酱油作为一种调味品,由于其独特的风味在世界各国越来越受到人们的欢迎,至今已有两千多年的历史[1]。以大豆为主要蛋白质原料,辅以小麦为淀粉质原料,通过微生物的代谢活动将原料中的蛋白质和碳水化合物水解成小分子肽、游离氨基酸、有机酸等,再经过生物化学反应形成具有特殊色、香、味的液体[2]。酱油发酵是多种微生物共同作用的结果,包括米曲霉、酵母菌和乳酸菌等,米曲霉作为酱油发酵的关键菌株之一,其所分泌的酶系在发酵过程中可以给酱油带来独特的风味和口感,最终影响酱油的理化指标和感官性能[3]。童佳[4]利用蛋白组学对不同时期发酵酱醪进行分析,认为米曲霉的中性蛋白酶是酱油发酵过程中的关键酶之一。徐德峰[5]、黄伟谦[6]、ZHAO等[7]、石磊等[8]分别对酸性蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、果胶酶进行研究,发现米曲霉的酶系组成对酱油风味具有非常重要的作用。酱油制曲是酱油发酵的关键阶段之一,目的是让米曲霉在曲料上充分生长繁殖,产生酱油发酵所需要的各种酶类,其中蛋白酶是产量最多,并且研究最为广泛的酶系,这是由于国家标准中以全氮和氨基酸态氮含量来划分酱油等级,成曲的蛋白酶酶活力通常作为检验成曲质量的重要指标之一。ZHANG等[9]通过基因组和转录组测序确定了58种在发酵过程中与分解蛋白效率相关的潜在关键酶。CHEN等[10]通过外源添加蛋白酶发现蛋白酶可以提高酱油蛋白的利用率和发酵质量。
我国的发酵酱油根据GB/T 18186—2000《酿造酱油》的相关规定,按生产工艺可分为两大类:一类是高盐稀态发酵(含固稀发酵),一类是低盐固态发酵。低盐固态发酵一般发酵周期不超过1个月,因此容易出现酱油风味不佳,口感欠缺的情况。而高盐稀态发酵环境更优利于微生物的积累和生物酶的作用,从而产品性质更加稳定、风味更加醇厚、味道更加鲜美[11-12]。
随着人们对酱油口感和品质要求的不断提高,米曲霉作为酱油发酵的主要菌株之一,其品质和特性将直接影响酱油风味和品质,而后者对酱油品质的提升至关重要。本研究以3株米曲霉为研究对象,通过形态学分析、成曲酶活测定、发酵酱油理化指标、肽分子质量、游离氨基酸含量、有机酸含量及感官评价测定,比较不同米曲霉菌株的发酵特性,以期得到更适合酱油发酵的米曲霉,为选育更适合高盐稀态酱油的生产菌株提供数据基础。
1 材料与设备
1.1 原料与菌种
麸皮、干大豆、小麦,广东海天创新技术有限公司。
米曲霉D1和D2是两株商业使用较为广泛的米曲霉,分别购于山东省沂水锦润生物科技有限公司和商城北纳创联生物科技有限公司。
米曲霉D3,广东海天创新技术有限公司以沪酿3.042为出发菌种通过ARTP诱变所得菌株,并已投产使用,米曲霉D3在YPD培养基平板上生长状态及其种曲由广东海天创新技术有限公司提供。
1.2 培养基的制备
1.2.1 三角瓶种曲培养基
将麸皮与水按1∶1的比例混合后,拌匀,每个三角瓶分装80 g左右,高温灭菌后备用。
1.2.2 大曲培养基
选用颗粒饱满的大豆并将其打碎,将干碎豆清洗后置于水中浸泡3～5 h,直到大豆皮脱落,使得湿碎豆最终质量为干碎豆的1.35倍。将湿大豆放入立式灭菌锅121 ℃灭菌15 min,使大豆蛋白初步变性,便于米曲霉利用。小麦经过炒制并破碎处理备用。将冷却至室温的熟碎豆与炒小麦按干质量4∶1混匀制成大曲培养基后备用[13-14]。
1.3 主要试剂
DNS显色液,飞净生物科技有限公司;甲醛(分析纯),广州化学试剂厂;NaOH标准溶液(0.05 mol/L),深圳市博林达科技有限公司;三氯乙酸(分析纯),天津市大茂化学试剂厂;有机酸(标准品),广州环凯实验科技有限公司。
1.4 仪器与设备
Basic分光光度计,德国Eppendorf公司;pHscan40笔型pH计,上海般特仪器制造有限公司;905自动电位滴定仪,瑞士万通中国有限公司;DT Ar/He basic杜马森定氮仪,德国Gerhardf股份公司;LA8080型高速氨基酸分析仪,日立科学仪器(北京)有限公司;1260Infinity Ⅱ凝胶色谱仪、1290/G65445B液相质谱联用仪,美国Agilent公司。
1.5 实验方法
1.5.1 三角瓶种曲的制备
分别从保藏米曲霉的YPD平板培养基上,挑选3～4环孢子接入三角瓶种曲培养基中,充分摇匀,将三角瓶置于(30±2) ℃恒温培养箱内,进行种曲的制备。在恒温条件下培养24 h后,进行第一次摇瓶,目的是将曲料摇散,相当于二次接种,后继续平铺培养。恒温培养48 h后,进行第二次摇瓶,目的是将过长的菌丝打断,长出较多菌丝分支,以便获得更多的孢子,后继续平铺培养。恒温培养72 h后,种曲成熟,装袋备用。
1.5.2 大曲的制备
按3%的质量分数接种三角瓶种曲于大曲培养基中,充分混匀,置于32.5 ℃恒温培养箱内,开始堆积培养。大曲培养11.5 h之后,进行第一次翻曲,将先前堆积培养的原料打散,已达到二次接种的目的,然后调节温度至30 ℃,进行平铺培养。大曲培养17.5 h之后,进行第二次翻曲,然后温度调节至28 ℃,后继续平铺培养。大曲培养25 h后进行第三次翻曲。大曲培养40 h之后,曲料成熟,即为成曲,可收曲备用。
1.5.3 米曲霉成曲粗酶液提取
取10.00 g大曲粉碎后浸于200 mL超纯水中,并于150 r/min、40 ℃条件下恒温振荡浸提4 h。粗酶液过4层滤布后备用。
1.5.4 原油制备
参考路怀金等[15]和张明君[16]的发酵工艺,并做出修改。将成曲按质量比1∶2与质量分数为18%的盐水混合后装入发酵瓶。以成曲混入盐水入罐记为0 d,落黄第2天记为1 d,发酵周期为90 d,发酵期间定期搅拌酱醪,取样时间为发酵第1、5、10、15、30、50、70、90天。将酱醪充分搅匀后取样,取样后将酱醪用4层纱布进行过滤,滤后的原油放于-80 ℃冰箱保存待用。
1.5.5 蛋白酶活分析
1.5.5.1 蛋白酶活力的测定
参考GB/T 23527.1—2023《酶制剂质量要求 第1部分:蛋白酶制剂》测定成曲和酱醪的中性、碱性和酸性蛋白酶活力。1个酶活力单位(U)定义为1 g成曲或1 mL酱醪在40 ℃,pH值分别为7.5、10.5和3.0条件下,每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需要的酶量。
1.5.5.2 氨肽酶活力的测定
参考TAN等[17]、雷芬芬[18]和李慧[19]的方法并做出修改。将1.5.4节的原油冷却至室温,用pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液稀释,在96微孔板中加入90 μL稀释后的样品,在全波长扫描式多功能读数仪中40 ℃下保温5 min,加入10 μL 20 mmol/L底物L-亮氨酸-对硝基苯胺(L-Leu-pNA),40 ℃下反应10 min后加100 μL无水乙醇终止反应;空白组以90 μL pH 8.0 Tris-HCl缓冲溶液代替样品,反应结束后测定实验组及空白组在405 nm波长下的吸光值。
在40 ℃、pH 8.0的条件下,每分钟水解L-Leu-pNA生成1 μg 4-硝基苯胺所需要的酶量,定义为1个酶活力单位(U)。
1.5.5.3 羧肽酶活力的测定
参考MORITA等[20]和冯玮等[21]的方法并做出修改。酶活测定以Z-Glu-Tyr为底物,测定Z-Glu-Tyr中释放Tyr的量。用50 mmol/L pH 3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液配制1 mmol/L底物溶液。取1.8 mL底物,加入200 μL适当稀释的酶液于40 ℃反应20 min,立即加入2 mL茚三酮溶液,混合液置于100 ℃水浴加热15 min,加热完毕后冰浴冷却5 min,在570 nm处测定的吸光值。配制不同浓度标准酪氨酸溶液,同样条件下与茚三酮反应,绘制标准曲线。
在40 ℃,pH 3.8的条件下,每秒水解Z-Glu-Tyr生成1 μg酪氨酸所需的酶量,定义为1个酶活力单位(U)。
1.5.6 理化指标测定
将1.5.4节中的原油样品冷却至室温,并于12 000 r/min离心5 min,收集上清液用于下述理化指标测定。pH直接通过pH计测定;还原糖采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS显色法)进行测定;总酸和氨基酸态氮根据酸碱滴定法和甲醛滴定法,通过自动电位滴定仪分别测定总酸以及氨基酸态氮的含量;全氮通过全氮分析仪测定;可溶性无盐固形物参考GB/T 18186—2000《酿造酱油》。
1.5.7 肽分子质量的测定
采用GPC-HPLC系统并配备高效液相色谱柱(Agilent Bio SEC-3,4.6 mm×159 mm)来测定肽分子质量。流动相为超纯水,流速为0.4 mL/min。
1.5.8 游离氨基酸含量测定
取1 mL 1.5.4节中的原油样品冷却至室温,并于12 000 r/min离心5 min后,用5%的三氯乙酸定容至10 mL。静置2 h后,于25 ℃,8 000 r/min离心15 min。取1 mL上清液用超纯水定容至20 mL,取1 mL稀释液过0.22 μm的微孔纤维素滤膜后注入样品瓶中,即为待测样液。参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》对上述待测样液进行处理,用氨基酸分析仪进行测定。
1.5.9 常见有机酸种类和含量测定
标准溶液的配制及标准曲线的绘制:分别准确称取草酸0.97 mg,富马酸0.05 mg,柠檬酸15.67 mg,酒石酸14.50 mg,苹果酸20.06 mg,琥珀酸29.09 mg,乳酸30.99 mg,甲酸31.52 mg,乙酸30.77 mg,混合定容至10 mL,混合均匀,取标准溶液分别稀释成5、10、50、100、500 mg/L与原始标准溶液质量浓度1 000 mg/L形成6个浓度梯度,进样10 μL,以有机酸质量浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
样品前处理:取100 μL样品用流动相稀释50倍,充分混合后12 000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm的微孔纤维素滤膜,取过滤液上机。
HPLC色谱条件:色谱柱Aminex®HPX-87H Column(300 mm×7.8 mm),流动相为5 mmol/L H2SO4溶液,流速0.5 mL/min,柱温44 ℃,紫外检测波长210 nm,进样量10 μL。
1.5.10 感官评价
采用定量感官描述分析法(quantitative sensory descriptive analysis,QDA)评价不同原油样品感官特征差异[22]。将1.5.4节中所得的原油经巴氏杀菌处理,挑选20位有鉴评经验的感官品评人员,对原油的体态,色泽,气味、口感及综合喜好度按评分标准进行评分。感官评价评分标准表参考GB/T 18186—2000《酿造酱油》进行制定,如表1所示。将各指标评分取平均值,并绘制雷达图。
表1 感官评价评分标准表
Table 1 Scoring standards of sensory evaluation
分值1～2分3～4分5～6分7～8分体态浑浊严重,有大量悬浮物及沉淀物略显浑浊,悬浮物及沉淀物较少较澄清,无悬浮物及沉淀物澄清透明,无悬浮物及沉淀物色泽呈黄褐色或黑褐色,色泽浑沌,无光泽呈黄褐色或黑褐色,色泽暗淡,略有光泽呈红褐色或浅红褐色,色泽较鲜艳,略有光泽呈红褐色或浅红褐色,色泽鲜艳,有光泽气味无明显酱香酯香味,有明显焦糊、酸败味等不良气味酱香酯香较平淡,且有轻微焦糊味酱香酯香较浓郁,无不良气味酱香酯香浓郁,无不良气味口感无鲜味、醇厚味,具有明显酸败、苦等异味鲜味醇厚味缺失,略有轻微苦味、酸涩等异味略咸或略淡,鲜味较淡,醇厚味较薄鲜咸甜味适口,醇厚柔长,滋味鲜美
1.6 数据统计分析
利用Excel 2019及Origin 2021软件进行数据分析及可视化;利用SPSS 27软件进行方差分析和显著性分析(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 米曲霉平板分析
3株米曲霉的YPD平板生长形态观察如图1所示。为了更好地区分菌株间的差异,延长培养时间至240 h。米曲霉D1形态特点为以白色菌丝为生长中心向四周辐射生长,绿色孢子主要生在中环,在培养120 h时出现一道明显的圆环,中心和四周仍有少量白色菌丝,且处于生长状态。米曲霉D2平板表面基本看不到白色菌丝,只有四周存在有少量菌丝,且随着培养时间的延长,白色菌丝被米曲霉孢子全部覆盖,且颜色相对米曲霉D1偏黄色,这可能是由于米曲霉D2的孢子头更多的缘故。米曲霉D3在培养第120 h时菌落形态如图2所示,其也以白色菌丝为生长中心向四周辐射生长,米曲霉D3相较米曲霉D1和D2生长更为旺盛,孢子颜色更绿且孢子数量更多,同时白色菌丝分布更广,更为疏松。有相关研究表明,米曲霉蛋白酶酶活力与孢子颜色之间存在着一定的相关性,即菌株的孢子颜色为黄色时蛋白酶活力较低,反之,菌株孢子颜色为绿色时蛋白酶活力较高[23],本研究结果与之相符,即孢子颜色为绿色的米曲霉D3菌株具有更高的蛋白酶酶活力,米曲霉D1次之,而孢子颜色为黄色的米曲霉D2菌株的蛋白酶活性最低。
a-米曲霉D1;b-米曲霉D2
图1 米曲霉YPD平板形态观察
Fig.1 Morphological of Aspergillus oryzae D1 and D2 on YPD palte
图2 米曲霉D3在YPD平板生长120 h时菌落形态
Fig.2 Morphological of A. oryzae D3 on YPD plate after 120 hours’ growth
2.2 米曲霉成曲的蛋白酶系差异
根据蛋白酶对肽键的作用位点的不同,可将蛋白酶分为内肽酶和外肽酶两大类。内肽酶可以对大分子质量的肽链内部进行识别并切割,形成分子质量较小的二肽和多肽。外肽酶可水解肽链成游离氨基酸,作用于肽链的游离氨基末端或游离羧基末端逐一将肽链水解,根据这一特性,外肽酶可细分为氨肽酶和羧肽酶[24]。
分别采用3株米曲霉进行大曲培养,成曲蛋白酶系如图3所示。结果表明,3株米曲霉的内肽酶酶活力均呈现出中性蛋白酶活力>碱性蛋白酶活力>酸性蛋白酶活力。其中,米曲霉D3成曲的中性蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶酶活力显著高于米曲霉D1、D2成曲(P<0.05),分别达到3 533、513、408 U/g,为米曲霉D2的3.58、3.42和1.51倍。然而,米曲霉D1成曲中的酸性蛋白酶和碱性蛋白酶酶活力明显高于其余两种米曲霉,具有显著性差异(P<0.05)。整体而言,图3所示的酶活力结果与前人[25-27]的研究结果规律较为相符。综合5种蛋白酶酶活力测定结果可知,米曲霉D3的5种蛋白酶酶活力基本高于米曲霉D1和D2,特别是中性蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶,说明相较于米曲霉D1和D2,米曲霉D3能更好地对原料中的蛋白质进行分解利用,酶活力高可能意味着理化指标更好和风味物质更丰富。
图3 三株米曲霉成曲蛋白酶系活力比较
Fig.3 Comparison of the protease activity of koji made by 3 strains of A. oryzae
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3 酱油发酵过程中理化指标对比
3株米曲霉发酵酱油理化指标的变化如下图所示,本研究从pH值、总酸含量、氨基酸态氮含量、总氮含量、还原糖含量及可溶性无盐固形物含量等方面分析3株米曲霉在发酵过程中的变化。
2.3.1 不同米曲霉发酵酱油中pH值和总酸含量变化
酱醪的pH是影响酱油发酵品质的重要因素之一,酱油发酵过程中成分的变化可能会导致pH值的变化[28]。而总酸作为检测酱油发酵过程的重要参数之一,其变化在一定程度上可以反应微生物的代谢活动[29]。3株米曲霉在酱油发酵过程中pH值和总酸变化如图4所示。
图4 三株米曲霉发酵过程中pH值变化
Fig.4 Changes of pH during fermentation of 3 strains ofA. oryzae
3株米曲霉酱醪的pH随着发酵时间的延长均呈现出先下降后趋于平缓的趋势,总体pH值由大到小排序为D2>D3>D1。其中,米曲霉D3在发酵前15天较D1和D2下降缓慢,米曲霉D3与米曲霉D1相比,从发酵第5天开始,整体pH都偏高。有相关研究表明[30],在一定范围内,反应体系中总游离氨基酸、鲜味氨基酸含量会随着pH值的增大而增加,体系的醇厚感和香气显著增加,预示着米曲霉D3可能会产生更多的风味物质。但米曲霉D3的pH值却始终低于米曲霉D2。在酱油发酵过程中会发生许多复杂的生物化学反应,不断分泌酸物质导致酸度的上升。米曲霉D3的低pH可以说明其所发生了更多的生物化学反应。由图5可知,总酸均呈现出先上升后趋于平稳的趋势,米曲霉D1略高于D3。
图5 三株米曲霉发酵过程中总酸含量变化
Fig.5 Changes of total acid content during fermentation of 3 strains of A. oryzae
2.3.2 不同米曲霉发酵酱油中全氮和氨基酸态氮含量变化
在酱油发酵过程中,衡量蛋白质分解率和氨基酸转化率的重要指标之一是全氮和氨基酸态氮含量,也是目前我国衡量酱油品质的国家标准[31]。由图6和图7可知,按照GB/T 18186—2000《酿造酱油》中规定的酱油等级评价标准,发酵末期米曲霉D3的全氮含量达到一级酱油标准,为1.36 g/100 mL;且氨基酸态氮含量为0.98 g/100 mL,达到特级酱油标准,该结果与米曲霉D3具有高酶活力蛋白酶系特征相符[10]。随着发酵时间的延长,3株米曲霉的全氮和氨基酸态氮含量整体都呈上升趋势,且米曲霉D3具有上升速度快,峰值高的特点。3株米曲霉发酵酱油的全氮和氨基酸态氮含量在前15天变化最大,占据总变化量的62.5%～88.8%。在发酵第1天时,不同米曲霉菌株对全氮和氨氮含量影响并不显著,但从发酵第5天起,米曲霉D3对全氮和氨氮含量的影响较米曲霉D1和D2具有显著性(P<0.05)。上述结果说明,在同等发酵条件下,米曲霉D3生产全氮和氨基酸态氮的能力强于米曲霉D1和D2。
图6 三株米曲霉发酵过程中全氮含量变化
Fig.6 Changes of total nitrogen content during fermentation of 3 strains of A. oryzae
图7 三株米曲霉发酵过程中氨基酸态氮含量变化
Fig.7 Changes of amino acid nitrogen content during fermentation of 3 strains of A. oryzae
2.3.3 不同米曲霉发酵酱油中还原糖含量变化
还原糖的变化是糖的降解和消耗过程,不仅是微生物生长代谢活动的体现,也对酱油的风味和发酵品质发挥着重要作用[32]。如图8所示结果来看,3株米曲霉还原糖含量在发酵前期均呈现上升趋势,即还原糖的生成速率大于还原糖的消耗速率,但3株菌株还原糖含量峰值形成的时间却有所差异,米曲霉D1在发酵第10天时还原糖含量就达到最大值,为32.33 g/100 mL,而米曲霉D3在发酵第30天才达到最大值,为108.29 g/100 mL,是D1的3.35倍。这可能是因为米曲霉D3中的降解碳水化合物类的酶酶活力也较高,可以快速分解原料中的淀粉和糊精,达到积累还原糖的目的。在发酵后期,3株米曲霉的还原糖含量因降解碳水化合物类酶的作用减弱,同时伴随着微生物利用还原糖的代谢作用而均呈现下降趋势。在整个发酵阶段,米曲霉D3还原糖含量均处在较高水平,与米曲霉D1和D2显著差异(P<0.05)。上述结果说明,在同等发酵条件下,米曲霉D3生产还原糖的能力强于米曲霉D1和D2。
图8 三株米曲霉发酵过程中还原糖含量变化
Fig.8 Changes of reducing sugar content during fermentation of 3 strains of A. oryzae
2.3.4 不同米曲霉发酵酱油中可溶性无盐固形物含量变化
可溶性无盐固形物是指酱油中内容物的含量,在一定程度上可以反映原料的利用率,也是评判酱油品质的重要标准之一[33]。通过图9可知,在发酵过程中3株米曲霉可溶性无盐固形物均呈现上升趋势,说明随着发酵的不断进行,仍有固形物溶出。其中,米曲霉D3在前15天的增长量为8.08 g/100 mL,与米曲霉D1和D2有显著性差异,这可能是由于米曲霉D3中的蛋白酶系和淀粉酶系共同原料进行水解的作用,酶活力较高,酶分解速率较快,从而使固形物含量快速增加。发酵后期,随着产酸菌的不断繁殖,与米曲霉竞争营养物质,导致营养物质下降,固形物含量也有所下降。在发酵结束时,固形物含量高达17.76 g/100 mL,达到特级酱油的标准。上述结果说明,在同等发酵条件下,米曲霉D3生成可溶性无盐固形物的能力强于米曲霉D1和D2。
图9 三株米曲霉发酵过程中可溶性无盐固形物含量变化
Fig.9 Changes of soluble salt-free solids content during fermentation of 3 strains of A. oryzae
2.4 不同米曲霉发酵酱油成品的肽分子质量分布
3株米曲霉发酵酱油的肽分子质量分布如图10所示。发酵至90 d时,>10 kDa的多肽占比最小,且米曲霉D2>D1>D3,具有显著性差异(P<0.05),这表明米曲霉D3可以更好的分解大分子质量的肽生成小分子肽。1～3 kDa肽段占整体比例最大,含量为米曲霉D2>D1>D3,差异显著(P<0.05)。而<500 Da和500～1 000 Da的肽段含量却为米曲霉D3>D2>D1,具有显著性差异(P<0.05),这更能说明米曲霉D3中的酶不仅可以将大分子肽水解生成多肽,更能将多肽水解成寡肽甚至小肽。蛋白质的降解产物对酱油口感具有相当大的影响,同时也间接作为风味物质的前体物[34]。ZHU等[35]和李莹等[36]的研究表明分子质量<500 Da或在1～3 kDa范围内的小分子肽能有效地增强酱油的鲜美和浓郁口感。总的来说,米曲霉D3产生的酶系可以更好的分解原料中的蛋白质生成小分子肽,这很有利于酱油风味的生成。
图10 三种米曲霉发酵酱醪肽分子质量分布图
Fig.10 Molecular weight distribution of 3 strains ofA. oryzae fermented peptides
图11 三株米曲霉发酵末期感官评价雷达图
Fig.11 Radar image of sensory evaluation scores of soy sauce fermented by 3 strains of A. oryzae
2.5 不同米曲霉发酵酱油成品中游离氨基酸含量分析
发酵酱油的游离氨基酸组成是决定酱油品质好坏的重要因素。3株米曲霉发酵酱油的游离氨基酸结果如表2所示。经过90 d的发酵,3株米曲霉发酵原油中游离氨基酸分别达到5.087、4.935和6.806 g/100 mL,且不同菌种间的各游离氨基酸组成均有显著性差异(P<0.05),其中米曲霉D3的总游离氨基酸含量最高,这可能跟米曲霉D3的蛋白酶酶活力较高有关,较高的蛋白酶活力可以更有效地利用原料中的蛋白质生成小分子肽,进而产生更多的游离氨基酸[37]。
表2 三株米曲霉发酵末期游离氨基酸组成
Table 2 Composition of free amino acids of 3 strains ofA. oryzae after 90 days’ fermentation
游离氨基酸/(g/100 mL)菌种名称D1D2D3鲜味氨基酸Asp0.610±0.030b0.517±0.018c0.809±0.013aGlu0.646±0.037c0.877±0.017b1.081±0.011a总含量1.256c1.394b1.890a百分含量/%24.6428.2527.77甜味氨基酸Thr0.269±0.012b0.212±0.005c0.327±0.006aSer0.311±0.015b0.276±0.008c0.434±0.006aGly0.197±0.010b0.187±0.006b0.299±0.005aAla0.303±0.013b0.275±0.006c0.388±0.005a总含量1.080b0.949c1.448a百分含量/%21.2019.2221.27甜苦味氨基酸Lys0.437±0.018b0.368±0.011c0.549±0.009aPro0.188±0.009c0.212±0.008b0.286±0.005a总含量0.625b0.580c0.835a百分含量/%12.2711.7612.27苦味氨基酸His0.142±0.006b0.122±0.004c0.174±0.003aVal0.307±0.014b0.271±0.009c0.425±0.005aTyr0.175±0.006c0.241±0.007a0.212±0.008bMet0.081±0.003b0.075±0.002c0.115±0.002aArg0.411±0.021a0.375±0.016a0.215±0.029bIle0.307±0.015b0.272±0.010c0.443±0.006aLeu0.416±0.021b0.387±0.013c0.625±0.008aPhe0.266±0.014b0.265±0.009b0.420±0.006a
续表2
游离氨基酸/(g/100 mL)菌种名称D1D2D3总含量2.106b2.008b2.630a百分含量/%41.3140.6938.63无味Cys0.030±0.001a0.004±0.000b0.004±0.002b总含量0.030a0.003b0.003b百分含量/%0.590.080.05必需氨基酸含量2.083b1.850c2.904a百分含量/%40.8737.4842.67游离氨基酸总量5.087b4.935b6.806a
注：小写字母表示同一行数据具有显著性差异(P<0.05)(下同)。
根据氨基酸的呈味特点,可以将氨基酸分为鲜味氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)、甜味氨基酸(苏氨酸Thr、丝氨酸Ser、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala)、甜苦味氨基酸(赖氨酸Lys、脯氨酸Pro)、苦味氨基酸(组氨酸His、缬氨酸Val、酪氨酸Tyr、甲硫氨酸Met、精氨酸Arg、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe)和无味氨基酸(半胱氨酸Cys)[38]。酱油中鲜味氨基酸Asp和Glu的相对含量都较高,其中Glu是贡献酱油鲜味的主要物质,米曲霉D3的鲜味氨基酸含量显著高于米曲霉D1和D2(P<0.05),在甜味氨基酸中,米曲霉D3的4种氨基酸均处于最高水平,这可能导致米曲霉D3具有更强烈的鲜甜味。除了Tyr和Arg,其余的苦味氨基酸含量在米曲霉D3中的含量均为最高,但苦味氨基酸含量高并不等同于酱油的苦味重,酱油的滋味是由多种呈味物质共同作用的结果。上述结果说明,在同等发酵条件下,米曲霉D3产生游离氨基酸的能力最强。
2.6 不同米曲霉发酵酱油成品中有机酸含量分析
有机酸对酱油风味有着至关重要的作用[39]。本实验测定了酱油原油中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、富马酸和乙酸等9种有机酸的含量,如表3所示。琥珀酸为主要的有机酸之一,其具有特殊的酸味,与柠檬酸、酒石酸一起为酱油带来独特的滋味[40]。有研究表明,乳酸可以赋予酱油圆润、绵长的口感,乙酸则具有调和口感的作用,乳酸与乙酸的比值越大,酱油的风味越好,口感更绵密[41]。对现有数据分析,米曲霉D3的乳酸与乙酸的含量有较大优势。但现有结果表明,米曲霉D1的有机酸总含量最高,而米曲霉D3的含量最低,这说明酱油的风味是多种有机酸及其他挥发性风味物质综合作用的结果。
表3 三株米曲霉发酵末期有机酸含量比较
Table 3 Comparison of the organic acid content of 3 strains of A. oryzae after 90 days’ fermentation
名称有机酸含量/(g/100 mL)D1D2D3草酸0.196±0.008b0.211±0.009ab0.236±0.018a柠檬酸0.190±0.004c3.490±0.215b2.524±0.127a酒石酸NDNDND苹果酸3.020±0.255b5.154±0.202aND琥珀酸58.221±1.747a31.372±2.116b18.607±3.670c乳酸1.720±0.074aND1.744±0.143a甲酸NDNDND富马酸0.189±0.008a0.185±0.024a0.058±0.004b乙酸13.024±1.548a5.157±0.075b1.580±0.347c总含量76.560a45.569b24.749c
注：“ND”表示未检出。
2.7 不同米曲霉发酵酱油成品的感官评价
对原油从体态、色泽、气味及口感4个方面进行感官评价,为了进一步比较不同菌株发酵的原油品质差异。结果表明,米曲霉D3样品总体得分最高,为最低得分米曲霉D2样品的1.40倍。米曲霉D3样品在体态、色泽、气味及口感4个方面均与米曲霉D1和D2有显著性差异(P<0.05)。酱油体态包括浓度、黏稠度、沉淀物及悬浮物,其中浓度指标对酱油体态起决定性作用。上述实验结果表明,米曲霉D3样品中的多肽、氨基酸、还原糖和可溶性固形物等指标均处于较高水平,这与感官评价结果相符。在酱油发酵过程中,由于酶促褐变、美拉德反应、焦糖化反应和米曲霉自身的代谢作用,生成1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、HDMF、HEMF和4-乙基愈创木酚等酱油特征风味物质,对酱油的色泽和气味产生巨大影响[26]。米曲霉D3样品的口感更加圆润,味道更加鲜美,这也是各种呈味物质相互协调、共同作用的结果。总体来说,米曲霉D3样品原油的体态、色泽、气味及整体风味的评价更好,说明米曲霉D3较米曲霉D1和D2更适合酱油生产。
3 结论
本文通过对比米曲霉D1、D2和D3在高盐稀态酱油中的发酵情况,发现米曲霉D3的高蛋白酶活力能明显提高发酵酱油中蛋白质原料的利用,同时还具有高还原糖含量、鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量。整体而言,米曲霉D3可以对酱油中滋味物质产生积极影响,能够增强酱油的风味特征,这与一直研究高蛋白酶活力菌株导向相同。本研究为选用合适的菌株进行生产实践提供理论基础。
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