大曲是白酒酿造过程中所需的糖化发酵剂和生香剂[1-3],经大麦、小麦、豌豆等谷物经粉碎、拌料、接种、成型等工序后在曲房内发酵而成,人们通常根据发酵温度将其分为高温大曲、中温大曲和低温大曲,应用在独特工艺中酿造出不同香型的白酒[4-5]。高温大曲是酱香型白酒酿造用曲,通常会根据发酵情况将其分为白曲、黄曲和黑曲,并在酿酒中按照特定比例使用[6-8]。目前行业对于白曲、黄曲和黑曲的鉴定通常由验收人员在色、香、味等方面进行感官综合判别后分别验收入库,尽管具备方便快速的优点,但容易受主观思维、身体健康及环境条件等因素影响,导致黄曲验收成黑曲的误判情况,若再按特定比例加入制酒工艺,将影响所酿造白酒酒体的品质[9]。因此,建立大曲风味检测方法实现数据可视化分析,弥补现有技术不足及保障酒体的品质非常重要。

大曲是固态样品,对其风味组分解析通常需要科学的分离及浓缩步骤[10-12],目前对大曲风味的富集浓缩的方法主要有顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)和液液微萃取,其中顶空固相微萃取因操作方便、消耗试剂少等特点被广泛应用于大曲中的香气化合物分析,但也因萃取头吸附能力的限制以及重现性差的问题而不适于精确定量的分析需求[13-15]。液液微萃取尽管具有富集倍数大、重现性高等优点,却因前处理耗时、检测指标少以及容易出现乳化问题而未被广泛使用于大曲分析[16]。箭型的顶空固相微萃取(arrow-shaped headspace solid-phase microextraction,HS-SPME-ARROW)的萃取体积比同材料的传统HS-SPME高24倍[17-19],不仅对风味成分富集量更多,而且解决了该技术在检测样品时重现性不高的问题,给大曲的微量成分研究分析带来了应用前景。

大曲风味成分的定量分析近些年来成为高校或白酒行业的研究热点,但基于HS-SPME-ARROW和选择离子监测的气相色谱质谱联用(gas chromatography mass spectrometry with selected ion monitor,GC-MS-SIM)技术建立的大曲风味成分的分析方法鲜有报道,基于此,本研究以高温大曲为研究对象,采用HS-SPME-ARROW结合GC-MS-SIM,建立了大曲挥发性风味成分的定量检测方法。该方法能够检测大曲中72种风味组分,涵盖酯、酸、醇、醛、酮及吡嗪等9个大类,并结合偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)快速实现白曲、黄曲和黑曲的准确区分,为白酒酿造工艺的稳定性提供了保障。此外,该方法建立后可用于企业的大曲在发酵和贮存过程中挥发性风味成分变化数据跟踪,为大曲质量评价及微生物的风味物质代谢研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

高温大曲:来源贵州某酱酒企业,分析所用的白曲、黄曲和黑曲由企业验收员进行感官确定;混合曲由33%白曲、34%黄曲和33%黑曲混合而成。

1.1.2 试剂

2-乙基丁酸(纯度均99%),上海安谱实验科技股份有限公司;异丁醛、乙酸乙酯、异戊醛、异戊醇、己酸乙酯、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、乳酸乙酯、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-辛醇、2,3,5-三甲基吡嗪、乙酸、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、四甲基吡嗪、苯甲醛、异丁酸、2,3-丁二醇、苯乙醛、异戊酸、苯乙酸乙酯、3,3-二甲基丙烯酸、己酸、苯乙醇、苯酚、棕榈酸乙酯、苯乙酸等标品(纯度均≥98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

8890A-5795B型气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;100 μm聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)、100 μm聚丙烯酸酯(polyacrylate,PA)、120 μm二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/PDMS,DVB/PDMS)、120 μm二乙烯基苯/宽碳范围/聚二甲基硅氧烷(DVB/Carbon WR/PDMS)箭型固相萃取头,美国Supelco公司;OEM型电子精密天平,奥豪斯国际贸易(上海)有限公司;超纯水系统,上海和泰仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

采用五点法取样[17],粉碎后过40目筛,置于样品袋中4 ℃保存待测。

1.3.2 顶空固相微萃取

使用前设置仪器参数将萃取头在老化站250 ℃条件下老化15 min。准确称取3 g的大曲样品置于20 mL顶空瓶中,加入适量含内标(2-乙基丁酸)的饱和食盐水,超声浸润,并在特定的条件下使用萃取头吸附一定时间,待化合物充分富集后转至GC-MS仪器进行解吸和分析,解析时间5 min。

1.3.3 气相色谱-质谱分析条件

气相条件:毛细管柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),载气He,流量1.0 mL/min;不分流;升温程序为初始温度40 ℃,保持3 min,然后以3 ℃/min升至150 ℃,保持10 min,再以10 ℃/min升至250 ℃,保持10 min。

质谱分析条件(SIM):电子轰击电离离子源,电子能70 eV,离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,接口温度250 ℃,传输线温度250 ℃,扫描范围30～350 amu,扫描速度5.1 spestra/s。

1.3.4 萃取条件优化

在1.3.1节和1.3.2节方法的基础上对混合曲进行前处理,以有效化合物数量和总峰面积作为量化指标,分别考察萃取头(100 μm PDMS、100 μm Polyacrylate、120 μm DVB/PDMS、120 μm DVB/Carbon WR/PDMS)、萃取温度(30、40、50、60、70 ℃)、萃取时间(15、20、25、30、35 min)、萃取方式(A:3 g混合曲;B:3 g混合曲+3 mL超纯水;C:3 g混合曲+3 mL饱和食盐水)等不同条件对萃取效果的影响。

1.3.5 定性定量分析

定性:未知化合物经NIST20谱库相匹配(匹配度均大于800)和标准品进行定性。

定量:选择2-乙基丁酸作为内标,终质量浓度20 800.00 μg/kg,大曲样品中有效检出的挥发性风味物质的浓度按照公式(1)计算:

(1)

式中:C,大曲中的挥发性风味物质的质量浓度,μg/kg;Cis,大曲中内标的终质量浓度,μg/kg;Ac,大曲挥发性风味物质的峰面积;Ais,内标物质的峰面积。

2 结果与分析

2.1 固相萃取头的优选

萃取头是带吸附涂层的金属头,不同材质涂层的萃取头对样品风味物质的萃取存在差异[20],选用4种不同萃取头,在相同参数条件下开展混合曲分析实验,结果见图1。由图1可知,使用120 μm DVB/Carbon WR/PDMS萃取头其总峰面积最大,为10.42×107,约是100 μm PDMS总峰面积的5.3倍,100 μm PA的7.2倍和120 μm DVB/PDMS的2.3倍。在化合物个数方面,使用120 μm DVB/Carbon WR/PDMS萃取头检出了72种,120 μm DVB/PDMS检出了58种,而单一组分涂层的100 μm PA和100 μm PDMS分别检出42和47种,说明不同涂层萃取头对所分析的化合物有选择性且多涂层比单一涂层富集化合物多[21],就大曲样品分析而言,多涂层的120 μm DVB/Carbon WR/PDMS萃取头不仅分离出比较多的有效化合物,而且总峰面积也最高,因此,选择120 μm DVB/Carbon WR/PDMS作为实验所用萃取头。

2.2 萃取温度的优选

萃取温度对萃取头富集化合物至关重要,对HS-SPME条件来说,温度升高化合物容易从样品中分离出来,有利于一些微量化合物的富集,但温度过高又会造成萃取头固有组分的解吸,从而降低其吸附能力[19]。在优选的萃取头使用下开展5个梯度萃取温度的混合曲分析实验,结果见图2。随着萃取温度逐渐提高,总峰面积和有效化合物个数有所增加,当萃取温度到达50 ℃时,总峰面积和有效化合物个数达到峰值,继续将萃取温度提高到60 ℃,总峰面积几乎不变,而检出的有效化合物个数明显减少,鉴于此,所选择50 ℃作为实验所用的萃取温度。

2.3 萃取时间的优选

萃取时间是HS-SPME条件的重要参数,萃取时间过短,萃取头对化合物的吸附量不充分,而吸附时间过长,增加仪器对样品的分析时间,不利于快速批量的检测分析[22]。在优选的萃取头和萃取温度的条件下开展混合曲分析实验,比较不同吸附时间对吸附效果的影响,结果见图3。设置的萃取时间对萃取化合物数量影响不明显,而对萃取物总峰面积影响较大,主要体现在15～25 min阶段,萃取物总峰面积随着萃取时间延长明显递增,在25 min后,总峰面积增幅趋于平衡,其原因可能是存在吸附-解吸附平衡现象[21]。鉴于此,选择25 min作为实验所用的萃取时间。

2.4 萃取方式的优选

萃取方式是HS-SPME条件的重要处理手段,通常对固体样品处理包括直接顶空或者加溶液浸润后顶空,以改善萃取头对某些特殊组分的吸附[23]。本研究在优选的萃取头、萃取温度和萃取时间条件下开展混合曲分析实验,比较A(3 g混合曲)、B(3 g混合曲+3 mL超纯水)、C(3 g混合曲+3 mL饱和食盐水)3种不同的顶空萃取方式对萃取效率的影响,结果见表1。由表1可知,A、B、C三种萃取方式总峰面积分别为16.32×107、10.11×107和10.46×107,方式A的检出化合物的总峰面积最大,几乎是方式B的1.61倍,方式C的1.56倍,而浸润的方式B和C两种处理的化合物的总峰面积均较小,可能原因是加水后容易形成化合物-水的结合体系,从而阻碍了挥发性香味物质的大量逸出,进而影响了萃取的吸附量。然而,在有效化合物数目呈现方面,加饱和食盐水浸润的方式C化合物个数为72个,明显比方式B的49个和方式A的52个多,这可能是饱和食盐水起着盐析作用,一些特殊化合物(如杂环类等)析出而被萃取头捕捉吸附而被有效检出。鉴于此,为了能实现更多指标的跟踪,诠释白酒风味成分的来源及演化规律,本研究选择3 g混合曲+3 mL饱和食盐水作为实验所用的萃取处理方式。

2.5 定量方法的有效性验证

采用优选的参数按照1.3.2节和1.3.3节的操作条件对混合曲进行检测分析,结果见图4和表2。由图4可知,混合曲的色谱图基线平稳,各化合物峰有效分开。由表2可知,该方法能有效检测混合曲中72种风味物质,包括18种酯、14种酸、8种醇、9种醛、6种酮、9种吡嗪、2种呋喃、2种酚及4种其他物质,其含量占比分别为20.37%、29.36%、10.38%、7.65%、0.83%、27.39%、1.32%、0.89%和2.81%,含量较多的前3类物质依次是酸类、吡嗪类和酯类,在酸类中是异戊酸含量最高,在吡嗪中是四甲基吡嗪含量最高,在酯类中是乙酸乙酯含量最高,检出的大多数物质会随着生产工艺带入白酒中,对酒体呈现的香和味发挥不可替代的作用。此外,由表2中的检测结果表明该方法也适用于检测白曲、黄曲和黑曲的风味物质。

参照GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法 理化部分 总则》和GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》对该方法的重复性和准确性进行考察。在重复性方面,对混合曲分别进行5次分析,由表2可知,组分含量的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.01%～9.36%,均低于10%,表明该定量方法重复性良好。在回收率考察方面,分别选择几类物质中含量最高和最低的物质开展加标实验,结果见表3。由表3可知,大曲样品中加入的这几种主要风味化合物的回收率为93.01%～105.37%,回收率均较高,说明该法具有很好可靠性和准确性,可满足定量分析要求。

将此方法与现有大曲风味检测方法进行对比,结果见表4,由表4可知,使用液液微萃取结合GC-MS联用技术用曲量大、前处理复杂、提取的大曲浸泡液容易乳化、有机溶剂用量大、检测指标较少。使用HS-SPME结合GC-MS联用技术萃取头涂层少、寿命短、重复性差、数据处理困难。本方法采用HS-SPME-ARROW结合GC-MS-SIM技术,不仅具备传统SPME的前处理简单的优点,而且检测指标丰富,重复性较好,数据处理便捷,适用于企业大曲风味的快速检测分析。

2.6 大曲的关键风味化合物的计量学分析

高温大曲通常会根据发酵后的感官形态分为白曲、黄曲和黑曲,但由于评价人的感官差异导致评价结果有所区别,因此,由大曲风味成分含量结合科学数据分析技术来判别大曲能够弥补感官评价的缺陷。层次聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA),是一种将研究对象分为相对同质群组的统计分析技术[26-27],能够实现对大曲的直观分类。本实验以72种可检测的风味物质的含量为变量,开展白曲(W1～W5)、黄曲(Y1～Y5)和黑曲(B1～B5)的HCA,结果见图5-a。距离为180～510时,大曲被分为两个大类,其中白曲为1个大类,黄曲和黑曲为1个大类。距离为60～180时,被分为白曲、黄曲和黑曲3个大类。进一步细分,每个样本都是独立个体。因此,应用大曲风味物质检测数据结合统计学分析技术可以避免人为感官带来大曲的差异误判问题,为后续大曲拌料工序提供稳定的质量保障。

PLS-DA是一种集中了主成分、典型相关性和多元线性回归的分析技术,具备对数据拟合及预测的能力,常用于样品间的差异性分析[28-30],研究为了准确地鉴定不同大曲样品之间香气组分的差异,利用PLS-DA对关键风味化合物含量进行解析,由图5-b可知,在模型解释能力(R2Y)为0.998及预测能力(Q2Y)为0.918的条件下,白曲分布在第1和第4象限,黄曲分布在第3象限,黑曲分布在第2象限,3种大曲样品均能实现良好的区分。此外,为了验证PLS-DA模型是否过度拟合数据,实验通过200次置换检验开展评估,由图5-c可知,置换测试的截距R2为0.900 0,Q2为-0.090 4,R2>Q2,且Q2在负截距,表明PLS-DA模型有效。在此基础上,进一步通过变量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)分析来体现各个变量对于样品分离的贡献程度,以VIP>1的变量作为解释大曲之间差异的潜在标记物质。由图5-d可知,VIP>1的物质分别是乙酸、3-辛醇、乙酸乙酯、异戊醇、四甲基吡嗪、泛酸内酯、己酸、5-甲基-3-庚酮、3-苯基呋喃、2,5-二甲基吡嗪、苯基丙酮、2-戊基呋喃、苯乙酸、苯乙酸、3,3-二甲基丙烯酸、苯乙酸乙酯、苯甲酸、3-辛酮、2,3,5-三甲基吡嗪、己醛、2,6-二甲基吡嗪、2-吡咯甲醛、2-甲基吡嗪、2-丁基-1-辛醇、二甲基三硫、愈创木酚、丁二酸二乙酯、2-乙酰基吡咯、苯甲醇、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基丁酸乙酯,共31种关键差异性香气化合物。

进一步对31种关键差异风味化合物(VIP>1)的含量进行分析,结果见图6。由6可知,31种关键差异风味化合物中,酸类有5种,3种大曲均以乙酸含量较高,呈现酸香且具有抑制杂菌作用;酯类有5种,一般都具有水果香,3种大曲以乙酸乙酯含量较高,在黄曲中最高;醇类有4种,大曲中以2-辛醇和异戊醇含量较高;吡嗪类有6种,吡嗪类物质一般都具有烘焙和坚果香,在3种大曲中含量均较高,主要呈现花蜜香且在含量对比上,黑曲>黄曲>白曲,在感官上烘焙香差异明显;其他共有11种,以2-乙酰基吡咯含量较高且在黄曲中也高于其他曲样。造成大曲之间物质的差异主要是制曲过程中发酵程度决定的。此外,通过对3种大曲样品关键差异风味化合物(VIP>1)含量进行单因素方差分析,结果表明,这些关键差异风味化合物含量在不同大曲样品中具有显著差异(P<0.05)。

3 结论与讨论

本研究以酱香高温大曲为研究对象,以2-乙基丁酸为内标,采用箭型顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱的选择离子监测技术,率先建立了高温大曲挥发性风味成分的定性定量方法,并通过优化操作的参数条件成功的定量分析了大曲中72种风味物质,包括18种酯、14种酸、8种醇、9种醛、6种酮、9种吡嗪、2种呋喃、2种酚及4种其他物质,其含量占比分别为20.37%、29.36%、10.38%、7.65%、0.83%、27.39%、1.32%、0.89%和2.81%,所建方法精密度试验相对标准偏差均低于10.00%,加标回收率为93.01%～105.37%,可满足对大曲检测分析需求。此外,该方法结合计量学分析能够快速实现不同曲样的区分,避免感官评价造成的误差,能识别曲样中关键差异性物质,可推广应用到不同产地、不同香型及不同典型曲样的差异性研究,为完善不同曲样质量评价方法提供了科学依据。

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Establishment and application of a method for determination of volatile flavour components in high-temperature Daqu

WANG Jinlong, YIN Yanshun, TIAN Dongwei, HU Jianfeng, CHENG Pingyan, WANG Diqiang*

(Guizhou Xijiu Co.Ltd., Zunyi 564622, China)

ABSTRACT A novel detection method for volatile flavor components in high-temperature Daqu was established using arrow-shaped headspace solid-phase microextraction (HS-SPME-ARROW) combined with gas chromatography-mass spectrometry and selective ion monitoring (GC-MS-SIM) technology.Results showed that the method could qualitatively and quantitatively determine 72 volatile flavor components in Daqu effectively, including 18 esters, 14 acids, 8 alcohols, 9 aldehydes, 6 ketones, 9 pyrazine, 2 furans, 2 phenols, and 4 other substances by using a 120 μm DVB/Carbon WR/PDMS fiber head, under the conditions of extraction temperature of 50 ℃, extraction time of 25 minutes, and addition of 3 mL saturated salt water.In terms of methodology, the precision of this method ranged from 0.01% to 9.36%, and the recovery rate was between 93.01% and 105.37%, indicating that it was suitable for the detection needs of volatile components in high-temperature Daqu.Compared with existing reported detection methods, this method had the advantages of simple pre-processing, rich detection types, and convenient data processing.In addition, combining the detection results with partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) effectively differentiated white Daqu, yellow Daqu, and black Daqu and compensated for the misjudgment of sensory evaluation, providing a basis for the scientific evaluation of Baijiu quality.

Key words high-temperature Daqu; arrow-shaped headspace solid-phase microextraction; gas chromatography-mass spectrometry; selected ions monitoring; flavor compounds

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038570

引用格式：王金龙,尹延顺,田栋伟,等.高温大曲挥发性风味成分检测方法的建立及应用[J].食品与发酵工业,2025,51(4):345-353.WANG Jinlong,YIN Yanshun,TIAN Dongwei, et al.Establishment and application of a method for determination of volatile flavour components in high-temperature Daqu[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(4):345-353.

第一作者：硕士研究生,工程师(汪地强研究员为通信作者,E-mail:15761699434@163.com)

基金项目：高温大曲后熟质量评价标准体系的建立及应用(黔财工【2023】153号)

收稿日期：2024-01-12,改回日期:2024-07-04