茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的高效表达

袁方1,李国莹2,顾秋亚1,余晓斌1*

1(江南大学 生物工程学院,江苏 无锡,214122)2(江苏一鸣生物股份有限公司,江苏 泰兴,225400)

摘 要 谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase, TGase)可以促进蛋白质分子内或分子间的交联,在食品、制药、纺织等行业中均有着广泛的应用。为了高效生产具有优良特性的TGase,该研究以茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)来源的TGase为研究对象,比较了两个不同来源的TGase的性质,将具有较优酶学性质的TGase基因tgLD分别采用6种不同质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达。其中,重组菌E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)实现了成熟TGase的异源表达,添加0.2 mmol/L IPTG、25 ℃诱导8 h,重组TGLD的酶活力为0.45 U/mL。为进一步提高TGLD的表达量,构建了可以特异性激活pro-TGase的2种表达载体。其中,重组菌E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD),添加0.2 mmol/L IPTG、15 ℃诱导24 h,体外活化后获得具有活性的TGLD酶,其酶活力达25.23 U/mL。该研究实现了具有优良性质的活性TGLDE.coli 中的高效表达。

关键词 谷氨酰胺转氨酶;茂源链霉菌;大肠杆菌;高效表达

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)是一种催化蛋白质之间的氨基与酰基间形成异型肽键,使蛋白质之间发生交联的酶[1]。由于这一特性,TGase被广泛应用于食品、制药、纺织等多个工业领域[2]

在过去20年中,TGase因具有多种底物特异性、催化效率高和成本效益等特点而备受关注。自然界中TGase广泛存在,其中,微生物谷氨酰胺转氨酶(microbial TGase,MTGase)因具有不依赖Ca2+激活的特性而被广泛使用。MTGase主要来自链霉菌属(Streptomyces spp.)[3]和芽孢杆菌属(Bacillus spp.)[4]。日本味之素公司于1989年在S.mobaraenesis S-8112中发现了MTGase[5],并在1993年开始MTGase的工业化发酵生产,成为世界上最大的TGase生产商。随后,新的MTGase生产菌株也不断出现,其中包括:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链轮丝霉菌(S.ladakanum)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)等。不同来源的MTGase虽都具有非Ca2+依赖性,但其在酶学性质等方面存在着差异。同时,MTGase具有催化率高、底物特异性低等特点,备受研究者青睐[6]。国内对MTGase生产菌株的研究相对较晚,至2008年国内企业才真正实现MTGase的产业化生产。MTGase具有分子质量小以及空间结构灵活等优点,使它更加适合于工业化应用。在食品行业中的肉制品加工中,MTGase能够改变肉类蛋白质的功能,使肉制品的质构、风味以及外观得到改善,由此来提高产品的附加值,在乳制品和面制品等加工中也具有提高产品品质的功能。

本研究针对实验室现有两株茂源链霉菌:S.mobaraenesis CGMCC4.1851和S.mobaraenesis ATCC27441来源的TGase展开研究,首先确认菌株产TGase的催化能力并对其酶性质进行测定比较,之后将具有较优酶学性质的S.mobaraenesis CGMCC4.1851来源的TGase基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行异源活性表达,为后续研究及工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

S.mobaraenesis CGMCC4.1851,中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC);S.mobaraenesis ATCC27441,北京中原公司;质粒pET28a、pCDFDuet-1、pCOLDⅡ、pET-22b(+)、pET32a、pGEX-4T-1,TaKaRa公司;E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3),美国Novagen公司。

1.1.2 主要试剂

N-carboxybenzoyl-L-glutaminyl-glycine(N-CBZ-Gln-Gly),吉尔生化(上海)有限公司;L-谷氨酸-γ-单羟胺酸,Sigma-Aldrich公司;还原型谷胱甘肽,上海麦克林生化科技股份有限公司;标准分子质量蛋白和12%(质量分数)Tris-glycine SDS-PAGE预制胶,ThermoFisher公司(上海);质粒小量抽提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;氨苄青霉素、溶菌酶,生工生物工程(上海)股份有限公司;限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶,TaKaRa(大连)公司;BeyoZonaseTM超级核酸酶肠激酶,碧云天生物技术有限公司;Enterokinase,翌圣生物科技(上海)股份有限公司;胰蛋白胨、麦芽提取物和酵母提取物,Oxoid(英国)公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器与设备

MiniAmp Plus Thermal Cycler PCR仪、miniGEL TANK蛋白质电泳系统,美国ThermoFisher公司;ALL SHENG Nano-300微量分光光度计,杭州奥盛;Tanon 2500B凝胶成像仪,上海天能;5427R高速冷冻微量离心机,德国Eppendorf公司;TU-100C恒温金属浴、LRH-250生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;AKTA start蛋白纯化仪,美国Cytiva公司;Synergy H1酶标仪,美国Biotek公司。

1.1.4 培养基

高氏一号固体培养基(g/L):可溶性淀粉20、NaCl 0.5、KNO3 1、K2HPO4·3H2O 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01,琼脂粉20,调节pH值至7.4~7.6。

LB固体培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10、琼脂粉20,pH 7.0。

S.mobaraenesis种子培养基(g/L):甘油25、蛋白胨20、酵母粉5、玉米浆2.5、MgSO4·7H2O 2.5、K2HPO4·3H2O 2,调节pH值至7.4。

S.mobaraenesis发酵培养基(g/L):甘油20、蛋白胨20、酵母粉5、玉米浆5、(NH4)2SO4 2.5、MgSO4·7H2O 2、K2HPO4·3H2O 4、KH2PO4·H2O 2、CaCO3 2,调节pH值至7.4。

LB培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10,pH 7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 天然TGase的生产与纯化

将菌株S.mobaraenesis CGMCC4.1851和S.mobaraenesis ATCC27441的孢子涂布于高氏固体平板,30 ℃培养8 d,用无菌生理盐水收集平板上的孢子,分别接种于装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中,30 ℃,200 r/min培养24 h。培养好的种子液按10%(体积分数)的接种量接入装有25 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中,于30 ℃,200 r/min培养64 h。

将发酵液经7 000 r/min离心30 min后,取上清,在10~15 ℃下,经过分子质量为10 kDa超滤膜浓缩4倍后,加入一定体积预冷的无水乙醇(乙醇终体积分数60%),离心取沉淀,沉淀用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液溶解,9 000 r/min离心10 min去除不溶物后过0.22 μm滤膜,待用。使用离子交换柱SP70进行离子交换纯化。上样样品用含1.0 mol/L NaCl、20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液的溶液作为洗脱液进行线性洗脱,并用Superdex 75柱(10/300GL,直径10 mm,长度300 mm)进行脱盐。

1.2.2 大肠杆菌重组菌的构建

1.2.2.1 编码成熟tg表达载体的构建与转化

由苏州金唯智公司基因合成S.mobaraenesis CGMCC4.1851基因组中的tg基因片段,并进行大肠杆菌密码子优化,命名为基因tgLD。以该片段为模板,设计分别含有两个不同酶切位点的两端引物,扩增得到TGase的成熟区序列。表达载体和目的基因进行双酶切并分别胶回收后,通过T4酶在16 ℃下连接2 h,连接产物转化到E.coli DH5α中,挑取抗性板上的单菌落进行菌落PCR,挑取阳性单克隆菌落送至测序得到测序正确的质粒。本实验中尝试了6种不同的质粒表达tgLD,所得表达质粒转化E.coli BL21(DE3),得到6株重组菌E.coli BL21(DE3) (pET28a((+)-tgLD)、E.coli BL21(DE3) (pCDFDuet-1-tgLD)、E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)、E.coli BL21(DE3) (pGEX-4T-1-tgLD)、E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-tgLD)和E.coli BL21(DE3) (pET-22b(+)-tgLD)。构建时所用的引物、质粒抗性等如表1所示。

表1 基因tg表达载体构建中所用引物
Table 1 Primers used in the construction of gene tg expression plasmids

质粒抗性酶切位点引物序列pET28a((+)-tgLDKan+Nco IL-1-F:atatCCATGGACTCAGATGATCGTGTTACXho IL-1-R:atatCTCGAGTTACGGCCAGCCCTGTTTAACpCDFDuet-1-tgLDStr+Nde IL-2-F:cgcgCATATGGACTCAGATGATCGTXho IL-2-R:atatCTCGAGCATCATCACCATCACCACTTACGGCCAGCCCTGpET32a-tgLDAmp+Nco IL-3-F:atatCTCGAGGACTCAGATGATCGTGTTACXba IL-3-R:cgcgTCTAGATTACGGCCAGCCCTGTTTAACpGEX-4T-1-tgLDAmp+BamH IL-4-F:aattGGATCCGACTCAGATGATCGTXho IL-4-R:atatCTCGAGTTACGGCCAGCCCTGpCOLDⅡ-tgLDAmp+Nde IL-5-F:cgcgCATATGGACTCAGATGATCGTXho IL-5-R:atatCTCGAGTTACGGCCAGCCCTGpET-22b(+)-tgLDAmp+Nco IL-6-F:atatCCATGGACTCAGATGATCGTGTTACXho IL-6-R:atatCTCGAGCGGCCAGCCCTGTTTAAC

1.2.2.2 含有基因pro-tg的重组质粒的构建与转化

以基因tgLD为模板,用引物L-7-F/R和L-8-F/R扩增得到含有肠激酶位点的pro区序列,分别克隆至表达载体pET-22b (+) Xho I位点和pCOLDⅡ Nde I-Xho I位点,得到表达载体pET-22b(+)-pro-EK和pCOLDⅡ-pro-EK。以pET-22b(+)-tgLD为模板,引物L-9-F/R、L-10-F/R分别扩增得到含有相应同源臂的基因tgLD。将上述两种质粒经双酶切线性化后与tgLD基因片段通过一步重组酶在37 ℃反应30 min进行连接,连接产物转化到E.coli DH5α中,得到测序正确的质粒,转化E.coli BL21(DE3),得到重组菌E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD)和E.coli BL21(DE3) (pET-22b(+)-pro-EK-tgLD)。构建过程所用引物序列见表2。

表2 含有基因pro-tg的重组质粒构建中所用引物
Table 2 Primers used in the construction of recombinant plasmids with gene pro-tg

质粒酶切位点引物序列pET-22b(+)-pro-EKNco IL-7-F:ATATCCATGGACTCAGATGATCGTGTTACXho IL-7-R:ATATCTCGAGTTACGGCCAGCCCTGTTTAACpCOLDⅡ-pro-EKNde IL-8-F:cagcCATATGgacaatggcgcggggXho IL-8-R:TATACTCGAGTTTATCATCATCGTCGGGGGCCCGGAACGACGpET-22b(+)-pro-EK-tgLDXho IL-9-F:GTGGTGGTGGTGGTGCGGCCAGCCCTGTTTAACL-9-R:CGACGATGATGATAAAGACTCAGATGATCGTGTTACpCOLDⅡ-pro-EK-tgLDEcoR IL-10-F:GACGATGATGATAAAGACTCAGATGATCGTGTTACXho IL-10-R:CAGGTCGACAAGCTTGAATTCTTACGGCCAGCCCTGTTTAA

1.2.3 重组酶TGase与pro-TGase的表达

从-80 ℃保藏的重组菌甘油管中蘸取一环菌液,在LB平板活化后,挑取单克隆接入50 mL离心管(含5 mL LB培养基),200 r/min、37 ℃,培养过夜。以1%(体积分数)的接种量接至250 mL三角瓶中(含50 mL LB培养基),200 r/min、37 ℃培养。当菌体OD600达到一定值时,加入一定量的IPTG,诱导培养18 h。培养过程中使用的LB培养基需添加终质量浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素。

1.2.4 重组菌细胞破壁

将发酵液于6 000 r/min离心10 min,收集菌体并用50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液洗涤2次,沉淀加入裂解液[7](50 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L MgCl2,pH 8.0,1 mg/mL溶菌酶和10 U/mL benzonase),于200 r/min、37 ℃处理1 h后,6 000 r/min离心10 min,取上清液。

1.2.5 Pro-TGase体外活化

取200 μL含重组pro-TGase上清液加入2 μL的肠激酶Enterokinase(0.1 U/μL,25 mmol/L Tris-HCl,8.0)溶液,混合均匀,25 ℃过夜酶切(完全酶切需要16~24 h)。

1.2.6 TGase活力测定

TGase酶活力检测方法具体参照Folk and Cole的比色法进行检测[8]。10 μL TGase酶液,与100 μL A液(200 mmol/L pH 6.0 Tris-HCl、100 mmol/L盐酸羟胺、10 mmol/L还原型谷胱甘肽、30 mmol/L CBZ-Gln-Gly),在37 ℃条件下反应10 min,加入100 μL的终止液B(50 g/L) FeCl3溶液,含有3 mol/L HCl∶120 g/L三氯乙酸∶0.1 mol/L HCl=1∶1∶1,体积比)。反应体积为200 μL。采用酶标仪检测525 nm下的吸光值A525。酶活力定义为:在上述条件下每分钟催化1 μmol底物生产产物所需的酶量为一个酶活力单位U。

1.2.7 TGase酶学性质的测定

TGase的最适反应温度的测定,将纯化后的TGase溶于200 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.0)中,分别测定25、37、40、45、50、55、60 ℃的酶活力。对于酶的热稳定性测定,将TGase溶液分别在25、37、40、45、50、55、60 ℃孵育30 min,37 ℃测定其残余酶活力。以热处理前酶液的酶活力为100%。

TGase的最适pH的测定,将纯化后的TGase分别溶于pH 3~8磷酸盐-柠檬酸缓冲液、pH 7~9 Tris-HCl缓冲液和pH 9~12 Gly-NaOH的缓冲液中,测定酶活力,确定酶的最适pH。对于酶的pH稳定性测定,将纯化后的TGase分别溶于pH 3~8磷酸盐-柠檬酸缓冲液、pH 7~9 Tris-HCl 缓冲液和pH 9~12 Gly-NaOH的缓冲液中放置60 min,37 ℃测定其残余酶活力。以pH处理前酶液的酶活力为100%。

酶半衰期测定方法:将纯化后的TGase溶于200 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.0),将酶溶液分别置于50、55及60 ℃水浴中,每隔一定时间,37 ℃测定其残余酶活力。以热处理前酶液的酶活力为100%。用软件Origin 2019进行对数拟合,确定TGase在各温度下的半衰期。

酶动力学参数测定方法:用200 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.0)配制不同浓度(5、10、15、20、30、50、100、150 mmol/L)的底物(CBZ-Gln-Gly),37 ℃条件下,分别测定酶催化不同浓度CBZ-Gln-Gly生成氧肟酸的速率。用软件Origin 2019进行非线性回归拟合,确定酶动力学参数Km值和kcat值。

1.2.8 蛋白浓度及SDS-PAGE电泳分析

使用Bradford蛋白试剂盒测定蛋白含量。将20 mg/mL的BSA母液稀释到终质量浓度为1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL,分别吸取10 μL不同浓度的蛋白标准样品与300 μL Bradford Reagent振荡混匀后,室温放置5~10 min,用酶标仪测定595 nm处的吸光值,以不含BSA的光吸收值为空白对照。使用12% NuPAGE Bis-Tris凝胶搭配NuPAGE MES SDS running buffer,200 V电压,进行35 min SDS-PAGE电泳。用NuPAGE凝胶进行变性凝胶电泳时,使用NuPAGE LDS样品缓冲液(4×)制备样品。

2 结果与分析

2.1 S.mobaraenesis来源的TGase纯化

将来源于菌株S.mobaraenesis CGMCC 4.1851和S.mobaraenesis ATCC27441的发酵液经过醇沉和离子交换后得到纯化的TGase,分别命名为TGLD和TGLC。SDS-PAGE电泳结果显示(图1),纯化后的TGase只含有单一蛋白条带,分子质量约为38 kDa,与理论分子质量一致。

1-标准分子质量蛋白(Maker);2-纯化后TGLC酶液; 3-纯化后TGLD酶液

图1 纯化后TGLC和TGLD酶液的SDS-PAGE图
Fig.1 SDS-PAGE of purified TGLC and TGLD

2.2 TGase酶学性质分析

对纯化后TGLC和TGLD的酶学性质进行分析,检测包括最适反应pH、pH稳定性、最适反应温度、热稳定性及酶的动力学参数。如表3所示,TGLDKm值为13.45 mmol/L 低于TGLCKm值(18.54 mmol/L),说明TGLD对于底物的亲合力高于TGLC。TGLDkcat值为18.49 s-1,高于TGLCkcat值(13.76 s-1),并且TGLDkcat/Km值为1 375 L/(mol·s),高于TGLCkcat/Km值[742 L/(mol·s)]。这表明,TGLD的催化效率显著优于TGLC。如图2-a和图2-b所示,TGLC的最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为6.0。TGLD的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH值为7.0。如图2-c所示,在55 ℃孵育30 min后,TGLD的相对残留酶活力为52%,而TGLC的相对残留酶活力只有34%。TGLD在50 ℃和55 ℃时的半衰期(t1/2)分别为130 min和20 min,分别比TGLC高3.1倍和2.6倍(表3)。TGLD的pH稳定性也要高于TGLC(图2-d)。TGLD可以在pH 5~12的范围内保持相对残留酶活力大于80%,而TGLC只能在pH 5~11的范围内保持同样的水平。以上结果均表明,TGLD表现出较好的稳定性。本研究纯化得到的两种TGase的最适温度与pH与已报道的S.hygroscopicusS.mobaraenesis的TGase相似[5],而与来源于其他微生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的TGase(最适温度为55 ℃,最适pH值为8.2)[9]和来源于动植物的TGase(最适温度为50 ℃和55 ℃,最适pH值为8.0和7.6)有显著区别[10-11]

a-最适反应温度;b-最适反应pH;c-热稳定性;d-pH稳定性

图2 TGLD和TGLC的酶学性质对比
Fig.2 Comparison of properties between TGLD and TGLC

表3 不同TGases的半衰期 (t1/2)与动力学参数
Table 3 Half-life (t1/2) and kinetic parameters of different TGases

酶t1/2(min, 50 ℃)t1/2(min, 55 ℃)t1/2(min, 60 ℃)Km/(mmol/L)kcat/(S-1)kcat/Km [L/(mol·s)]TGLC325.51.718.54±1.2713.76742TGLD13020313.45±3.5918.491 375

综上,两株菌所产的TGase性质明显不同,TGLD较TGLC具有较高的催化效率和热稳定性,在食品、纺织和制药等行业有着更为广阔的应用前景。但TGLD的出发菌株S.mobaraenesis CGMCC 4.1851产量较低(2.07 U/mL),是限制其在工业领域应用关键因素,因此解决TGLD生产菌效价低的问题是主要的研究工作。接下来实验尝试在E.coli中异源表达TGLD,以期实现TGLDE.coli中的高效活性表达。

2.3 TGLDE.coli中的可溶性表达

采用6种不同的表达质粒,比较不同质粒对TGLD异源表达的影响。通常,TGase可以pro-TGase或TGase两种形式表达,当以pro-TGase形式表达,产生的pro- TGase通过外源蛋白酶处理后具有催化活性[12-13]。当以TGase形式进行表达,虽然简化了外源蛋白酶活化处理的步骤,但是其活性较差[14]。本研究首先考察了成熟TGLDE.coli中是否可以成功表达,并获得具有活性的TGase。当在E.coli中利用具有不同特性的6种表达载体表达成熟tgLD基因时,重组菌株E.coli BL21(DE3) (pET28a(+)-tgLD)、E.coli BL21(DE3) (pCDFDuet-1-tgLD)、E.coli BL21(DE3) (pGEX-4T-1-tgLD)、E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-tgLD)、E.coli BL21(DE3) (pET-22b(+)-tgLD)和E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)在37 ℃培养至OD600达到0.6~0.7,添加IPTG至终浓度0.2 mmol/L,分别选择15、25 ℃诱导16 h,考察不同重组菌发酵生产重组TGLD的情况。在上述诱导温度下,E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)的发酵上清液检测到有活性目的酶蛋白,但其他5株重组菌的发酵液上清液均以无活性目的蛋白出现。其结果可能是由于那5株重组菌不适合重组TGLD的折叠和转运,表达的目的蛋白均以包涵体形式存在[15]

如图3-a所示,重组菌E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)表达成熟TGase时,在全细胞、破壁上清及沉淀中有可溶性目的蛋白条带(55~70 kDa)。由表达载体pET32a-tgLD的图谱(图3-b)可知,TGLD与促溶标签TrxA以融合形式(TrxA-TGLD)表达,大小56 kDa。由此可推断出,重组菌E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)在添加0.2 mmol/L IPTG时,25 ℃诱导16 h后,表达的可溶性目的蛋白即为融合蛋白TrxA-TGLD。而TGLD与促溶标签TrxA之间存在肠激酶EK酶切位点,酶切后可得到活性TGLD。如图3-c所示,融合蛋白酶切后,56 kDa处条带随着酶切作用逐渐形成38 kDa处的条带,与成熟TGase条带大小一致,酶切前后TGLD的酶活力分别为0.23 U/mL和0.26 U/mL(图3-d)。

a-E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)中表达的SDS-PAGE[1-标准分子质量蛋白(Maker);2-pET32a未诱导;3-pET32a诱导; 4-pET32a-tgLD未诱导;5-pET32a-tgLD诱导;(2~5为全细胞);6-pET32a未诱导;7-pET32a诱导;8-pET32a-tgLD未诱导; 9-pET32a-tgLD诱导;(6~9为破壁上清液);10-pET32a未诱导;11-pET32a诱导;12-pET32a-tgLD未诱导;13-pET32a-tgLD诱导; (10~13为破壁沉淀)14-TGase标样];b-pET32a-tgLD部分质粒图谱;c-融合蛋白TrxA-TGLD肠激酶酶切前后的SDS-PAGE (1-标准分子质量蛋白(Maker);2-肠激酶酶切前;3/4-肠激酶酶切后);d-融合蛋白TrxA-TGLD肠激酶酶切前后的酶活力

图3 重组TGLDE.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)中的表达
Fig.3 Expression of recombinant TGLDin E.coli BL21 (DE3) (pET32a-tgLD)

为提高重组菌E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)的酶表达水平,对诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间进行了优化(图4)。在重组菌E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)中诱导表达TGLD的最佳条件为:添加IPTG终浓度为0.2 mmol/L,25 ℃下诱导8 h,重组TGLD的酶活力为0.45 U/mL。虽然经过一系列的优化措施,实现了在E.coli中直接表达成熟TGase,但表达量较低,在表达过程中重组蛋白以不溶的包涵体为主要存在形式,这与KAWAI等[14]的研究结果一致。MARX等[16]研究已表明,pro-TGase可在E.coli中可溶性表达,但是pro-TGase需要进行体外活化才能得到活性TGase。为实现TGase在E.coli中高效表达,接下来尝试在E.coli中先表达pro-TGase,然后再建立相对简便可控的体外TGase活化体系。

a-不同诱导温度的影响;b-不同IPTG浓度的影响;c-不同诱导时间的影响

图4 E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)表达TGLD的诱导条件优化
Fig.4 Optimization of the induction conditions of TGLD expression in E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)

2.4 Pro-TGLDE.coli中的可溶性表达

2.4.1 Pro-TGLD体外特异性活化质粒的构建

S.mobaraensis来源的TGase合成方式为:首先以无活性的酶原pro-TGase的形式分泌到胞外,通过菌体自身的金属蛋白酶(TAMEP)去除pro区的41个氨基酸后形成具有活性的FRAP-TGase,而剩余的FRAP需要四肽酶去除,完成TGase的活化过程。目前报道的能够激活pro-TGase的蛋白酶主要有胰蛋白酶、蛋白酶K、TAMEP、dispase(来源于Bacillus polymyxa)等。在这些蛋白酶中,胰蛋白酶和蛋白酶K都是对酶原进行的非特异性切割,会导致MTG的不稳定。TAMEP目前不能实现体外制备,而dispase不仅表达量少,而且会切除C端His标签中的组氨酸残基,不利于后续的纯化[7]。参照WANG等[17]的研究,在pro-TGase的酶原区和成熟酶区之间插入一种特定的蛋白酶的识别位点(肠激酶、Enterokinase EK、DDDDK),实现了pro-TGase的特异性激活。

tgLDpro区分别克隆至pET-22b(+)和pCOLDⅡ的Nco I-Xho I和Nde I-Xho I酶切位点之间,连接转化。提取质粒,pET-22b(+)-pro-EKXho I,pCOLDⅡ-pro-EKEcoR I和Xho I酶切后,分别与TGLD成熟区基因片段进行同源重组,PCR验证pro-EK-tgLD已成功连接至表达载体(图5)。凝胶电泳结果显示,pET-22b(+)-pro-EK-tgLD和pCOLDⅡ-pro-EK-tgLDpro-EK-tgLD序列正确。

a-不同表达载体的验证(M-DL5000 DNA标准分子质量; 1、2-pET-22b(+)-pro-EK-tgLD的验证产物;3、4-pCOLDⅡ- pro-EK-tgLD的验证产物);b-DL5000 DNA Marker条带放大展示

图5 表达载体pET-22b(+)-pro-EK-tgLD和 pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD验证
Fig.5 Validation of expression plasmids pET-22b(+)- pro-EK-tgLD and pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD

2.4.2 重组Pro-TGLDE.coli BL21(DE3) (pET-22b(+)-pro-EK-tgLD)中的表达

E.coli BL21(DE3) (pET-22b(+)-pro-EK-tgLD)在37 ℃培养至OD600值达到0.6~0.7时,添加IPTG至终浓度0.2 mmol/L,25 ℃诱导表达16 h。诱导后菌体破壁后的上清液中有目的条带(45 kDa)的表达(图6)。破壁上清液无法检测到酶活力,符合预期。而上清液经过肠激酶EK过夜酶切后,TGLD的酶活力为1.97 U/mL,结果表明,破壁上清液中的重组pro-TGLD可被肠激酶EK转化为活性TGase。

1-标准分子质量蛋白(Maker);2-pET-22b(+)空质粒发酵全细胞; 3-重组菌发酵全细胞;4-pET-22b(+)空质粒破壁上清液; 5-重组细胞破壁上清;6、7/8-经肠激酶处理的空质粒和 重组菌的破壁上清液;9-TGase标样

图6 重组pro-TGLDE.coli BL21(DE3) (pET-22b(+)- pro-EK-tgLD)中表达及肠激酶体外活化的SDS-PAGE验证
Fig.6 SDS-PAGE validation of recombinant pro-TGLD expression in E.coli BL21(DE3) (pET-22b(+)-pro-EK-tgLD) and in vitro activationby EK

2.4.3 重组Pro-TGLDE.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD)中的表达

E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD)在37 ℃培养至OD600值达到0.6~0.7时,在冰水中冷却培养液到15 ℃,放置30 min,添加0.2 mmol/L IPTG,15 ℃诱导表达24 h。如图7所示,诱导后菌体破壁后的上清液中有目的条带(45 kDa)的表达。破壁上清液经过肠激酶EK过夜酶切后,TGLD的酶活为25.23 U/mL,结果表明,破壁上清中的重组pro-TGLD可被肠激酶EK高效转化为活性TGase。E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD)中pro-TGLD的表达量显著高于E.coli BL21(DE3) (pET-22b(+)-pro-EK-tgLD)。

1-标准分子质量蛋白(Maker);2-pCOLDⅡ空质粒发酵全细胞; 3-重组菌发酵全细胞;4-pCOLDⅡ空质粒破壁上清液; 5、重组细胞破壁上清液;6、7-经肠激酶处理的空质粒和 重组菌的破壁上清液;8-TGase标样

图7 重组pro-TGLDE.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ- pro-EK-tgLD)中表达及肠激酶体外活化的SDS-PAGE验证
Fig.7 SDS-PAGE validation of recombinant pro-TGLD expression in E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD) and in vitro activationby EK

目前链霉菌属的TGase或Pro-TGase基因己经在E. coliB.subtilis、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酵母菌等多个宿主中成功表达(表4)。TGase在食品级表达宿主C. glutamicum和解脂酵母菌(Candida lipolytica)中的研究相对较少,但在这两种表达系统中统中产生的杂蛋白少。特别是C. glutamicum因其GRAS(Generally Recognized as Safe)的特性,生长速度快、营养需求低等优势,可能更容易实现异源表达TGase的工业生产。E.coliB.subtilis两种表达系统是目前异源表达研究的首选,TGase在这两种底盘细胞中表达的研究较多,但在这两种表达系统中想获得活性TGase也较困难。本研究与已报道的将MTGase在E.coli 表达系统成功表达的案例相比(表4),表达量也是最高,说明通过重组E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD)可以实现pro-TGase的高效可溶性表达。同时,也可以方便快捷地实现pro-TGase的活化,对后续研究具有一定的参考价值。值得考虑的是,在后期研究中需要探索更加高效且经济的方案,实现活性TGase在E.coli 中表达效率的进一步提高。

表4 MTGase在不同菌株中的异源表达
Table 4 Heterogenous expression of MTGase in different strains

载体表达菌株来源菌株酶活力或比活力/(U/mg)参考文献pET-28aE.coli BL21(DE3)S.mobaraenesis 1.51[18]pET-22bE.coli BL21(DE3)S.mobaraenesis 21.30[19]pET-32aE.coli Transsetta (DE3)S.mobaraenesis 3.03[20]Pmal-c5EvE.coli Star(DE3)S.mobaraenesis22.70[21]pWB980B.subtilis WB600S.mobaraenesis16.10[22]pINA1297Yarrowia lipolytica Po1 hS.mobaraenesis49.78[23]Pxmj19LC.glutamicum ATCC13032S.mobaraenesis54.80[24]

3 结论

本研究通过比较两个不同S.mobaraensis来源的TGase的酶学性质,筛选获得来源于S.mobaraenesis CGMCC 4.1851的TGase-TGLD,其具有较好的稳定性以及较高的催化活性。将TGLD基因分别构建到6种表达载体中,并将其转化E.coli BL21 (DE3),筛选获得重组菌E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)可以直接表达出有活性的成熟酶TGase,经过诱导条件优化,TGase酶活力达0.45 U/mL。改变TGase的表达形式,在重组菌E.coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD)中实现了pro-TGase的高效可溶性表达。经EK特异性活化,TGase酶活力达25.23 U/mL,与野生菌表达的TGLD相比较,其效价提高了11.19倍。

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Efficient expression of Streptomyces mobaraensis transglutaminase in Escherichia coli

YUAN Fang1, LI Guoying2, GU Qiuya1, YU Xiaobin1*

1(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Jiangsu Yiming Biological Technology Co. Ltd., Taixing 225400, China)

ABSTRACT Transglutaminase (TGase) can promote intramolecular or intermolecular cross-linking of proteins, and is widely used in food, pharmaceutical, textile, and other industries.In order to efficiently produce TGase with excellent properties, two TGases from Streptomyces mobaraensis were investigated in this study.The properties of two TGases from different strains were investigated, and the TGase gene tgLD with excellent properties was heterologously expressed in Escherichia coli using six different plasmids, respectively.Mature TGase was successfully expressed in the recombinant E.coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD).The activity of recombinant TGLD reached 0.45 U/mL after 8 h induction using 0.2 mmol/L IPTG at 25 ℃.In order to further improve the expression level of TGLD, two recombinant strains were constructed to specifically activate pro-TGase, respectively.The activity of TGLD in recombinant E.coli BL21(DE3) (pCOLDII-pro-EK-tgLD) after activation in vitro reached 25.23 U/mL after 24 h induction using 0.2 mmol/L IPTG at 15 ℃.Activated TGLDwith excellent properties were efficiently expressed in E.coli in this study.

Key words transglutaminase;Streptomyces mobaraensis;Escherichia coli;efficient expression

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.039235

引用格式:袁方,李国莹,顾秋亚,等.茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的高效表达[J].食品与发酵工业,2025,51(5):61-69.YUAN Fang, LI Guoying, GU Qiuya, et al.Efficient expression of Streptomyces mobaraensis transglutaminase in Escherichia coli[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(5):61-69.

第一作者:博士研究生(余晓斌教授为通信作者,E-mail:xbyu@jiangnan.edu.cn)

收稿日期:2024-03-15,改回日期:2024-04-25