陈皮是芸香科柑桔属植物橘(Citrus reticulata Blanco)的成熟品种“茶枝柑”及其栽培变种的干燥成熟果皮,自古以来就有着“陈久者良”的说法,不仅被用作传统中药,还被用于烹饪中的食品调味料、小吃和茶饮等[1],陈皮中又以广东新会陈皮品质上乘,形成广东“新会陈皮”质量的道地性[2]。元朝《饮膳正要》中记载陈皮在蒙、回和汉等民族中已被普遍使用,《本草纲目》中同样记载着“陈皮宜五脏,统治百病”的说法,清朝医师叶天仕更是在“二陈汤”中注明使用“新会皮”[3]。作为“六陈之首”,陈皮具有抗氧化、抗肿瘤、缓解疼痛、抗神经炎症等功效[4]。陈皮中主要化学成分为挥发油、黄酮类及生物碱等化合物,其中挥发油及黄酮类化合物通常被认为是主要的生物活性物质和特征性成分[5-6]。
陈皮精油是陈皮重要的高附加值产品,具有强烈的感官特征与挥发性,属于陈皮的次生代谢物之一,也被称为挥发油。挥发性成分能够客观反映出不同陈皮精油的风味特点,是精油风味品质中重要指标之一,目前研究结果表明陈皮精油中多种挥发性成分已被确认为具有抗氧化、消炎杀菌、促进消化、改善血管功能和松弛气管平滑肌等功效[7]。近年来,消费者对于中草药提取的天然活性物质的独特偏好也导致科研人员对陈皮精油等中草药精油的研究加深,以探索其更广泛的应用价值和开发潜力。
贮藏环境不同如温湿度、通风情况等对陈皮的微生物及水分含量等有重要影响,进而影响陈皮的品质[8]。目前陈皮的贮藏方式主要有标准干仓陈化(standard dry storage, SD)和自然陈化(natural aging, NA)两种。SD使陈皮处于一个长期温湿度恒定且定期通风换气的条件下;将陈皮用麻布袋包装并放置于室内阴凉处陈化则为NA,属于传统的陈皮陈化方式,相较于标准干仓陈化,其陈化速度较快,但因其温湿度不稳定,且需要在雨季对其进行翻晒处理,容易受到污染[9]。目前对于陈皮精油的研究主要集中在其抗氧化活性、挥发性成分、抑菌能力和提取工艺优化等方面,对于分析不同贮藏方式下陈皮精油品质间差异的研究未见报道。
本实验以标准干仓和自然陈化贮藏条件下0~9年陈化时间的陈皮精油为研究对象,对其得率、抗氧化活性及挥发性成分进行分析比较,旨在为两种陈皮精油的品质差异和贮藏条件鉴别提供参考依据。
本研究所用陈皮均由广东省江门市新会陈皮村市场股份有限公司提供(产地:广东省江门市新会区三江镇),分别采集于2013年至2022年共计10个年份的成熟茶枝柑干燥果皮,分别以标准干仓和自然陈化两种条件贮藏,其中标准干仓陈皮的贮藏条件为全年保持一定的温湿度并每月通风换气(温度30 ℃,湿度≤70%),自然陈化陈皮的贮藏条件为传统的自然放置于室内阴凉通风处。
无水乙醇(分析纯)、无水甲醇(分析纯),天津大茂化学试剂公司;DPPH、ABTS,上海麦克林生化科技有限公司;Trolox(维生素E衍生物),天津科密欧化学试剂有限公司;过硫酸钾、无水硫酸钠、人造沸石,天津福晨化学试剂厂;28种烷烃混标(C5~C32),上海安谱璀氏标准技术服务有限公司。
Clevenger装置,广州精科仪器有限公司;98-1-B型电子调温电热套,天津市泰斯特仪器有限公司;ME204电子分析天平,上海之信仪器有限公司;GC-MS 7890-5977B-ODP气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;Infinite 200 PRO酶标仪,帝肯奥地利有限责任公司。
1.2.1 精油的制备
采用改进型Clevenger装置水蒸气蒸馏法制备陈皮精油,准确称取陈皮50 g剪碎后装入圆底烧瓶中,加入300 mL蒸馏水浸泡2 h后,加入适量沸石,使用加热套恒温加热,自沸腾后计时加热蒸馏2 h,冷却后取上层精油,并加入适当无水Na2SO4吸去多余水分,称重,计算精油得率,以mg/g表示。样品置于4 ℃备用[10]。
1.2.2 陈皮精油GC-MS测定
采用GC-MS自动进样检测陈皮精油的挥发性成分含量。取0.1 mL陈皮精油,加入1.9 mL无水甲醇,混合均匀后通过0.22 μm的有机相滤膜,注入2 mL进样瓶备用。色谱条件:DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);气体类型:He,流速1.0 mL/min,压力2.5 kPa。进样口温度270 ℃,分流比为5∶1;进样量1 μL;程序升温:柱初温40 ℃,保持1 min,以10 ℃/min的速率升温到80 ℃,然后以3 ℃/min的速率升温到176 ℃,最后以10 ℃/min的速率升温到250 ℃,保持2 min,总运行时长为46.4 min。
质谱条件:电离方式为电子轰击离子源;电离电压70 eV;传输线温度280 ℃;离子源温度230 ℃;电子倍增器电压1 353 V;四极杆温度150 ℃;质量扫描范围33~50 u[11]。
定性:以C5~C32饱和烷烃作为标准,用相同的升温程序对正构烷烃进行分离与测定,并计算测试样品中各组分的保留指数(retention indices, RI),结合计算机NIST 14.0库进行相似度检索及参考文献和数据库中相关物质的保留指数进行共同定性,RI值的计算如公式(1)所示:
RI=100N+100n(tRa-tRN)/(tR(N+n)-tRN)
(1)
式中:N,色谱图中位于目标物质左侧正构烷烃的碳原子数;n,位于目标物质两侧的正构烷烃碳原子数之差;tRa,tRN和tR(N+n)分别是色谱图中待测物质、待测物质左侧、待测物质右侧正构烷烃的保留时间。
定量:相对含量按照峰面积归一化法计算,求出各个挥发性成分的相对含量。
1.2.3 陈皮精油体外抗氧化活性测定
ABTS阳离子自由基清除率:参考CHAKROUN等[12]的方法进行测定并进行适当修改。取2.45 mmol/L过硫酸钾溶液与7 mmol/L ABTS溶液按体积比1∶1混合,记为ABTS储备液。将其置于避光条件下反应12 h后,用无水乙醇稀释至其在734 nm波长下的吸光度为0.70±0.02,得到ABTS工作液。
用无水乙醇将精油稀释至质量浓度为10 μg/mL,取10 μL稀释后的精油与200 μL ABTS阳离子工作液加入96孔板内,摇晃均匀,避光反应6 min后于734 nm处测定其吸光值A1,以无水乙醇代替样品进行测定作为空白对照A0,测定ABTS阳离子自由基清除率,同时以相同浓度Trolox作为阳性对照,计算如公式(2)所示:
清除率
(2)
式中:A0,空白组吸光值;A1,样品组吸光值。
DPPH自由基清除率:参考AIMAD等[13]的方法进行测定并作适当修改。使用无水乙醇配置浓度为100 μmol/L的DPPH溶液,避光保存备用。用无水乙醇将精油稀释至质量浓度为25 μg/mL,取50 μL稀释后的精油与150 μL DPPH工作液加入96孔板内,摇晃均匀,避光反应10 min后于517 nm处测定其吸光值A1,以无水乙醇代替样品进行测定作为试剂空白组A0,测定DPPH自由基清除率,同时以相同浓度Trolox作为阳性对照,计算如公式(3)所示:
清除率
(3)
式中:A0,空白组吸光值;A1,样品组吸光值。
1.2.4 数据分析
所有实验处理均重复3次,结果以“平均值±标准偏差”表示;采用Excel 2019分析香气成分的相对含量;数据运用SPSS 26.0软件进行显著性分析;采用Origin 2022与SIMCA 13.0绘图。
不同贮藏方式的10个陈化年份陈皮精油提取得率如图1所示,伴随陈化年份增加,陈皮内精油挥发导致提取率呈下降趋势,这与侯焕瑶等[14]报道的陈化过程精油含量变化规律一致。两种贮藏方式下陈皮精油得率变化趋势相似,表现为新皮(0年皮)精油得率相接近,无显著性差异(P>0.05),在陈化1年期间内精油得率显著下降,且陈化1~3年期间内精油得率无显著性差异(P>0.05);陈化4年精油得率呈下降趋势,4~6年间变化趋势平缓,无显著性差异(P>0.05);在陈化7~9年期间精油得率持续下降,且两种不同贮藏方式陈皮间具有显著性差异(P<0.05)。在陈皮陈化过程中,陈皮内水分含量和水分活度下降[15],大分子挥发油发生转化脱水分裂减少,进而导致油胞发生皱缩[16]。同时,陈皮陈化过程中常伴随着微生物的生长,研究表明微生物的代谢产生纤维素酶等可以分解植物细胞壁结构[17],进而导致挥发油含量的减少。同时可以观察到,标准干仓贮藏条件下各陈化年份陈皮精油得率均高于自然陈化陈皮,新皮与陈化9年陈皮间下降率显著低于自然陈化陈皮(降幅分别为68.44%和74.20%,P<0.05),实验结果表明,标准干仓贮藏条件对于陈皮内挥发油的保留效果优于自然陈化贮藏条件,猜测是由于标准干仓贮藏条件下温湿度恒定,在陈化过程中减少陈皮沾染灰尘水汽、堆放“烧皮”、虫蛀、霉变等情况出现,更利于陈皮的陈化品质提高[9]。
图1 不同贮藏方式陈皮精油得率
Fig.1 The yield of essential oil of PCR in different storage methods
注:同一贮藏方式样品中同一系列字母不同代表组间差异显著(P<0.05);*表示相同陈化年份不同贮藏方式间差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。
利用GC-MS对标准干仓及自然陈化两种不同贮藏方式各10个陈化年份的陈皮精油进行香气化合物成分及相对含量进行分析鉴定,采用NIST 14.0谱库及正构烷烃混合物计算RI值分别对各色谱峰进行相似度检索比较,并且选择相似匹配度≥80的检索结果作为有效香气物质成分,筛选出两种不同贮藏方式陈皮精油的共有香气成分,使用面积归一化法并取平均值对各挥发性成分进行相对百分含量计算。
由表1可知,通过筛选得到两种不同贮藏条件下陈皮精油共有香气成分65个,分别占总挥发性成分的99.33%和99.49%。其中萜烯类21种、醇类14种、酯类8种、酸类7种、醛类5种、杂环类5种、酚类3种和酮类2种。因此以65个共有香气成分作为因变量,不同贮藏方式及陈化年份作为自变量,通过偏最小二乘回归分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)得到两种贮藏方式下陈皮精油的分布情况,如图2-a所示,除自然陈化0年精油以外,其余年份自然陈化陈皮精油均分布在横轴的正半轴,所有年份标准干仓陈皮精油则全部分布在横轴的负半轴,因此PLS-DA分析能够有效说明不同贮藏方式对于陈皮精油香气具有一定影响,能够实现两种贮藏方式陈皮精油的有效区分。在本次分析中自变量的拟合指数(Rx2)为0.571,因变量拟合指数(Ry2)为0.982,模型预测指数(Q2)为0.52,R2和Q2均超过0.5,表示该模型拟合结果可接受。且在经过200次置换检验后,结果如图2-b所示,Q2回归线与纵轴相交点在零点以下,表明该模型验证有效,不存在过拟合,认为该实验结果可以用于陈皮精油不同贮藏方式的鉴别分析。
表1 不同贮藏方式陈皮精油挥发性成分
Table 1 Volatile components of essential oil of PCR in different storage methods
序号类别化合物保留时间RICAS号相对含量/%标准干仓陈皮精油自然陈化陈皮精油P值VIP值123456789101112131415161718192021萜烯α-侧柏烯6.78926002867-05-20.47±0.070.54±0.000.1670.842(1R)-(+)-α-蒎烯6.95933007785-70-81.63±0.041.84±0.100.0291.163莰烯7.36951000079-92-50.04±0.000.05±0.000.0740.7323-甲基-1-(O-甲基乙基)双环[2.4.1]己烯-1-烯7.47956028634-89-11.21±0.061.50±0.290.1661.7473-异丙基-6-亚甲基-1-环己烯7.89974000555-10-20.14±0.020.19±0.110.4760.968β-蒎烯8.04981000127-91-31.63±0.021.58±0.010.0250.551α-水芹烯8.771 009000099-83-20.10±0.000.13±0.040.2531.636D-柠檬烯9.741 041005989-27-557.34±0.8855.85±0.480.0610.962萜品油烯10.361 062000586-62-91.41±0.031.43±0.050.5390.697γ-松油烯10.441 064000099-85-413.74±0.9813.83±0.230.8790.720对薄荷-1,3,8-三烯12.101 116018368-95-10.04±0.000.05±0.000.0021.2434-乙酰基-1-甲基-环己烯12.701 132006090-09-10.01±0.000.02±0.000.0010.6902,6-二甲基-2,6-辛二烯21.161 348002792-39-40.03±0.000.03±0.000.0010.709α-荜澄茄油烯21.361 353017699-14-80.02±0.010.02±0.010.1730.842蒎烯22.191 374003856-25-50.06±0.000.07±0.010.3451.154β-榄香烯22.781 388000515-13-90.03±0.000.03±0.000.1350.702石竹烯24.031 419000087-44-50.19±0.000.19±0.000.0150.371Z,Z,Z-1,5,9,9-四甲基-1,4,7,-环十一碳三烯25.421 4541000062-61-90.03±0.000.03±0.000.2690.577右旋大根香叶烯26.481 480023986-74-50.02±0.000.03±0.010.2230.825α-法呢烯27.391 503000502-61-40.52±0.010.50±0.000.1850.375石竹素30.341 579001139-30-60.06±0.010.08±0.010.0451.123合计78.72±0.39a77.97±0.65a2223242526272829303132333435醇芳樟醇11.581 101000078-70-60.40±0.000.36±0.000.0010.887反-1-甲基-4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇12.491 126029803-81-40.04±0.000.04±0.000.0420.775反式-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯醇12.731 133007212-40-00.06±0.000.09±0.010.0121.544顺-4-异丙基-1-甲基环己基-2-烯-1-醇13.111 143029803-82-50.03±0.000.04±0.000.0760.5702-莰醇14.231 174000507-70-00.05±0.000.07±0.000.0761.244(-)-4-萜品醇14.571 183020126-76-50.99±0.011.06±0.020.0041.164对甲基苯异丙醇14.781 189001197-01-90.12±0.000.18±0.000.0011.180α-松油醇15.141 198000098-55-51.45±0.011.45±0.010.3400.9423-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇15.601 210016721-38-30.03±0.000.03±0.000.2171.175顺-2-甲基-5(- 1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇15.981 220001197-06-40.20±0.000.21±0.000.0170.580香茅醇16.221 207000106-22-90.11±0.020.10±0.020.5330.332香芹醇16.501 233000099-48-90.07±0.000.09±0.010.0060.876榄香醇29.071 546000639-99-60.06±0.000.06±0.000.0010.609桉油烯醇30.141 574006750-60-30.08±0.010.07±0.010.2100.757合计3.70±0.05a3.85±0.04b3637383940414243酯(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯21.521 357000141-12-80.03±0.000.04±0.000.0010.6202-(甲氨基)苯甲酸甲酯23.661 410000085-91-67.06±0.097.10±0.050.6000.543棕榈酸甲酯40.821 927000112-39-00.06±0.000.06±0.000.8740.613邻苯二甲酸二丁酯41.271 955000084-74-20.03±0.000.03±0.000.0442.128棕榈酸乙酯41.881 994000628-97-70.04±0.000.05±0.010.0940.500亚麻酸甲酯43.252 847000301-00-80.06±0.000.06±0.000.7280.688亚油酸甲酯43.252 858000112-63-00.07±0.030.07±0.010.9250.786亚麻酸乙酯44.023 033001191-41-90.06±0.010.08±0.010.3150.692合计7.43±0.09a7.49±0.06a
续表1
序号类别化合物保留时间RICAS号相对含量/%标准干仓陈皮精油自然陈化陈皮精油P值VIP值44454647484950酸正癸酸22.011 369000334-48-50.11±0.000.13±0.010.0250.970月桂酸29.841 567000143-07-70.39±0.000.37±0.010.0070.654肉豆蔻酸37.041 765000544-63-80.23±0.010.22±0.000.4480.592棕榈油酸41.101 927000373-49-90.23±0.010.2±0.010.0550.362棕榈酸41.531 971000057-10-32.46±0.022.59±0.030.0030.538亚油酸43.162 684000060-33-31.19±0.021.29±0.030.0120.527α-亚麻酸43.772 921000463-40-11.08±0.031.31±0.010.0010.519合计5.68±0.03a6.09±0.03b5152535455醛辛醛8.671 006000124-13-00.18±0.010.12±0.020.0060.683壬醛11.741 106000124-19-60.07±0.000.08±0.000.0670.729癸醛15.461 207000112-31-20.21±0.000.26±0.000.0012.1044-(1-甲基乙烯基)-1-环己烯-1-甲醛18.241 276002111-75-30.12±0.030.12±0.010.8660.809α-甜橙醛36.541 750017909-77-20.81±0.011.37±0.010.0012.609合计1.38±0.03a1.94±0.02b5657585960杂环1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)苯11.311 093001195-32-00.07±0.000.07±0.000.1930.7672,3-二氢-2-甲基苯并呋喃12.861 136001746-11-80.04±0.010.04±0.010.8340.6662-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯16.341 229001076-56-80.05±0.000.05±0.000.0191.6851H-环戊[1,3]环丙[1,2]苯, [3aS-(3aα,3bβ,4β,7α,7aS∗)]-八氢-7-甲基-3-亚甲基-4-(1-甲基乙基)22.901 391013744-15-50.02±0.000.02±0.000.8030.6611,2,3,5,6,8a-六氢-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-萘27.881 516000483-76-10.09±0.000.10±0.000.0010.662合计0.26±0.01a0.28±0.01a616263酚麝香草酚18.531 283000089-83-81.08±0.031.08±0.010.7980.5133-甲基-4-异丙基苯酚19.041 296003228-02-20.68±0.080.52±0.020.0310.9344-乙烯基-2-甲氧基苯酚19.581 309007786-61-00.27±0.010.16±0.000.0010.944合计2.03±0.05b1.76±0.03a6465酮右旋香芹酮16.971 244002 244-16-80.10±0.010.08±0.010.0420.9503-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮17.371 254000 089-81-60.02±0.000.02±0.000.0821.559合计0.12±0.01a0.10±0.01a总计99.33±2.65a99.49±1.72a
注:P值为根据显著性检验方法所得到的用以判定检验结果的参数,一般在P<0.05时认为结果具有统计学意义,表现为差异显著;VIP值为变量对模型的重要性,描述了每一个变量对模型的总体贡献,通常设定阈值为VIP>1;同一类别物质中字母不同代表组间差异显著(P<0.05)。
a-PLS-DA;b-模型交叉验证结果
图2 不同贮藏方式陈皮精油的PLS-DA及模型交叉验证结果
Fig.2 PLS-DA and model cross-validation results of essential oil of PCR in different storage methods
根据香气物质成分的峰面积及保留时间参数,建立起不同贮藏方式陈皮精油的香气指纹图谱如图3所示。各精油样品间指纹图谱具有显著差异,香气种类相似但物质相对含量具有差异,含量最高的香气成分为萜烯类,其次酯类、酸类、醇类、酚类、醛类、杂环类和酮类。其中自然陈化陈皮精油中酸类、醇类和醛类化合物相对含量显著高于标准干仓陈皮精油,而酚类物质则显著低于标准干仓陈皮精油(P<0.05)。
图3 不同贮藏方式陈皮精油香气指纹图谱
Fig.3 Aroma fingerprints of essential oil of PCR in different storage methods
两种贮藏方式陈皮精油中所检测出含量最高的萜烯类物质是D-柠檬烯和γ-松油烯,赋予陈皮精油柑橘、果香及芳香香气,该实验结果与何静等[18]、杨雪燕等[19]所报道的一致。D-柠檬烯作为柑橘属最主要的特征香气物质,分别占标准干仓和自然陈化两种陈皮精油萜烯类物质的72.84%和71.63%,但是在两种贮藏方式下没有存在显著性差异(P>0.05);γ-松油烯分别占萜烯类物质的17.45%和17.74%,与D-柠檬烯共同赋予陈皮精油柑橘及柠檬香气。在标准干仓和自然陈化两种贮藏方式陈皮精油中分别检测出14种醇类物质,其中含量较高的3种是α-松油醇、(-)-4-萜品醇和芳樟醇,但因其气味阈值较高,因而对精油整体风味贡献不大,对提高花果香气及木青香气具有积极作用。在两种陈皮精油内共鉴定出酯类物质8种,分别占标准干仓和自然陈化陈皮精油总含量的7.43%和7.49%,其相对含量并不呈现出显著性差异(P>0.05),其中2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作为新会陈皮的标志性风味物质之一,赋予陈皮精油特有持久柔和的柑果香气与松木香气[2],分别占标准干仓与自然陈化陈皮精油酯类物质的95.02%和94.79%,不存在显著性差异(P>0.05);陈皮精油中酸类物质以棕榈酸、亚油酸和α-亚麻酸为主,表现为甜蜡脂气味和植物油香气,且因其阈值较高,对整体风味影响较小,其中棕榈酸可用作酯化的底物以参与具有特殊风味的酯类物质的形成[20],利于增强陈皮精油整体风味。醛类物质通常被认定为具有花香与果香,阈值较低,气味浓烈,因此在其含量超过一定限值时会出现腐败味对整体风味呈现负面影响[21],所以标准干仓陈皮精油中醛类物质呈现出的整体风味相对更柔和。两种陈皮精油中含量最高的醛类物质均为α-甜橙醛,赋予精油新鲜橘子香气,修饰整体风味。酚类物质以麝香草酚为主,对陈皮精油起到增加辛辣风味的作用,在两种贮藏方式中不存在显著性差异(P>0.05)。
2.2.1 不同贮藏方式陈皮精油香气成分差异分析
为了进一步分析香气成分对于不同贮藏方式下陈皮精油的贡献作用,选出差异香气化合物,从65个共有香气成分中以P<0.05和VIP>1为筛选条件进一步筛选得到10个差异香气物质,其中萜烯类3种、醇类3种、醛类2种、酯类1种和杂环类1种,如图4所示。其中邻苯二甲酸二丁酯、石竹素、对薄荷-1,3,8-三烯、对甲基苯异丙醇和2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯在标准干仓陈化后期精油内含量较高;自然陈化陈皮精油中含量相对较高的香气物质为反式-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯醇、α-甜橙醛和邻苯二甲酸二丁酯。
图4 不同贮藏方式陈皮精油的差异香气成分聚类热图
Fig.4 Heatmap of differential aroma components of essential oil of PCR with different storage methods
2.2.2 基于差异香气成分的不同贮藏方式陈皮精油判别分析
为了对不同贮藏方式陈皮精油香气物质分析得到更加准确且直观的结果,基于10种差异香气成分,对两种不同贮藏方式的20个陈皮精油样品的香气数据进行分析。利用PLS-DA分析对10个差异香气物质进行PC降维分析,得到前两个PC的两种贮藏方式陈皮精油的分散散点图如图5所示,其中PC1和PC2的方差贡献率分别为28.6%和24.6%,累计方差贡献率达到53.2%,因此认为所选取的PC1和PC2对于样品的分析可以基本反应出不同样本中的主要特征信息,可靠性较好[22]。在PLS-DA中,除标准干仓陈化1年精油样品以外,其余标准干仓陈皮精油均分布在横轴的负半轴,而自然陈化陈皮精油则全部分布于横轴的正半轴上,因此可以认为筛选的10种差异香气成分对于区分判别不同贮藏方式下的陈皮精油具有良好效果。
图5 不同贮藏方式陈皮精油差异香气成分的PLS-DA
Fig.5 PLS-DA plot of essential oil of PCR with different storage methods
a-ABTS阳离子自由基清除率;b-DPPH自由基清除率
图6 不同贮藏方式陈皮精油ABTS阳离子自由基清除率和DPPH自由基清除率
Fig.6 ABTS cationic radicals scavenging and DPPH radicals scavenging of essential oil of PCR in different storage methods
注:同一贮藏方式样品中同一系列字母不同代表组间差异显著(P<0.05);*表示相同陈化年份不同贮藏方式间差异显著(P <0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。
近年来,植物精油作为天然抗氧化剂已经被广泛用作食品工业和功能食品中的食品添加剂[23],MUHAMMAD等[24]报道天然肉桂精油可代替食品中的合成添加剂以提高食品的抗氧化活性;UÇCAR等[25]使用柑橘精油构建纳米乳液并利用其抗氧化活性抑制鱼类肌肉组织中的脂肪酸氧化取得良好效果。陈皮作为天然抗氧化剂提取来源,其精油与黄酮类化合物通常被认为是主要的生物活性物质和特征性成分,普遍具有抗氧化功效。
采用ABTS和DPPH两种方法来评估陈皮精油的抗氧化活性。两种贮藏方式陈皮精油均表现为新皮自由基清除率最低而陈化9年精油自由基清除率最高,并且伴随着陈化年份的增加,精油自由基清除能力显著增强(P<0.05),GAO等[26]对比5个不同陈化年份陈皮精油的抗氧化活性并报道精油的还原能力随陈化贮藏时间的延长而增强,与本实验研究结果一致。有研究结果表明精油中萜烯类、酚类和酮类是使其发挥抗氧化活性的主要成分,特别是酚羟基的作用,可以通过提供氢离子,中和自由基、与金属离子螯合及作为脂肪过氧化链式反应过程中过氧自由基的供体来达到其抗氧化作用[27-28],陈皮精油在陈化过程中其萜烯类、酚类及醛酮类物质含量增加[29],为其抗氧化活性的增强提供物质基础,同时证实了陈皮作为中药其药理活性逐日增强这一说法。
ABTS结果表明在陈化0~2年期间,抗氧化能力平缓增加,而标准干仓贮藏条件下陈皮精油在陈化3~5年内ABTS阳离子自由基清除率显著增加(P<0.05),在陈化6年时有所下降,而后保持上升趋势;自然陈化陈皮在陈化3年时抗氧化能力显著提升随后保持上升趋势(P<0.05)。在陈化3年后,两种贮藏方式下陈皮精油的ABTS阳离子自由基清除率都在50%以上,但均小于同等浓度下Trolox的清除能力。说明在陈化3年期间内,属于陈皮精油抗氧化能力的提升的重要阶段。DPPH法表明标准干仓陈皮精油在陈化3年期间内同样出现显著增加的趋势(P<0.05),而自然陈化陈皮精油抗氧化清除率增幅相对平缓,两种贮藏方式陈皮精油的DPPH自由基清除率均远小于同等浓度下Trolox的清除能力。ABTS与DPPH法抗氧化清除率结果相一致,均表现为标准干仓陈皮精油抗氧化能力强于自然陈化陈皮精油,且结合表1可知标准干仓陈皮精油中萜烯类、酚类和酮类化合物相对含量较高,特别是酚类化合物含量显著高于自然陈化陈皮精油,说明相对于自然陈化贮藏方式,标准干仓贮藏对于陈皮内精油抗氧化活性物质的积累作用更优,推测是由于标准干仓贮藏条件下更有利于陈皮表面微生物生长,并使其生理生化特征稳定,更有利于活性物质的积累。
为了进一步分析陈皮精油中具体成分与抗氧化活性间的关系,从使其主要发挥抗氧化活性的萜烯类、酚类和酮类物质中挑选出11种化合物,将其与抗氧化活性进行相关性分析,结果如图7所示,颜色越红代表其偏正相关,越绿代表偏负相关。可知在标准干仓陈化贮藏条件下,陈皮精油中γ-松油烯、β-蒎烯、3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮和萜品油烯与ABTS阳离子自由基和DPPH自由基清除率均呈现正显著相关,3-甲基-4-异丙基苯酚和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚与ABTS阳离子自由基和DPPH自由基清除率则呈现负显著相关;在自然陈化陈皮精油中,ABTS阳离子自由基清除率与γ-松油烯、萜品油烯和3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮显示出正显著相关,与4-乙烯基-2-甲氧基苯酚和D-柠檬烯呈现出负显著相关关系,DPPH自由基清除率与γ-松油烯、3-甲基-1-(O-甲基乙基)双环[2.4.1]己烯-1-烯、萜品油烯和右旋香芹酮呈现出正显著相关,与3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮和(1R)-(+)-α-蒎烯呈现负显著相关。由此可见,对两种不同贮藏方式下陈皮精油的抗氧化活性起作用的物质不完全相同,但都表现出与γ-松油烯和萜品油烯呈现正相关关系,实验结果与前人报道一致[30],但是关于香气化合物之间对抗氧化活性是否具有协同效应还有待进一步研究。
a-标准干仓陈皮精油;b-自然陈化陈皮精油
图7 陈皮精油抗氧化活性与11种香气化合物的相关热图
Fig.7 Correlation heatmap of essential oil of PCR of the antioxidant activity and 11 aroma compounds
注:2-(1R)-(+)-α-蒎烯;4-3-甲基-1-(0-甲基乙基)双环[2.4.1]己烯-1-烯;6-β-蒎烯;8-D-柠檬烯;9-萜品油烯;10-γ-松油烯;61-麝香草酚;62-3-甲基-4-异丙基苯酚;63-4-乙烯基-2-甲氧基苯酚;64-右旋香芹酮;65-3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮。
本实验以两种不同贮藏方式下的10个陈化年份陈皮精油为研究对象,对其得率、挥发性成分和抗氧化活性进行分析比较。实验结果表明,两种贮藏方式陈皮精油得率伴随陈化年份增加而呈现下降趋势,且标准干仓陈皮下降率显著低于自然陈化陈皮。两种贮藏方式陈皮精油香气成分种类一致,共检测出65种共有香气成分,以萜烯类、醇类为主,但其相对含量具有一定差异,表现出明显的贮藏条件特征。其中自然陈化条件下酸类、醇类和醛类物质相对含量显著高于标准干仓陈皮精油,而酚类物质则显著低于标准干仓。筛选得到10个香气物质[(1R)-(+)-α-蒎烯、癸醛和(-)-4-萜品醇等]在两种贮藏方式中含量具有显著性差异,对于阐明不同贮藏方式下陈皮精油的差异具有一定意义,为辨别贮藏方式不一致的陈皮精油提供科学依据。两种精油自由基清除率变化趋势一致,随陈化时间的增加而提高,且标准干仓陈皮精油增加率更高,这与其萜烯类、酚类和酮类物质含量较自然陈化陈皮精油更高呈现出正相关关系,同时相关性分析表明γ-松油烯和萜品油烯与抗氧化活性呈现显著正相关,为其抗氧化活性提供物质基础。说明与自然陈化相比,标准干仓贮藏条件对于陈皮精油含量及其活性物质积累效果更优。
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