芜菁(Brassica rapa L.),在维吾尔语中被称为恰玛古,属十字花科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica)植物,广泛种植于新疆、西藏等高海拔地区[1],是少数民族非常喜爱的一种蔬菜,被誉为“小人参”和“长寿圣果”。芜菁是一种药食两用植物,可以凉拌、清炒、榨汁或者搭配肉类炖汤食用,其肉质根富含硫代葡萄糖苷、黄酮、糖类、生物碱类、挥发油和氨基酸等营养成分,具有抑菌、抗氧化等功效[2-3]。
芜菁依据肉质根的皮色不同,可分为紫色、黄色和白色3种品种类型,不同品种的芜菁感官品质存在明显差异。已有研究表明,食品中挥发性化合物的种类、浓度与原料品种、栽培条件和加工方法有关,品种是影响风味形成与呈现的关键因素[4],直接影响其感官和品质。研究人员分析了鲜芜菁[5]、芜菁花朵[6]和芜菁脆片[7]的香气构成,但很少有研究关注不同品种芜菁中挥发性化合物的差异。为深入了解不同品种芜菁挥发性物质成分,改进其风味质量,有必要准确分析不同品种芜菁的挥发性化合物成分。
人类仅凭嗅觉无法完全识别不同品种芜菁的挥发性成分,因此需要更灵敏可靠的检测方法进行鉴别[8]。气相-离子迁移色谱联用仪(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)结合了气相色谱的高分离能力和离子迁移谱的快速反应能力[9],可在无需复杂预处理的情况下准确检测食品中微量挥发性化合物组分[10]。近年来,GC-IMS技术以识别能力强、灵敏度高、响应快等优势,已被广泛应用于食品挥发性化合物的分析和检测[11]。本研究以3 种颜色芜菁肉质根为研究对象,基于顶空气相-离子迁移色谱(headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry,HS-GC-IMS)技术结合主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)多元统计方法,识别和分析不同品种芜菁中挥发性风味物质的差异,建立不同品种芜菁样品的挥发性化合物指纹图谱,以期为芜菁风味品质评价、加工利用和品种选育提供理论依据。
紫色、黄色、白色芜菁肉质根,均来自新疆艾力努尔农业科技开发有限公司芜菁种植基地。3种颜色芜菁实物如图1所示。待芜菁肉质根生长至成熟期时,每种颜色随机选择5株混合作为1个重复,每个样品进行3次独立的生物学重复。
图1 不同品种芜菁外观
Fig.1 Visual appearance of different varieties of Brassica rapa L.
FlavourSpec®风味分析仪(配自动顶空进样装置),德国G.A.S公司;AL104分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;20 mL圆底顶空样品瓶,济南海能仪器有限公司。
1.3.1 样品制备
选择大小接近、无机械损伤、无病虫害的新鲜芜菁,清洗、去皮后切块处理,然后将芜菁块放入打浆机中打浆3 min,得到均一的浆状样品。
1.3.2 HS-GC-IMS测定条件及方法
色谱柱为MXT-5(15 m×0.53 mm,1 μm),漂移气和载气为高纯氮(99.999%)。取0.5 g样品于20 mL顶空瓶中,80 ℃孵育20 min。色谱柱温度60 ℃,漂移气的流量为75 mL/min,载气的流速设置为0~2 min为2.00 mL/min,2 min~10 min由2.00 mL/min升高至10.00 mL/min,10 min~20 min增至100.00 mL/min,20 min~30 min增加至150.00 mL/min,分析时间为30 min,顶空进样针温度85 ℃、进样量500 μL。
定性分析:基于GC保留指数(retention index,RI)和IMS相对迁移时间(drift time),与内置的NIST数据库和IMS数据库进行匹配。
定量分析:基于峰信号值强度,通过quantification功能进行半定量,按照面积归一法计算各组分的相对含量。
所有实验均重复3次,结果以平均值±标准差表示。利用Reporter插件对比样品之间的谱图差异,通过Gallery Plot插件进行指纹图谱对比。采用SIMCA14.1软件进行OPLS-DA确定样品间的差异性。单因素方差分析利用SPSS 25.0软件,PCA及作图使用Origin 2022。
2.1.1 不同品种芜菁挥发性化合物差异对比
HS-GC-IMS图整体为蓝色,纵坐标代表GC的保留时间(s),横坐标代表IMS的漂移时间(ms),横坐标1.0处的垂直红色线为反应离子峰(reacive ion peak,RIP)。反应离子峰右侧的点代表样品中检测到的挥发性化合物,点的颜色反映物质的浓度,蓝色表示浓度较低,红色表示浓度较高[12]。由图2可知,大多数信号的保留时间为100~600 s,迁移时间为1.0~1.8 ms。
a-二维图;b-三维图
图2 不同品种芜菁挥发性成分气相-离子迁移分析谱图
Fig.2 HS-GC-IMS images of different varieties of Brassica rapa L.注:1~3 分别代表紫色芜菁、黄色芜菁、白色芜菁(下同)。
2.1.2 不同品种芜菁挥发性化合物指纹图谱
利用Gallery Plot插件生成芜菁挥发性有机化合物指纹图谱,可以反映出同一样品中不同挥发性化合物之间的差异以及不同样品中同一挥发性化合物之间的差异。指纹图谱中每一行代表一个芜菁样品选取的信号峰,每一列代表某一挥发性化合物在不同样品中的相对含量。挥发性化合物的含量以可视化的形式显示,颜色鲜艳代表化合物含量高,颜色暗淡代表化合物含量低。3种芜菁挥发性化合物存在明显差异,有共有的挥发性化合物(图3-a),也有差异挥发性化合物(图3-b)。
a-3种芜菁共有的挥发性化合物;b-仅存在于1或2种芜菁中的挥发性化合物
图3 芜菁挥发性成分HS-GC-IMS指纹图谱
Fig.3 HS-GC-IMS fingerprint of volatiles in Brassica rapa L.
注:数字代表未定性出的化合物;1-n、2-n、3-n表示重复实验次数。
从图3可清晰地观察出3种芜菁样品中挥发性化合物种类及含量差异显著,每种芜菁样品存在各自特征挥发性化合物。有些化合物由于质子亲和力的改变,可以同时以单体(M)形式和二聚体(D)形式存在示,并且漂移时间不同[13],如(E,E)-2,4-庚二烯醛,[(E,E)-2,4-heptadienal-M为单体,(E,E)-2,4-heptadienal-D为二聚体]。由于GC-IMS库中信息不足,29种化合物未被鉴定出。
在3种芜菁样品中,紫色芜菁(样品1)的挥发性化合物种类最少,共检测到53种,其中13种未被鉴定出。黄色芜菁(样品2)中检测到69种挥发性化合物,鉴定出49种。与其他2种颜色芜菁相比,白色芜菁(样品3)中挥发性化合物种类最丰富,共检测到80种化合物,鉴定出60种。在检测出的109种挥发性化合物中,有40种挥发性化合物是3种颜色芜菁共有的(图3-a)。在3种颜色芜菁中含量均较高的化合物为2,4,6-三甲基吡啶、19、正丁酸、2,3-戊二酮、丙醛。(E′)-2-戊烯醛、反式-2-丁烯酸乙酯、正己醇、己醛为紫色(样品1)和黄色(样品2)芜菁中含量较高的挥发性化合物。乙偶姻、苯乙醛、正丁醛在黄色(样品2)和白色(样品3)芜菁中相对含量较高。白色芜菁(样品3)中3-甲基-2-丁烯醛、乙酸、二丙酮醇、乙酸乙酯、29、7、14、6,3-甲硫基丙醇、2-甲基-2-丙醇、二甲基二硫醚-M、17、27、乙酸甲酯相对含量较高,二丙酮醇-M、2-甲基丁酸乙酯-M、28、12、3-蒈烯、(E′)-3-己烯-1-醇、(Z)-2-戊烯-1-醇、2-庚酮在黄色芜菁(样品2)中含量相对较高,(E′)-2-庚烯醛-D、庚醛-M、(E′)-2-庚烯醛-M、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯乙烯-D为紫色芜菁(样品1)中相对含量较高的挥发性化合物。
在这些挥发性化合物中,有一些化合物仅存在于1或2种样品中,具体如图3-b所示。紫色矩形区域(A区)表示在紫色芜菁中含量明显高于其他品种芜菁,共12种挥发性化合物,为庚醛-D、辛醛、(E′)-2-辛烯醛、壬醛、乙酸-M、正庚醇等。橙色矩形区域(B区)标记化合物主要存在于样品2和3中,分别为糠醛、1-戊烯-3-醇、2-戊酮、异戊醛、丙醇、2,6-二甲基苯酚、丁酮、二烯丙基二硫醚、苯甲醛等。黄色矩形区域(C区)标记化合物主要存在于样品2中,主要为5-甲基-2-噻吩甲醛-M、二甲基三硫醚、乙酸叶醇酯、异戊酸丁酯、2,4-庚二烯醛、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、α-水芹烯、丁酮-D、二甲基二硫醚、2,3-戊二酮。白色矩形区域(D区)标记化合物主要存在于样品3中,分别为甲基仲丁基酮、3-甲基-1-戊醇、莰烯、左旋玫瑰醚、(Z)-4-癸烯醛、水杨酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丙酸异丁酯、γ-己内酯、丙酸乙酯、2-甲基-3-呋喃硫醇、2,6-二甲基吡嗪、丙位戊内酯、6-甲基-3,5-戊二烯-2-酮、乙偶姻、异丁酸乙酯、(E)-2-己烯-1-醇。
3种芜菁挥发性化合物均由醛类、酮类、醇类、酯类、酸类、硫醚类等组成,其中酯类含量最高,其次是醛类和醇类。不同品种芜菁中各类成分存在明显差异,可能与不同品种芜菁的营养成分组成、品种等综合因素有关[14]。24种醛类相对含量为12%~20%、15种酯类相对含量为23%~27%、9种酮类相对含量为5%~10%、13种醇类相对含量为10%~16%、3种酸类相对含量为3%~7%、4种硫醚类相对含量为2%~7%和7种其他类相对含量为7%~15%,未定性出物质相对含量为17%~18%。这些挥发性物质种类及占比不同,是导致3种颜色芜菁风味存在差异的原因之一。
为清晰呈现3种颜色芜菁中挥发性化合物差异,将指纹图谱中所有挥发性化合物的峰体积归一化得到不同品种芜菁中挥发性化合物相对含量,结果如表2 所示。
表2 不同品种芜菁挥发性化合物组成及含量
Table 2 Composition and contents of volatile compounds in different varieties of Brassica rapa L.by HS-GC-IMS
种类序号名称CAS号分子式保留指数保留时间/s迁移时间/ms相对含量/%紫色芜菁黄色芜菁白色芜菁醛类15-甲基-2-噻吩甲醛C13679704C6H6OS1 112.1778.881.180.10±0.02a1.98±0.18b0.31±0.16a2壬醛-MC124196C9H18O1 103.2757.771.481.18±0.16b0.18±0.05a0.33±0.03a3壬醛-DC124196C9H18O1 103.2757.771.940.42±0.07a0.04±0.01a0.09±0.01a4(E′)-2-辛烯醛-MC2548870C8H14O1 067.7679.191.341.13±0.23b0.47±0.05a0.31±0.05a5(E′)-2-辛烯醛-DC2548870C8H14O1 066.2676.191.820.36±0.03a0.07±0.03a0.13±0.12a6苯乙醛C122781C8H8O1 052.2647.661.250.35±0.01a0.44±0.08a0.42±0.05a7(E,E)-2,4-庚二烯醛-MC4313035C7H10O1 018.3583.291.200.67±0.08b0.32±0.09a0.35±0.07a8(E,E)-2,4-庚二烯醛-DC4313035C7H10O1 016.1579.361.610.31±0.05b0.12±0.02a0.27±0.09b9辛醛-MC124130C8H16O1 006.6562.651.410.99±0.29b0.16±0.08a0.18±0.05a10辛醛-DC124130C8H16O1 006561.671.810.68±0.15b0.10±0.02a0.09±0.04a112,4-庚二烯醛C5910850C7H10O998.2548.181.630.04±0.01a0.18±0.10b0.03±0.00a12苯甲醛C100527C7H6O960472.651.470.09±0.02a0.13±0.03a0.09±0.01a13(E′)-2-庚烯醛-MC18829555C7H12O955.5464.431.250.97±0.07b0.48±0.09a0.21±0.05a14(E′)-2-庚烯醛-DC18829555C7H12O955463.471.670.81±0.05a0.35±0.02a0.61±0.04a15庚醛-DC111717C7H14O899372.171.340.52±0.08b0.24±0.03a0.09±0.02a16庚醛-MC111717C7H14O898.4371.321.690.94±0.15b0.15±0.08a0.07±0.05a17己醛C66251C6H12O787.5249.051.563.44±0.14c2.54±0.10b0.99±0.09a18异戊醛C590863C5H10O633.6148.421.200.72±0.06a3.34±0.18c1.58±0.06b19正丁醛C123728C4H8O582.1128.781.290.88±0.08a1.61±0.05b1.63±0.06b20(E′)-2-戊烯醛C1576870C5H8O745.1212.991.361.28±0.06b1.14±0.05b0.46±0.05a21(Z)-4-癸烯醛C21662099C10H18O1 206.11040.661.360.18±0.03a0.18±0.02a0.67±0.07b22糠醛C98011C5H4O2830.1290.151.330.04±0.00a0.29±0.05b0.06±0.01a233-甲基-2-丁烯醛C107868C5H8O772.8236.021.360.28±0.04b0.16±0.02a0.42±0.02c24丙醛C123386C3H6O511.3105.941.143.41±0.19b1.03±0.10a3.12±0.17b酯类1异戊酸丁酯-MC109193C9H18O21 022.1590.171.390.04±0.01a0.26±0.02b0.02±0.00a2异戊酸丁酯-DC109193C9H18O21 022.6591.151.900.05±0.00ab0.09±0.03b0.03±0.01a32-甲基丁酸乙酯-MC7452791C7H14O2866.8330.841.650.60±0.07a0.81±0.11a0.51±0.01a4丙酸异丁酯C540421C7H14O2857.2319.661.720.22±0.04a0.67±0.09a2.47±0.10b52-甲基丁酸乙酯-DC7452791C7H14O2842.6303.401.650.02±0.00a0.10±0.00b0.34±0.05c6异丁酸乙酯C97621C6H12O2753.1219.341.571.14±0.11a1.00±0.13a3.97±0.13b7乙酸乙酯C141786C4H8O2594.8133.381.342.09±0.12a2.56±0.27a3.86±0.21b8乙酸甲酯C79209C3H6O2560.6121.381.191.08±0.04b0.66±0.08a0.74±0.02a9反式-2-丁烯酸乙酯C623701C6H10O2846307.101.180.72±0.04b0.45±0.10ab0.11±0.01a10水杨酸甲酯C119368C8H8O31 176.8950.831.152.00±0.14a1.94±0.05a5.27±0.11b11苯乙酸甲酯C101417C9H10O21 176.5950.121.2416.96±1.50c12.65±0.6b6.77±0.45a12γ-己内酯C695067C6H10O21 055.2653.681.520.04±0.00a0.11±0.01ab0.22±0.01b13乙酸叶醇酯C3681718C8H14O21 012.1572.201.330.25±0.04a0.60±0.14b0.15±0.02a14丙酸乙酯C105373C5H10O2687.7172.311.140.12±0.04b0.02±0.00a0.22±0.01c15丙位戊内酯C108292C5H8O2966.7485.221.131.10±0.10a0.95±0.10a2.57±0.27b醇类13-甲硫基丙醇C505102C4H10OS979.9511.051.460.25±0.08a0.28±0.04a0.48±0.13b2正庚醇C111706C7H16O974.2499.701.400.30±0.15b0.09±0.05a0.05±0.02a3二丙酮醇-MC123422C6H12O2852.7314.651.531.23±0.03a6.44±0.04b1.86±0.07a4丙醇C71238C3H8O562.4121.981.250.43±0.08a2.46±0.07b2.14±0.08b5正己醇C111273C6H14O867.9332.241.330.82±0.06b0.51±0.01b0.10±0.04a63-甲基-1-戊醇C589355C6H14O843.4304.251.600.04±0.01a0.09±0.01a0.29±0.06b7(E)-2-己烯-1-醇C928950C6H12O882.2349.651.180.04±0.01a0.04±0.00a0.27±0.08b8二丙酮醇-DC123422C6H12O2823.8283.671.142.46±0.06b1.07±0.03a2.24±0.05b9(Z)-2-戊烯-1-醇C1576950C5H10O761.2226.041.450.24±0.06a0.34±0.02b0.16±0.01a101-戊烯-3-醇C616251C5H10O690.5173.941.360.52±0.06a2.99±0.03c1.51±0.08b112-甲基-2-丙醇C75650C4H10O538.8114.291.142.28±0.01b1.04±0.04a1.93±0.15b122-甲基-3-呋喃硫醇C28588741C5H6OS886.9355.531.141.37±0.08b0.46±0.11a2.05±0.14c13(E′)-3-己烯-1-醇C928972C6H12O850.7312.401.240.07±0.00a0.10±0.06a0.03±0.00a
续表2
种类序号名称CAS号分子式保留指数保留时间/s迁移时间/ms相对含量/%紫色芜菁黄色芜菁白色芜菁酮类 1甲基庚烯酮C110930C8H14O987.7526.811.181.03±0.02a4.27±0.09b1.01±0.09a22,3-戊二酮-DC600146C5H8O2613.9140.581.290.05±0.00a0.71±0.08c0.22±0.03b3丁酮-MC78933C4H8O580.9128.381.250.13±0.01a0.63±0.05b0.4±0.00ab46-甲基-3,5-戊二烯-2-酮C1604280C8H12O1 114.2784.011.730.06±0.01a0.08±0.01a0.24±0.08b5甲基仲丁基酮C565617C6H12O750.9217.571.180.10±0.03a0.04±0.01a0.14±0.08a62,3-戊二酮-MC600146C5H8O2706.6184.631.222.99±0.07b1.62±0.09a1.82±0.02a72-戊酮C107879C5H10O674.7166.261.370.90±0.07a2.59±0.04b3.14±0.11c8丁酮-DC78933C4H8O622.2143.831.260.12±0.02a0.41±0.05b0.11±0.02a92-庚酮C110430C7H14O858.1320.751.260.11±0.03a0.11±0.05a0.03±0.01a烯烃类1α-水芹烯C99832C10H161 003.6557.401.230.21±0.00a0.41±0.05b0.15±0.02a23-蒈烯C13466789C10H16997.4546.921.210.22±0.03b0.17±0.01b0.08±0.01a3莰烯-MC79925C10H16938.6434.591.200.03±0.00a0.04±0.01a0.28±0.03b4苯乙烯C100425C8H8898.1370.811.440.86±0.07b0.24±0.03a0.44±0.07a5莰烯-DC79925C10H16937.8433.361.640.04±0.00a0.03±0.01a0.28±0.04b硫醚类1二烯丙基二硫醚C2179579C6H10S21 087.4721.841.190.19±0.04a2.53±0.07c0.94±0.09b2二甲基二硫醚-MC624920C2H6S2771.3234.691.140.66±0.05b0.24±0.05a0.34±0.02a3二甲基二硫醚-DC624920C2H6S2738.8208.021.140.45±0.03a1.03±0.07b0.52±0.03a4二甲基三硫醚C3658808C2H6S3967.7487.231.300.22±0.02a3.45±0.15b0.43±0.06a1乙酸-MC64197C2H4O2632.1147.811.052.19±0.07b0.31±0.05a0.40±0.03a酸类 2正丁酸C107926C4H8O2788.7250.171.392.50±0.05b1.49±0.12a1.20±0.04a3乙酸-DC64197C2H4O2653156.601.142.61±0.07b1.10±0.08a2.54±0.09b其他类12,6-二甲基苯酚C576261C8H10O1 114.6784.891.140.13±0.01a0.76±0.12ab1.37±0.12b22,4,6-三甲基吡啶C108758C8H11N1 013.5574.771.153.36±0.10c1.58±0.15a2.66±0.10b32-戊基呋喃C3777693C9H14O991.7535.191.250.30±0.07a0.66±0.08b0.17±0.07a4乙偶姻-MC513860C4H8O2730.8201.981.341.21±0.06b0.84±0.01a3.49±0.09c5左旋玫瑰醚C3033236C10H18O1 114.7785.291.360.06±0.01a0.06±0.02a0.47±0.22b6乙偶姻-DC513860C4H8O2703182.201.341.19±0.02a1.17±0.06a1.44±0.03a72,6-二甲基吡嗪C108509C6H8N2921.7406.821.133.65±0.08b1.49±0.10a5.67±0.12c
注:数据为平均值±标准偏差,n=3;不同肩标字母表示样品间的差异显著(P<0.05)。
如图4所示,3种芜菁中共检测出109种挥发性化合物,定性出80种,包括醛类24种、酯类15种、醇类13种、酮类9种、酸类3种、烯烃类5种、硫醚类4种、其他7种。挥发性化合物的种类和浓度与碳水化合物、游离氨基酸、脂肪酸、维生素及矿质元素密切相关。这些物质通过热反应,即脂质氧化、美拉德反应和Streker降解等,进一步转化为多种挥发性风味化合物[4]。据报道,大多数醛、酮、醇、酯、呋喃和吡嗪都是由美拉德反应或脂质降解产生的。
a-挥发性物质种类组成;b-挥发性物质相对含量
图4 芜菁中挥发性物质种类及组成
Fig.4 Composition and relative contents of volatile species in different varieties of Brassica rapa L.
酯类是芜菁中含量最多的一类挥发性化合物,赋予芜菁果香味。在芜菁酯类物质中,苯乙酸甲酯相对含量最高,主要来自醇和酸的酯化反应,呈现出甜香、果香。芜菁中相对含量大于1的酯类还有异丁酸乙酯(果香味)、乙酸乙酯(水果香)、乙酸甲酯(浆果香、甜香)、水杨酸甲酯(薄荷、冬青叶气味)及丙位戊内酯。反式-2-丁烯酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲基丁酸乙酯是3种芜菁样品共有的酯类挥发性化合物,但是其含量因芜菁品种不同而存在较大差异,这可能与不同品种芜菁中脂肪酸代谢途径中的关键酶的活力有关[15]。
醛类是芜菁中种类最丰富的挥发性物质。3种芜菁样品中,相对含量较高(≥1%)的醛类主要包括呈现果香和清香的壬醛、庚醛、正丁醛、(E′)-2-辛烯醛、(E′)-2-戊烯醛、(E′)-2-庚烯醛,以及辛醛和丙醛等醛类。醛类在不同颜色芜菁中的含量和种类均存在一定差异,这可能是影响芜菁风味的重要因素。在已鉴定出的24种醛类中,紫色芜菁中醛类化合物相对含量最高为20%;白色芜菁中最低,约为12%。
芜菁中共检测出13种酮类。2,3-戊二酮和2-庚酮是3种颜色芜菁样品共有的酮类挥发性化合物。甲基庚烯酮(柠檬草味香)在黄色芜菁中相对含量最高为4.27%、紫色芜菁中2,3-戊二酮(水果味、花香味)相对含量最高为2.99%、白色芜菁中2-戊酮相对含量最高为3.14%。正己醇、二丙酮醇、3-甲硫基丙醇、2-甲基-2-丙醇、二丙酮醇、(E′)-3-己烯-1-醇、2-戊烯-1-醇存在于3种颜色芜菁样品中。二丙酮醇在芜菁中相对含量最高,在紫色、黄色、白色芜菁中分别为3.69%、7.51%、4.1%,呈淡薄荷味;2-甲基-2-丙醇次之,分别为2.28%、1.04%、1.93%;2-甲基-3-呋喃硫醇在紫色芜菁和白色芜菁中相对含量分别为1.37%、2.05%,呈现出葱香、蒜香和硫化物气味[16]。黄色芜菁中1-戊烯-3-醇相对含量较高为2.99%,呈现出青草味。酸类物质中,乙酸相对含量最高,在紫色芜菁、黄色芜菁、白色芜菁中分别为4.8%、1.41%、2.94%。3种颜色芜菁中均存在2,4,6-三甲基吡啶、乙偶姻、3-蒈烯、苯乙烯等化合物,赋予芜菁清新甜香味、芳香脂味。
此外,含硫化合物因其强烈的臭味而被认为是十字花科类植物特征气味成分[17],尽管这些化合物的含量可能很低,但其气味阈值却很低[18-19]。芜菁属于十字花科植物,硫苷是重要的前体物,在热作用下时会发生降解,生成多种腈类及含硫化合物[20],这些化合物赋予芜菁辛辣味。芜菁中呈味的含硫化合物主要包括二烯丙基二硫醚、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、2-甲基-3-呋喃硫醇、3-甲硫基丙醇。在这些化合物中,2-甲基-3-呋喃硫醇是3种芜菁中含量最高的挥发性物质,二甲基二硫醚是3种颜色芜菁中共有的化合物,其他2种含硫化合物仅存在于1或2种颜色芜菁中,可能是由于含量低或者受热易分解引起的。
PCA是一种多元统计分析方法,通过降低数据集的维度评估复杂样本之间的规律性和差异性[21]。研究采用PCA法进一步区分芜菁样品挥发性化合物的差异。挥发性风味特征相似的样品重叠在一起或者在图谱中距离较近,反之则不相似[22]。
如图5-a所示,PC1的贡献率为44.7%,PC2的贡献率为36.8%,两者累计贡献率为81.5%,基本涵盖3种芜菁样品的基本信息。位于不同象限的紫色芜菁(样品1)、黄色芜菁(样品2)、白色芜菁(样品3)相距甚远,表明不同芜菁的挥发性特征存在显著差异。与表2的结果一致,不同芜菁样品中某些挥发性化合物的相对含量存在显著差异(P<0.05)。紫色芜菁中辛醛-M(0.99%)、乙酸-M(2.19%)、壬醛(1.60%)和(E,E)-2,4-庚二烯醛(0.98%)的相对含量最高,而莰烯(0.56%)、2-甲基丁酸乙酯-D(0.34%)、乙偶姻-M(3.49%)和(E)-2-己烯-1-醇(0.27%)在白色芜菁(样品3)中含量较高,5-甲基-2-噻吩甲醛(1.98%)、异戊酸丁酯-M(0.26%)、二丙酮醇-M(6.44%)、丁酮(1.04%)和2,3-戊二酮-D(0.71%)则主要存在于黄色芜菁(样品2)中,PCA的结果与GC-IMS的结果高度吻合。PCA结果表明,可以通过挥发性成分的差异区分不同品种芜菁。在类似研究中,一项研究利用HS-GC-IMS结合PCA建立了松茸的风味指纹图谱,并研究了松茸不同产地和部位挥发性成分组成的差异[21]。另一项研究利用HS-GC-IMS、PCA和聚类分析建立了枸杞中挥发性物质的指纹图谱,可以清晰地区分不同品种、不同产地的枸杞[8]。本研究结果表明,PCA结合HS-GC-IMS可以区分不同品种的芜菁。
a-主成分分析图;b-欧氏距离图
图5 不同品种芜菁挥发性化合物相似度分析
Fig.5 Similarity analysis of volatile organic compounds in different varieties of Brassica rapa L.
欧氏距离分析是一种常用的聚类分析方法,与PCA结果相比更直观[23]。为了了解不同颜色芜菁样品之间挥发性指纹图谱的相似性,利用GC-IMS自带插件计算了不同品种芜菁样品之间的欧氏距离,以反映其挥发性成分的差异。由图5-b欧式距离图可看出,不同颜色芜菁样品间距离较远,平行样品间距离较近。PCA的结果和欧式距离的分析结果相一致,可见不同颜色芜菁样品之间挥发性化合物存在较大差异。
对不同品种芜菁样品中109种挥发性化合物可视化分析后,在构建可靠OPLS-DA模型基础上,筛选出VIP值>1的挥发性化合物作为不同样品间的差异挥发性风味成分。
通过R2X和Q2值评估了OPLS-DA模型的总体适配性和预测能力。在本研究中,累计R2X、R2Y和Q2值分别为0.846、0.979和0.95。因此,已建立的OPLS-DA模型具有较好的预测能力(Q2>0.50)。根据OPLS-DA模型,计算出挥发性物质的VIP值,并根据VIP值选出特征差异标志物(见图6-c)。
a-得分图;b-随机置换检验;c-VIP预测值;d-热图
图6 芜菁重要风味物质(VIP>1)的OPLS-DA分析结果
Fig.6 OPLS-DA of volatile organic compounds in Brassica rapa L.
3种芜菁中共有32种挥发性化合物VIP值>1,分别为苯乙酸甲酯、二丙酮醇、2,6-二甲基吡嗪、甲基庚烯酮、水杨酸甲酯、二甲基三硫醚、异丁酸乙酯、乙偶姻-M、异戊醛、丙醛、1-戊烯-3-醇、丙酸异丁酯、二烯丙基二硫醚-M、5-甲基-2-噻吩甲醛、2-戊酮、己醛、丙醇、乙酸、丙位戊内酯、2,4,6-三甲基吡啶、乙酸乙酯、乙酸-M、2-甲基-3-呋喃硫醇、二丙酮醇、2,3-戊二酮、正丁酸、2,6-二甲基苯酚、2-甲基-2-丙醇。
苯乙酸甲酯在所有样品中相对含量最高,VIP值为2.85;二丙酮醇具有淡薄荷味,其VIP值为2.31;2,6二甲基吡嗪VIP值为1.97;甲基庚烯酮的VIP值为1.88,有清香味;水杨酸甲酯的VIP值为1.80,具有冬青味和薄荷味;二甲基三硫醚的VIP值为1.80,呈硫磺味、洋葱味;异丁酸乙酯的VIP值为1.78,具有水果味。
为了直观反映特征差异标志物(VIP值>1)在3种芜菁中的差异,按照筛选出的32种特征差异标志物的相对含量绘制热图(图6-d)。结果表明,芜菁样品中32种差异挥发性化合物的相对含量对于区分芜菁样品具有重要作用。
研究采用HS-GC-IMS技术对3种芜菁的挥发性化合物进行分析,初步建立了不同品种芜菁的挥发性化合物指纹图谱,为鉴别和评价芜菁风味品质提供了一种思路。3种颜色芜菁中共鉴定出80种挥发性化合物,其中醛类24种、酯类15种、醇类13种、酮类9种、酸类3种、烯烃类5种、硫醚类4种、其他7种。芜菁中挥发性化合物主要以酯类、醛类和醇类为主,在白色芜菁中挥发性化合物种类最丰富。PCA和欧氏距离析结果表明,不同颜色芜菁挥发性特征成分存在显著差异。结合OPLS-DA模型共筛选出32种差异挥发性化合物(VIP值>1),可以通过差异挥发性化合物数据实现芜菁品种的快速鉴定。因此,HS-GC-IMS是了解不同品种芜菁挥发性化合物的一种有效方法,也可用于改善或标准化芜菁产品的风味质量。然而,由于GC-IMS数据库的限制,有29种挥发性化合物未被鉴定出。在后期研究中,将采用气相色谱质谱或气相色谱-嗅闻-质谱联用,进一步表征芜菁中挥发性化合物,了解芜菁风味化合物的形成机理,为芜菁产品风味调控提供依据。
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