可以通过TVB-N的变化来反映虾的新鲜度[2]。传统的TVB-N检测方法操作繁琐、效率较低,可能破坏样品完整性,这对于需要保持良好外观的食品不利。因此,需要一种非破坏性技术或工具来跟踪反映虾的新鲜度,智能包装是解决这一问题的关键所在。智能包装实时监测食品新鲜度,目前研究多集中在pH指示膜方面[2-4]。
紫甘蓝花青素(purple cabbage anthocyanins,PCA)是一种天然色素[5],对pH变化有高灵敏度的响应,目前已成为天然指示剂的首选材料之一。HASHIM等[6]将PCA用于鸡肉新鲜度的监测发现指示膜具有与鸡肉新鲜度变化相关的可视化颜色改变;GUO等[7]将PCA与西瓜皮果胶结合用于羊肉新鲜度检测得到相似效果。以上研究表明PCA用于pH指示膜有巨大潜力。马铃薯淀粉(potato starch,PS)来源广泛,天然可降解,具有良好的成膜性,成膜后光学性能较好[8]。但纯淀粉膜易吸水,应用时受限。目前学者通常将淀粉与其他高分子材料,如纳米材料等共混制备综合性能较高的薄膜,扩大淀粉膜的应用范围[9]。微晶纤维素(microcrystalline cellulose,MCC)是纤维素酸解后高分子物质,成本低廉,环境友好,比表面积高,热稳定性好。已有研究证明MCC可作为膜基质中的功能填料,改善薄膜综合性能[10]。DEBNATH等[11]从象草中提取MCC用作淀粉膜的增强剂,发现MCC的加入提高了膜的耐水性能和机械强度。故本文选择MCC和PS共混成膜,以期提高淀粉基薄膜的综合性能,并减少成本。
本文以MCC/PS为成膜基质,添加PCA制备pH指示膜,比较不同PCA质量浓度的指示膜的微观结构、物理性能、机械性能、环境稳定性和pH敏感性,并用于监测虾的新鲜度,为PCA的pH指示膜监测水产品新鲜度提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
刀额新对虾,市售;PS,海天食品有限公司;MCC,科隆化学品公司;PCA(25%纯度),陕西林洲生物有限公司;甘油,国药试剂。
1.2 仪器与设备
PHS-3C台式酸度计,雷磁有限公司;CMS-20A数显恒温磁力搅拌器,郑州长城科工贸易有限公司;FJ200-SH高速均质机,上海标本模型厂;NICOLET IS 10傅里叶变换红外光谱仪,美国赛默飞公司;CR-400色差仪,柯尼卡美能达公司;WH002超声破碎机,江南威恒有限公司;场发射扫描电镜,Apreo 2c,美国赛默飞公司。
1.3 实验方法
1.3.1 指示膜制备
根据张爱武等[12]的方法稍作修改,称20 g PS溶于200 mL去离子水中,在80 ℃下搅拌20 min制得淀粉糊化液。2 g MCC加入200 mL去离子水中,超声30 min(功率600 W)制得MCC悬浮液(1 g/100 mL)。将5.2 g甘油、MCC悬浮液与上述淀粉糊化液共混,以10 000 r/min的转速均质15 min得混合液。
取5份70 mL混合液,1份不添加任何物料,作为对照组;另4份分别加入0.14、0.28、0.42、0.56 g花青素[4,7],使用高压均质机10 000 r/min均质10 min,超声30 min,脱气。取50 mL成膜液倒入模具,在45 ℃下干燥12 h,回湿揭膜。花青素的质量浓度分别为2、4、6、8 g/L。根据花青素的质量浓度,5张膜分别命名为PMR 0、PMR 2、PMR 4、PMR 6、PMR 8。
1.3.2 指示膜结构表征与性能测试
微观结构表征:使用Apreo 2C场发射扫描电镜观察指示膜的表面及截面形貌,电压10 kV,表面放大3 000倍,截面放大500倍。
红外光谱测定:使用傅里叶红外光谱仪测定膜的红外光谱,分辨率4 cm-1,扫描32次、范围400～4 000 cm-1。
机械性能测定:根据李波等[5]的方法,使用测厚仪测定指示膜不同位置的厚度,取均值;将指示膜裁成80 mm×15 mm的长方形样条,使用拉力试验机测定指示膜的拉伸强度(tensile strength,TS)和断裂伸长率(elongation at break,EAB)。
耐水性能测定:将指示膜裁成3 cm×3 cm的正方形样条,记录初始质量m0(g),取50 mL去离子水,在25 ℃下将指示膜浸于去离子水中,静置12 h,取出用滤纸吸干表面水分,称重m1(g)。将指示膜裁成2 cm×2 cm的正方形,取50 mL蒸馏水,记录初始质量m2(g),在室温下将指示膜浸于烧杯中,静置12 h,机械搅拌2 h,过滤,将滤渣干燥至恒重,称重m3(g)重复测定3次,使用公式(1)、公式(2)分别计算薄膜的吸水率(water absorption,WA)和水溶解性(water solubility,WS):
(1)
(2)
水蒸气透过率(water vapor permeability,WVP)测定:根据GB/T 1037—2021《塑料薄膜与薄片水蒸气透过性能测定 杯式增重与减重法》测定指示膜的WVP。
色度测定:利用色差仪测定指示膜的色度,并按公式(3)计算色差ΔE:
(3)
式中:L0、a0、b0,标准白的色度值,L、a、b,指示膜的色度值。
透明度测定:使用光电雾度仪测定指示膜的透明度。
颜色稳定性测定:将指示膜分别置于光照、4 ℃和75% RH;避光、4 ℃和30% RH;避光、4 ℃和75% RH;避光、25 ℃和75% RH环境中,使用色差仪每7 d测定指示膜的色度值(L,a,b),并根据公式(3)计算色差(L0、a0、b0为指示膜初始色度值),总时长为28 d。
pH值响应:将指示膜裁剪成2 cm×2 cm的正方形样条,分别浸于pH值为2～12的缓冲液中,拍照记录膜的颜色,同时测定和计算指示膜的色度值,得到指示膜的pH敏感性。
1.3.3 指示膜的应用
将薄膜与鲜虾共同置于无菌培养皿内,互不接触。培养皿用塑料膜包裹,置于4 ℃的环境中,8 d,每2 d拍照记录虾的外观和指示膜色度,根据GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》测定虾的TVB-N值,根据GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》测定虾的pH值。
1.4 数据处理
以SPSS 27软件处理数据,用Origin 2025软件绘图。
2 结果与分析
2.1 指示膜红外光谱分析
指示膜的红外光谱如图1所示。pH指示膜在3 311 cm-1处的峰可归因于分子间—OH伸缩振动[13]。2 937、2 883 cm-1两处较窄的峰是脂肪族—CH 基团和烷烃拉伸振动的结果[3]。1 644、1 617 cm-1的峰与芳香环C
C键的拉伸振动有关[2],随着PCA质量浓度增加,此处峰强度增大,这是由于PCA与水分子之间结合能力较强,同时也导致高浓度膜的WA增加。1 412、1 334 cm-1被认为是—CH的伸缩振动[2]。1 078、1 030 cm-1处吸收峰与C—O—C的拉伸振动有关[2],而999 cm-1处的峰对应于PS分子中葡萄糖残基的特征吡喃糖环[14]。加入PCA后,PCA在3 415、1 448 cm-1处的峰值分别红移至3 311、1 412 cm-1处,主要由于PCA与PS、MCC之间形成新的分子间作用力,发生了静电吸引。以上结果表明PCA与PS、MCC分子之间结合紧密,且未产生新的基团。
图1 指示膜的红外光谱图
Fig.1 Fourier transform infrared spectrometer of indicator films
注:PMR 0、PMR 2、PMR 4、PMR 6、PMR 8表示PCA质量浓度分别为0、2、4、6、8 g/L(下同)。
2.2 指示膜扫描电镜分析
指示膜的表面和截面电镜图如图2所示。PMR 0膜表面存在裂纹和气孔,说明PS和MCC之间相容性较差,存在一定的相分离,表面明显的白色颗粒可归因于MCC的聚集体[11]。随着PCA的质量浓度从2 g/L增加到6 g/L,指示膜的表面变得光滑均匀,截面连续,整体平整,未见明显孔隙。这是因为PCA与成膜基质之间的相互作用促进了MCC与PS的融合,提高了指示膜的整体平整度。此阶段展示出的光滑膜表面意味着氢键诱导的强表面相互作用和黏附性以及PCA对薄膜微观结构的积极影响[15]。横截面形态学进一步证实,此阶段的PCA值可以提高PS和MCC之间的相容性,而8 g/L的PCA质量浓度会破坏薄膜的紧凑结构,表现为PMR 8指示膜表面有明显破碎和裂纹,这是由于指示膜中过量的小分子聚集。这与HE等[15]研究结果一致。扫描电镜分析表明,适当质量浓度的PCA在PS/MCC基质中的分散性均匀。指示膜中PCA的最佳质量浓度为6 g/L。
a～e分别代表指示膜表面;a1～e1分别代表指示膜横截面
图2 指示膜表面和横截面的扫描电镜图
Fig.2 Scanning electron microscope images of the surfaces and cross-sections of indicator films
2.3 指示膜的厚度与机械性能
指示膜的厚度如表1所示,随着PCA质量浓度增加,指示膜厚度从0.106 mm增加到0.125 mm。膜厚度的增加依赖膜液内PCA质量浓度的增加,HE等[15]也报道了聚乙烯醇/紫甘蓝花青素/膜类似的厚度变化趋势。指示膜的TS和EAB数据如表1所示。与PMR 0膜相比,PCA的掺入显著提高指示膜的机械性能,并随着PCA质量浓度的增加TS值显著增大,EAB变化不显著。一方面,这与PCA在基质中的均匀分散以及PCA、PS和MCC分子之间的相互作用相关;而另一方面,PCA分子的介入破坏了MCC和淀粉之间的有序排列,从而增加薄膜脆性[16]。此外,PCA中的酚—OH可以与PS中的—OH相互作用,提高了机械性能。这与KANMANI等[17]的PCA增强了羧甲基纤维素钠的机械性能研究类似。
表1 指示膜的厚度、TS、EAB、WA、WS和WVP
Table 1 The thickness, TS, EAB, WA, WS and WVP of the indicator films
样品厚度/mmTS/MPaEAB/%WA/%WS/%WVP/[×10-10 g·m/(m2·Pa·s)]PMR 00.106±0.000 9e14.31±0.43e5.46±1.05a101.58±7.23d29.59±0.848a1.12±0.04dPMR 20.112±0.001 2d15.44±0.10d6.46±0.82a132.23±2.77c25.46±1.132b1.31±0.045cPMR 40.116±0.000 8c17.56±0.27c6.74±2.59a141.27±0.74b25.44±0.459b1.56±0.035bPMR 60.120±0.000 6b18.43±0.03b5.59±1.23a147.92±0.50a25.72±0.179b1.59±0.030bPMR 80.125±0.000 8a19.44±0.38a4.36±0.31a149.22±1.80a28.45±1.111a1.71±0.067a
注：数值=均值±标准差,同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.4 指示膜WVP与耐水性能
薄膜的WA、WS、WVP如表1所示,PCA的加入对WA、WS和WVP都有显著影响。添加PCA后,指示膜的WA和WVP值均显著增高,WS先降低后升高。WA和WVP升高是由于亲水性PCA质量浓度的增加,提高了膜与水分子的亲和力,与KANMANI等[17]研究结果类似。PMR 0膜的WS值为29.59%,添加PCA后显著降低(P<0.05)。这是因为PCA与PS之间强烈的相互作用形成氢键,抵消了PCA与水分子的结合力,导致膜的WS降低,WS值降低。最后,当PCA的质量浓度增加到8 g/L时,指示膜的WS值增大,是由于膜中PCA过量的增加与水的结合力增加,这一结果与前人在膜中加入绿茶提取物研究结果类似[18]。
2.5 指示膜色度与环境稳定性
通常食品外包装的外观和颜色会影响消费者的选择。表2反映了不同PCA质量浓度的指示膜色度、透明度和外观。PMR 0膜无色透明。随着PCA加入,指示膜的L值显著下降,与之对应的透明度也显著下降,这是由于PCA为紫红色粉末所致。与此同时,指示膜的a值和b值也显著增加。
表2 指示膜的色度、透明度和外观
Table 2 The color, transparency, and appearance of the indicator films
样品LabΔE透明度/%外观PMR 097.79±0.19a-0.12±0.00e0.47±0.05c1.74±0.18e90.40±0.10aPMR 242.52±0.43b43.25±0.25b-5.22±0.77d71.70±0.55d37.27±0.32bPMR 415.24±0.21c45.45±0.27a17.75±1.34a97.31±0.30c18.10±0.26cPMR 612.71±0.03d42.17±0.12c18.67±0.71a98.21±0.21b7.90±0.00dPMR 86.70±0.04e33.76±0.25d10.73±0.14b99.29±0.07a1.90±0.20e
由于花青素极易受到光照、温度等环境条件的影响发生降解失去活性,这也容易导致指示膜颜色不稳定。因此探究薄膜的环境稳定性是有必要的。图3展示了不同PCA质量浓度的指示膜在不同贮藏条件下的色差变化,ΔE>5时,颜色的变化可以被肉眼捕捉[5]。当PCA质量浓度大于2 g/L时,光照、温度和湿度对指示膜的影响不大,在28 d内的指示膜ΔE均小于5,说明PMR 4、PMR 6和PMR 8的指示膜稳定性较好。这是因为高质量浓度的花青素通过自缔合提高了它们的稳定性[19],较高的质量浓度易于保证指示膜的稳定性。当PCA质量浓度为8 g/L时,指示膜的ΔE的变化大于PMR 4和PMR 6膜,这是由于花青素质量浓度较高,淀粉、MCC与花青素的相容性会变差,使得花青素浮于表面,稳定性下降,这一点在微观结构中得到了证实。因此PCA质量浓度为6 g/L时,指示膜环境稳定性较好。
a-25 ℃无光照75%RH;b-25 ℃光照75%RH;c-25 ℃无光照30%RH;d-4 ℃无光照75%RH
图3 指示膜的环境稳定性
Fig.3 Environmental stability of indicator films
2.6 指示膜的pH敏感性
图4展示了不同质量浓度PCA的指示膜在pH值为2～12下的颜色响应。由图4可知,指示膜的颜色随着缓冲液的pH值从深红色(pH 2～4)转变为浅红色(pH 5～6)到紫色(pH 7～8)到蓝色(pH 9～11)再到黄绿色(pH 12)。这些变化主要是由于花青素结构的变化引起的[20]。当pH值为2～3时,花青素为红色的黄酮阳离子结构。当pH值在4～5时,黄酮阳离子由于羟基的去质子化而转化为无色的甲醇假碱,红色减淡。当pH值为6～7时,黄酮阳离子进一步去质子化形成奎宁样酸和碱,并伴有变为紫色,而在pH值为7～10时,蓝色阴离子醌在溶液中占主导地位,在pH>11时,蓝色醌碱与黄色查酮反应,导致颜色呈蓝绿色/变暗。PMR 4和PMR 6指示膜均表现出较为明显的pH敏感性。同时,表3列出了PMR 6指示膜在不同pH值下大于5的ΔE值。综合前文结果可得,PMR 6指示膜具备应用潜力。
表3 不同pH缓冲液中PMR 6指示膜的色度变化
Table 3 The chromaticity change of PMR 6 film in different pH buffers
pH值LabΔE252±0.04a24±0.46a6±0.34b45.10±3.20b341±0.46b23±1.51b7±0.46b36.11±2.15cd437±1.02b18±1.06c5±0.88b36.89±1.55cd538±0.46b20±1.22bc5±0.59b36.30±1.34cd638±0.37b22±0.81b6±0.18b34.74±1.22d739±1.61b22±0.43b6±1.66b35.48±0.46d839±0.99b22±0.38b7±0.92b35.13±0.99d939±0.76b18±0.16c1±0.43c39.84±0.19c1038±0.34b17±0.11c1±0.46c39.82±2.20c1135±0.48c11±0.94c-9±0.44d42.20±1.60b1248±0.44a7±0.76d11±0.13a57.68±2.30a
图4 指示膜的pH敏感性
Fig.4 pH sensitivity of the indicator films
2.7 指示膜在监测虾新鲜度中的应用
虾在冷藏贮存过程中会因为微生物生长繁殖和内源蛋白酶的作用分解蛋白质,产生氨类挥发性化合物,导致TVB-N和pH的升高。在本研究中,将虾与指示膜同时置于无菌培养皿中,膜不与虾直接接触,每2 d测试虾的pH和TVB-N,并拍照记录虾和指示膜的变化,结果如图5所示。
a-指示膜颜色变化;b-pH值、TVB-N值
图5 指示膜颜色变化和虾的pH值、TVB-N值
Fig.5 The color change of the indicator films and the pH value and TVB-N value of the shrimp
当虾的pH值大于7.7时,虾不可售卖及食用[21]。由图5-a可知,虾的初始pH值为6.77,随着贮存时间延长,pH上升。这是由于微生物和内源酶的共同作用,使得蛋白质降解生成氨类等碱性挥发性化合物,使得pH值增加。当贮存到第8天时,虾的pH值为7.86±0.01,表明虾已经完全变质。根据GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》,虾的TVB-N值不高于20 mg/100 g才可食用。贮存过程中,虾的TVB-N值呈现:5.97 mg/100 g(0 d,新鲜)→12.27 mg/100 g(2 d,新鲜)→16.05 mg/100 g(4 d,次新鲜)→31.73 mg/100 g(6 d变质)的连续上升趋势,说明4 d后虾不适合销售及食用。
指示膜的颜色相较于初始膜在逐渐减淡。如图5-a所示,PMR 6指示膜在贮存过程中呈现出明显的颜色变化:亮红色(第0天)→红紫(第2天)→蓝紫色(第4天)→蓝灰色(第6天)→黄色(第8天),每隔2 d天指示膜的色差可视。这是因为虾在腐败变质的过程中,伴随着蛋白质的降解以及挥发性盐基氮的产生,同时导致包装内贮存环境pH值的上升。pH的变化导致指示膜中花青素结构改变,从而指示膜产生肉眼可见的颜色变化[22]。
焦文娟等[23]以蓝莓花色苷制备明胶/聚乙烯醇复合膜用于虾的应用时,与本研究结果相似。在本研究中,当虾的贮存时间超过4 d,虾壳开始发黑发黏,虾肉变得软塌,并伴有较为浓烈的腥臭味。同时TVB-N和pH上升,TVB-N超过可食用的限定值。ΔE值为29.88±1.43,视觉观察明显。根据已有研究,含有黑苹果果皮花青素的pH指示膜在监测虾新鲜度变化时,指示膜颜色变化与本文研究结果相似[24]。表明本研究具有一定的科学性和实践价值。
3 结论
本研究以PCA、MCC和PS制备pH指示膜。红外光谱表明花青素与膜成分之间形成氢键;场发射扫描电镜表明一定质量浓度的花青素使薄膜微观结构更加均匀致密;加入PCA的薄膜综合性能得到提升。当PCA质量浓度为6 g/L时,各成分混合均匀,指示膜厚度适中,有较好的物理性能和机械性能,环境稳定性好,28 d内色差变化肉眼无法分辨(ΔE<5),指示膜对不同的pH环境响应能力强,色差变化明显,可被观察。将指示膜用于虾新鲜度监测,当虾变得不新鲜或变质时,指示膜呈现肉眼可见的颜色变化。结果表明,该膜具有作为指示标签用于虾新鲜度可视化监测的潜能。
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