高尿酸血症(hyperuricemia, HUA)表现为血清异常升高的尿酸水平。HUA不仅可诱发痛风,还与肾脏疾病、心血管疾病以及糖尿病、高血压等疾病的发生与发展紧密相关[1-2]。目前高尿酸血症的治疗药物主要分为排尿酸药和抑制尿酸生成药[3]。排尿酸药物主要包括苯溴马隆和丙磺舒。它们的作用是抑制肾小管重吸收作用,从而促进尿酸的排泄。抑制尿酸生成药物主要包括别嘌醇和非布司他。它们通过降低黄嘌呤氧化酶活性,使次黄嘌呤和黄嘌呤无法反应生成尿酸,从而降低尿酸含量。以及其他增强尿酸降解的药物,如拉布立酶是一种重组尿酸酶抑制剂,它可以将尿酸分解为可溶性产物排出。虽然这些药物可有效降低尿酸,但可能会引起各种副作用,例如过敏、超敏反应、胃肠道疾病和肝肾功能障碍[4]。而服用益生菌是一种安全有效缓解HUA的方法。最近的研究表明,益生菌可以促进嘌呤和尿酸分解代谢,调节转运蛋白对尿酸的吸收或分泌,代谢物促成尿酸分解和排泄以及改善HUA引起的肠道炎症反应等[5]。一株从鸡肠道微生物群中分离的L.aviarius CML180,可以通过降解嘌呤核苷(肌苷和鸟苷)来预防HUA的发生[6];此外,在高果糖诱导的HUA动物模型中,短乳杆菌DM9218能够降低血尿酸水平和提高肝脏黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)活性,其机制是通过降解肌苷,调节肠道菌群失衡以及相关的LPS炎症反应来实现的[7]。乳酸菌通过促进短链脂肪酸产生,抑制血清和肝脏XOD活性,促进肠道中UA的分解排泄[8]。菌株嗜黏蛋白阿克曼菌通过调节肾脏和肠道中尿酸盐转运蛋白1(urate anion transporter 1, URAT1)、葡萄糖转运蛋白(glucose transporter 9, GLUT9)和ATP结合盒亚家族G成员2(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG2)的表达来促进HUA模型小鼠尿酸的排泄[9]。目前为止,格氏乳杆菌如何发挥抗高尿酸血症作用仍未得到有效探索。因此,本研究以高尿酸血症小鼠模型为例,研究了活菌和巴氏杀菌对高尿酸血症小鼠尿酸水平的影响,并通过尿酸合成和排泄、肾脏炎症的变化探讨了可能的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
实验所用的格氏乳杆菌CCFM1346由江南大学食品微生物菌种保藏中心(Culture Collection of Food Microorganisms, CCFM)提供。
1.1.2 药品及试剂
MRS培养基,青岛海博生物技术有限公司;XOD活性检测试剂盒、UOX活性检测试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;尿酸ELISA试剂盒,上海酶联生物技术有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;逆转录试剂盒、qPCR试剂盒,南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Multiscan Go多功能酶标仪、ZHJH_C1115B超净工作台,上海智诚有限公司;HWS-150恒温恒湿培养箱,上海森信有限公司;UV-1800紫外分光光度器,苏州岛津公司;EL3002分析天平、FE-20pH计,上海梅特勒公司;542R高速离心机,德国艾本德公司;MLS-3750蒸汽灭菌锅,日本三洋公司;高通量组织研磨机,宁波新芝生物科技股份有限公司;切片电子扫描仪,匈牙利3DHISTECH公司;PCR扩增仪T100、实时荧光定量PCR仪、PCR仪,美国Bio-Rad公司。
1.3 实验方法
1.3.1 细菌培养和制备
格氏乳杆菌CCFM1346在MRS培养基中有氧培养。通过平板计数计算格氏乳杆菌的细菌浓度。为了制备巴氏杀菌形式,离心后的细菌沉淀用PBS洗涤两次,在70 ℃下灭菌30 min,随后冻干,-80 ℃储存备用。
1.3.2 动物实验
40只4周龄的健康雄性ICR小鼠饲养于江南大学动物实验中心SPF级别屏障环境,保持温度20～26 ℃、相对湿度40%～60%。动物方案通过江南大学实验动物伦理委员会批准(合格编号:JN.编号:JN.No20230415i1360531[135])。小鼠适应性喂养1周后,随机分为5组(空白组、模型组、阳参组、活菌组和死菌组),每组8只小鼠。为了诱发高尿酸血症,模型组、阳参组和给药组每天上午7:00灌胃给予氧嗪酸钾(280 mg/kg),空白组接受体积分数为0.9%的生理盐水。同天上午9:00,模型组和空白组接受体积分数为0.9%生理盐水治疗;阳参组接受10 mg/kg别嘌醇治疗;活菌组接受5×109 CFU/g格氏乳杆菌CCFM1346活菌;死菌组接受5×109 CFU/g格氏乳杆菌CCFM1346灭活菌。造模3周后,对小鼠进行眼部静脉丛取血,采集肝脏和肾脏。取小鼠的左肾固定在4%多聚甲醛溶液中。组织样本在液氮中迅速冷冻,-80 ℃保存。血液样本离心(3 500×g,15 min)取上清液,-80 ℃保存。
1.3.3 肾脏病理学切片和生化分析
肾脏样本进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,通过Pannoramic MIDI数字切片扫描仪扫描成片,观察评估肾脏切片病理学特征。小鼠肾脏的器官指数为小鼠肾脏质量与小鼠体重的比值。小鼠血清和尿液中尿酸水平通过ELISA试剂盒进行定量。小鼠肝脏XOD和UOX酶活力的表达按照试剂盒的方法进行。
1.3.4 实时荧光定量PCR
使用TRIzol试剂提取肾脏样本的RNA,按照逆转录试剂盒说明反转录得到cDNA。肾脏mRNA水平以GAPDH进行统一标准。实验检测基因包括URAT1、GLUT9、ABCG2、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、半胱天冬酶-1前体(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, Caspase-1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)和GAPDH。对应的引物序列见表1。
表1 基因引物序列
Table 1 Primer sequence of genes
目的基因基因序列(5′-3′)基因序列(3′-5′)URAT1GACCTTGGACCCGATGTTCTTCTGCGTGGCGTTGGACTCTGTAAGCGLUT9ATGTGGACTCAATGCGATCTGGTTCTGTTTCAATTCCTCCCGTGCTCAGABCG2TAAATGGAGCACCTCAACCTGAGATGCCACGGATAAACTGCaspase1AACCACTCGTACACGTCTTGCCCCAGATCCTCCAGCAGCAACTTCASCAGACCACCAGCCAAGACAAGCTCCAGGTCCATCACCAAGTNLRP3AGCCTCAGGGCACCAAAGGGATGAAGCACATAGTAAACATNF-αTGGAACTGGCAGAAGAGGCACTAGAGGCTGAGACATAGGCACCGIL-1βACCTGGGCTGTCCTGATGAGAGTGT TGATGTGCTGCTGCGAGATIL-6GTTCTCTGGGAAATCGTGGAGGAAATTGGGGT AGGAAGGAGAPDHGTGAAGGTCGGTGTGAACGGGTGATGGCATGGACTGTGGTC
1.3.5 数据分析
两组间的差异采用t值检验;两组以上的差异采用单因素方差分析。利用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。P<0.05被认为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 格氏乳杆菌对小鼠体重和肾脏的影响
通过肾脏指数评估小鼠肾脏受损状况。如图1-a所示,与空白组相比,模型组小鼠肾脏指数显著升高(P<0.01),提示肾脏增生和肥大的可能性。而活的和巴氏杀菌的格氏乳杆菌CCFM1346可以缓解肾脏指数的增加(P<0.05)。如图1-b所示,与空白组相比,模型组小鼠体重骤升,摄入格氏乳杆菌CCFM1346可以缓解小鼠体重的增加。
a-小鼠肾脏指数;b-小鼠体重变化
图1 小鼠肾脏指数和体重
Fig.1 Mice kidney index and body weight
注:**表示P<0.01,*表示P<0.05(下同)。
如图2所示,空白组小鼠肾脏无病理学损伤。相比于空白组,模型组小鼠肾脏切片出现明显肾小管上皮细胞水样变性,细胞肿胀,胞质疏松、淡染等症状(黑色箭头所示)。与模型组相比,活菌组以及死菌组的肾损伤均有不同程度改善。
图2 肾脏HE染色
Fig.2 HE staining of the kidneys
注:最终放大倍率为200×。
2.2 格氏乳杆菌对小鼠血清和尿液UA水平的影响
如图3-a所示,模型组小鼠血清UA水平较空白组小鼠显著升高(86.47%,P<0.000 1),表明高尿酸血症模型建立成功。与模型组小鼠相比,阳参组、活菌组和死菌组分别使高尿酸血症小鼠血清尿酸浓度显著降低了82.62%、82.19%和77.45%,并接近空白组(P<0.000 1)。
a-血清尿酸水平;b-尿液尿酸水平
图3 小鼠血清以及尿液中UA水平
Fig.3 UA levels in serum and urine of mice
注:****表示P<0.000 1,***表示P<0.001(下同)。
通过检测尿液中的UA来确定小鼠UA的排泄。如图3-b所示,与模型组小鼠相比,阳参组和死菌组分别使模型小鼠尿液中UA浓度显著增加了24.86%(P<0.05)和38.09%(P<0.001)。相比于活菌组,死细菌对UA排泄表现出更好的促进作用。这些结果表明,格氏乳杆菌CCFM1346活菌和死菌均可以有效降低HUA小鼠血清UA水平,促进尿液中UA的排泄。
2.3 格氏乳杆菌对小鼠肝脏的影响
XOD对体内尿酸的合成很重要。如图4-a所示,模型组肝脏XOD活性明显高于空白组(P<0.000 1)。与模型组相比,阳参组、活菌组和死菌组小鼠肝脏XOD活性受到了抑制,分别降低了66.96%、45.72%和75.35%(P<0.000 1)。死细菌对XOD抑制活性优于活细菌,并且和药物别嘌醇治疗效果接近。表明格氏乳杆菌CCFM1346可以通过抑制肝脏XOD的表达来减少UA的生成。
a-肝脏XOD活性;b-肝脏UOX活性
图4 小鼠肝脏XOD和UOX活性
Fig.4 XOD and UOX activities in kidney of mice
UOX可以进一步促进尿酸的降解。如图4-b所示,与模型组相比,阳参组、活菌组和死菌组小鼠肝脏UOX活性得到了显著提高,分别升高了44.07%(P<0.01)、47.20%(P<0.001)和39.45%(P<0.01)。表明格氏乳杆菌CCFM1346可以通过促进UOX的表达来增加UA的排泄。
2.4 格氏乳杆菌对小鼠肾脏转运蛋白的表达的影响
UA在肾脏的重吸收和分泌取决于各种尿酸转运蛋白。如图5-a～图5-c所示,相比于空白组,模型组小鼠肾脏尿酸重吸收转运蛋白GLUT9和URAT1 mRNA表达显著增高(P<0.000 1),尿酸排泄蛋白ABCG2 mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,阳参组、活菌组和死菌组显著降低了肾脏中GLUT9(94.12%、85.33%和92.29%,P<0.000 1)和URAT1(25.43%、78.96%和84.02%,P<0.01)的表达。与模型组相比,阳参组和死菌组显著升高了肾脏中ABCG2(52.32%和58.38%,P<0.01)的表达,并且死菌组促进ABCG2的表达能力优于活菌组(P<0.001)。这些结果表明,格氏乳杆菌CCFM1346可以通过下调肾脏尿酸重吸收转运蛋白URAT1和GLUT9的表达以及上调尿酸排泄蛋白ABCG2的表达,来促进肾脏UA的重吸收与排泄。
a-肾脏ABCG2表达水平;b-肾脏GLUT9表达水平;c-肾脏URAT1表达水平
图5 小鼠肾脏转运蛋白表达水平
Fig.5 Expression levels of kidney transporters in mice
2.5 格氏乳杆菌对小鼠肾脏炎症小体和炎症因子表达的影响
HUA已被证明与炎症密切相关。如图6-a～图6-c所示,在小鼠肾脏组织中,炎症小体NLRP3、ASC和Caspase1基因表达较空白组显著增强(P<0.001),促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达较空白组显著提高(P<0.01)。与模型组相比,阳参组、活菌组和死菌组分别降低了小鼠肾脏中NLRP3(33.66%、32.68%和47.06%)、ASC(64.65%、14.33%和55.81%)和Caspase1(72.55%、38.41%和77.10%)的基因表达。其中,死菌组对ASC和Caspase1基因下调能力显著优于活菌组(P<0.001)。与模型组相比,阳参组、活菌组和死菌组显著降低了小鼠肾脏中IL-1β(75.78%、67.43%和72.86%)、IL-6(21.07%、67.43%和72.16%)和TNF-α(40.98%、50.50%和51.88%)的基因表达。表明格氏乳杆菌CCFM1346通过抑制TXNIP/NLRP3信号通路,降低炎症小体NLRP3、ASC和Caspase-1以及肾脏炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达,从而改善肾脏炎症。
a-肾脏炎症小体NLRP3表达水平;b-肾脏炎症小体ASC表达水平;c-肾脏炎症小体Caspase1表达水平;d-肾脏炎症因子IL-1β表达水平;e-肾脏炎症因子IL-6表达水平;f-肾脏炎症因子TNF-α表达水平
图6 小鼠肾脏炎症小体和炎症因子表达
Fig.6 Expression of inflammasome and inflammatory factors in mice kidney
3 结论
氧嗪酸钾可竞争性抑制尿酸酶的活性,从而阻碍尿酸分解,升高小鼠体内尿酸水平。采用口服强饲法给予氧嗪酸钾持续3周,建立HUA模型[10]。本研究中模型组小鼠血清尿酸水平显著升高,肝脏XOD水平显著升高,说明造模成功,具有参考价值。
HUA发生的主要原因是尿酸在肝脏合成过多和在肾脏(2/3)及肠道(1/3)中排泄减少[11]。其中,XOD是尿酸分解代谢中重要的酶,催化次黄嘌呤转变成黄嘌呤,最终生成UA[12]。梁圆等[13]发现抑制XOD活性能够显著降低小鼠UA水平。本研究结果显示,格氏乳杆菌活菌和死菌显著降低血清尿酸水平,抑制肝脏中的黄嘌呤氧化酶以及促进尿酸氧化酶活性,并且死细菌对XOD抑制活性表现出额外的有益作用。
UA在肾脏和肠道中的排泄取决于各种尿酸转运蛋白,包括重吸收交换蛋白URAT1、GLUT9和排泄转运蛋白ABCG2[14]。WANG等[14]研究表明,通过下调尿酸重吸收交换蛋白URAT1和GLUT9的表达,可以有效促进HUA小鼠尿酸排泄,这与本研究的结果一致。本研究发现,死菌组小鼠尿液中尿酸排泄水平显著提高,这与肾脏重吸收交换蛋白URAT1和GLUT9下调,以及尿酸排泄蛋白ABCG2上调有关。
高于生理浓度的尿酸主要以晶体形式沉积在机体组织或器官中,诱导体内炎症,刺激炎症小体激活,产生IL-1β、TNF-α等炎症因子[15]。研究表明,NLRP3炎症小体可以作为治疗HUA相关肾脏炎症的治疗靶点[16]。本研究结果亦显示,格氏乳杆菌活菌和死菌都可以抑制TXNIP/NLRP3信号通路,降低炎症小体ASC、Caspase-1以及肾脏炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的mRNA表达,改善了肾脏炎症,推测格氏乳杆菌CCFM1346可能通过产生一些代谢产物或某些细胞成分进入循环系统对HUA表现出额外的有益作用。
综上所述,格氏乳杆菌CCFM1346活菌和死菌可以抑制XOD活性减少尿酸的产生;降低URAT1和GLUT9的表达来抑制尿酸的重吸收;增强ABCG2的表达以及肝脏UOX活性来促进UA排泄。此外,活菌和死菌可降低肾脏炎症小体和促炎因子的表达,缓解肾脏炎症。这些发现表明,格氏乳杆菌CCFM1346活菌和死菌可以调节尿酸代谢,并且有效缓解肾脏炎症。
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