传统塑料包装制品因性能稳定、价格低、可塑性强等优势已广泛应用于环境、医疗、化工和食品等领域[1],然而,传统的膜材料由于脆性较大,大多使用后难以回收利用。在风化、机械和生物等作用下,残膜在土壤、水源、动植物中积存[2],从而造成大量的“白色污染”。近年来,随着公众的食品安全意识和环保意识显著提高,食品保鲜膜作为与内装食品直接接触的材料,人们对其食品安全等级提出了更高的要求。因此,研制出更加安全、易降解、防腐的新型材料是食品包装发展的必然趋势。
天然生物膜与传统的石油基包装材料相比具有绿色环保、易降解、来源广等特点[3]。壳聚糖是一种天然氨基多糖,功能基团丰富、无毒无害且可再生,具有一定的成膜性和优良的广谱抑菌性,但因其机械性能较差、气体和水蒸气渗透性较高等缺点,很少单独使用[4]。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一种天然的免疫小分子多肽,一般由12～50个氨基酸残基组成,不仅广泛存在于动物和植物中,还可以通过化学合成或改造方式得到[5]。由于AMPs具有广谱的抗菌性、低耐药性等特点,是最有希望替代抗生素的候选药物[6]。将壳聚糖与AMPs进行复配后可以得到具有抗菌能力的膜材[7],这类具有抗菌效果的复合材料因具突出理化特性和抗菌功效,应用前景广阔[8]。添加抑菌肽制成的抑菌包装在食品行业中具有巨大的应用潜力。
目前,含AMPs的抗菌包装已广泛用于乳制品、肉、水果、蔬菜等食品[9]。奶酪由于口感鲜美,营养成分丰富,且食用方便易于消化和吸收等诸多优点,被誉为乳中的“精品”[10]。但是,因为奶酪在加工过程中的高度处理、冷链不足以及即食特性,其很容易受到致病微生物和腐败微生物的污染,导致保质期缩短,给消费者的健康带来风险[11]。目前常见的奶酪保鲜技术有盐水浸渍、真空干燥、气调包装等技术[12-13],但存在传热速度慢、干燥时间长、奶酪中盐分过高[14]等诸多不足。本文以壳聚糖、明胶作为成膜材料,加入自提的具备抑菌活性的苦杏仁多肽[15],以期能够改善膜的理化特性及抗菌性,并使用该膜对奶酪进行包裹处理,探究苦杏仁抑菌肽/壳聚糖复合膜对奶酪的保鲜效果,以拓展苦杏仁抑菌肽在食品包装上的应用,为开发应用新型的抗菌保鲜包装提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
苦杏仁及奶酪在新疆省乌鲁木齐市沙依巴克区北园春市场采购。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌,北京永泽浩嘉生物技术发展中心;木瓜蛋白酶(酶活力800 U/mg)、葡聚糖凝胶G-25、考马斯亮蓝G250,上海源叶生物科技有限公司;LB肉汤、琼脂粉,北京奥博星生物技术有限责任公司;其余化学试剂均为分析纯,天津鑫铂特化工有限公司。
1.2 仪器与设备
ZYJ-7090单螺杆榨油机,东莞市方太电器有限公司;SF-GL-16A高速冷冻离心机,上海菲恰尔分析仪器有限公司;ALpha 2-4 LSCplus冻干机,德国Christ公司;UV-1200型紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;LDZF-50L-I灭菌锅,上海申安医疗器械厂;HD-21-1核酸蛋白检测仪、HL-2S恒流泵、HD-A电脑采集器,上海沪西分析仪器厂;Agilent Zorbax 300SB-C18,美国安捷伦公司;Q Exactive HF-X超分辨液质联用仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;CMT-8102电子万能试验机,深圳新三思材料检测有限公司;CT3质构仪,博勒飞中国阿美特克商贸(上海)有限公司;GS-NF500微量切向流不锈钢高压纳滤系统,上海顾信生物科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 抑菌肽粉的制备
采用张涛等[15]的方法制备苦杏仁抑菌肽,将去油后的杏仁粕以料液比1∶25(mg∶mL)加入蒸馏水,碱溶酸沉法[16]提取粗蛋白,溶解为质量浓度为30 g/L的溶液,调节溶液pH值为7.0,加入25 g/L木瓜蛋白酶匀速搅拌。将溶液在74 ℃条件下恒温水浴3 min后,于100 ℃进行10 min灭酶,在4 000 r/min下离心15 min,收集上清液。使用超滤装置将酶解液经30～10 kDa的滤膜分离,收集截留液,冷冻干燥后,在Sephadex G-25柱(1.6 cm×60 cm)上进一步纯化,多肽上样质量浓度为9.38 mg/mL,在0.68 mL/min速度条件下用纯水洗脱。使用核酸蛋白检测仪在280 nm条件下紫外检测波长,用自动接收器接收样品,测定各组分的抑菌活性[17],收集活性强的滤液,冷冻干燥后获得抑菌肽粉,于4 ℃保存待用。
1.3.2 复合膜的制备
按照董晶等[18]的方法稍加修改,取0.5 g壳聚糖与2 g明胶加入到100 mL体积分数为1%的冰乙酸水溶液中,于80 ℃持续搅拌至溶解,加入2%甘油作为增塑剂,加入最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)为3.13 mg/mL的自提抑菌肽粉[15],混匀后将该混合液超声20 min除去气泡,倒入规格为150 mm×200 mm的平皿中,置于30 ℃烘箱中干燥24 h。根据肽粉添加量的不同,将复合膜分别命名分为A:0%抑菌肽复合膜;B:1 MIC抑菌肽复合膜;C:4 MIC抑菌肽复合膜。
1.3.3 复合膜的性能测定
1.3.3.1 抑菌活性测定
采用滤纸片法测定抑菌活性[19]。将活化后的待测菌用无菌生理盐水连续稀释调整至105 CFU/mL菌落形成单位,在超净工作台内,吸取试验菌液100 μL均匀涂于LB平板培养基上。使用打孔器制作直径6 mm的滤纸圆片,在膜溶液中浸泡2 h,将浸泡过的滤纸片贴于平板培养基上,37 ℃条件下培养12 h,采用十字交叉法测量抑菌圈直径。试验重复3次,无菌水作空白对照。
1.3.3.2 不透明度测定
将复合膜裁成10 mm×30 mm大小,贴在石英比色皿内壁,利用紫外分光光度计在600 nm波长处测定薄膜的吸光值,薄膜不透明度的计算如公式(1)所示:
薄膜不透明度
(1)
式中:A600,复合抑菌膜样品在600 nm下的吸光度值;x,复合抑菌膜的厚度,mm。
1.3.3.3 水蒸气透过率测定
参照付东升[20]的方法并略做修改,水蒸气透过率采用拟杯子法测定。选择规格40 mm×25 mm的称量瓶,在瓶中加入约26 g完全干燥硅胶,用复合膜封住瓶口。将称量瓶放在温度为30 ℃恒温恒湿箱(50%相对湿度)内,每隔1 h取出称量瓶称重。每组3个平行。膜的水蒸气透过率计算如公式(2)所示:
水蒸气透过率
(2)
式中:Δm,t时间内玻璃杯的质量变化,g;e,薄膜厚度,m;t,时间,s;S,玻璃杯口的面积,cm2;P,25 ℃下纯水的饱和蒸汽压,Pa。
1.3.3.4 机械性能测定
根据国标GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测试》分别测量各复合膜的机械性能,将复合膜裁剪成20 mm×60 mm的长方形,使用电子万能试验机,设置施加的载荷大小为500 N,夹具间初始夹距为40 mm,加载速度为5 mm/min,每种复合膜测量3次,结果取平均值。
1.3.4 复合膜对奶酪保鲜效果的评价
1.3.4.1 奶酪预处理
在无菌条件下将奶酪切分成方块(1 mm×1 mm×1 mm),用紫外灯表面杀菌处理20 min。将奶酪块分为4组,第一组不处理,其他3组分别用复合膜A、B和C进行包装,将所有样品放入灭菌自封袋中于(25±1) ℃贮藏。每组处理3个样品,结果取平均值。以第0天作为空白对照,每隔10 d取样1次进行后续各项指标的测定。
1.3.4.2 奶酪的感官评分
采用10分制的评分方法,挑选10名感官评价人员,以奶酪色泽、滋味、组织结构、异味和整体接受度为感官维度,分别对贮藏1个月后的不同处理的奶酪打分,评分标准如表1所示。
表1 奶酪感官品质评分标准
Table 1 Sensory quality score standard of cheese
色泽滋味组织结构气味整体接受度评分/分乳白色入口细腻,酸甜适中 质地均匀,软硬适中,无水析出 奶香浓郁接受度高8.1～10略微发黄入口细腻,略微发酸 质地发软,有微量水珠,不影响销售奶香变淡接受度一般6.1～8发黄入口颗粒感,略微发酸质地发软,少量水析出,影响销售 无奶香味,有酸味接受度差4.1～6发黄且有微量霉点入口颗粒感,酸味明显质地变软,水分析出明显,影响销售无奶香味,酸味明显,有异味 接受度极低2.1～4发霉明显入口颗粒感,酸味明显质地变软,结构疏松易碎,影响销售无奶香味,酸味明显,异味严重无法接受0～2
1.3.4.3 色度
根据胡寅轩等[21]的方法,将产品切成大约1 cm×1 cm×1 cm规格的小块,用色差仪测定贮藏过程中奶酪颜色的L*(亮度)、a*(红-绿)、b*(黄-蓝)值,在测量前,色度计以白色标准板进行校准。每个样品测量3次。使用公式(3)计算总色差(ΔE*):
(3)
式中:每组样品在第0天测得的L*、a*和b*平均值被视为标准样品值。ΔE*值越大,表示所取样品与标准样品间的色差越明显。
1.3.4.4 质构特性
根据吴涵清等[22]的方法,用质构仪对样品的硬度、弹性和咀嚼性质进行分析,将规格为10 mm的立方体奶酪按照纤维垂直于压缩盘的方向放置,压缩探头选用圆柱型探头P/0.5S。测定条件如下:测前速度5.00 mm/s,测中速度1.00 mm/s,测后速度5.00 mm/s,触发力0.2 N,形变量50%,压缩2次。
1.3.4.5 菌落总数
依据国标GB 4789.2—2022《食品微生物学检验 菌落总数测定》对菌落总数进行测定,取1 g奶酪样品与9 mL无菌水混合均匀,进行梯度稀释后,吸取1 mL稀释样液,打入培养皿内,并加入冷却后的PCA培养基约25 mL,每个稀释度做3个平皿,2个等量空白稀释液作为空白对照实验。在37 ℃恒温培养箱内培养40～48 h,观察平板中微生物,并进行平板计数。结果取平均值。
1.4 数据处理
使用Excel 2019统计数据进行数据分析,每个样品重复3次实验,结果用平均值±标准偏差表示,采用SPSS 26进行显著差异性及方差分析,用Origin 2021绘图。
2 结果与分析
2.1 复合膜的性能分析
2.1.1 抗菌活性分析
由表2可知,未添加抑菌肽的对照组对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有一定的抑菌效果,随着抑菌肽的添加量增多,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径逐渐增大,添加抑菌肽的复合膜对大肠杆菌的抑菌性与无抑菌肽的对照组相比差异性较低,是由于苦杏仁抑菌肽对革兰氏阴性菌的抑菌效果较差,壳聚糖起主要抑菌功效。
表2 抗菌复合膜的抑菌性能
Table 2 Antibacterial properties of antibacterial composite film
样品抑菌圈直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌对照组14.68±0.65b10.02±0.61c11.35±0.81c1 MIC抑菌肽复合膜16.27±0.52a13.87±0.72b13.41±0.24b4 MIC抑菌肽复合膜17.04±0.50a15.83±0.62a16.01±0.38a
注:同一列中不同小写字母(上标)表示数值之间存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.1.2 复合膜的水蒸气透过率、不透明度分析
表3为苦杏仁多肽/壳聚糖复合膜的水蒸气透过率与不透明度。未添加抑菌肽的复合膜水蒸气透过率较低,添加了抑菌肽的复合膜水蒸气透过率下降至最低0.16 g/(m·s·Pa)。与此相反,未添加抑菌肽的复合膜不透明度最低,随着抑菌肽的添加量增大而升高,最高为0.33 mm-1。降低食品中水分的流失是食品包装材料的重要功能,膜的水蒸气透过率应该尽可能低。
表3 苦杏仁多肽/壳聚糖复合膜的水蒸气透过率和不透明度
Table 3 Water vapor transmittance and opacity of bitter almond polypeptide/chitosan composite membrane
样品膜厚度/mm水蒸气透过率/[g/(m·s·Pa)]不透明度/mm-1对照组0.35±0.050.66±0.680.12±0.011 MIC抑菌肽复合膜0.20±0.030.34±0.380.16±0.064 MIC抑菌肽复合膜0.10±0.050.16±0.190.33±0.21
膜的水蒸气透过率随着抑菌肽的添加而降低可能是由于抑菌肽的加入改变了分子的结晶结构,使得膜的结构更加有序紧密,膜基质间的空隙减小,阻碍水分子透过膜孔隙[23]。透光率是复合膜的透明度的体现,同时也是判断共混分子相容性好坏的辅助手段。膜的不透明度随着抑菌肽的添加而增加,可能是因为抑菌肽的掺入导致复合膜的微观结构发生变化[24]或出现团聚现象[25],从而引起膜透明度的下降。
2.1.3 复合膜的机械性能分析
复合膜的弹性模量、断裂伸长率、拉伸强度如表4所示,从对照组、1 MIC抑菌肽复合膜、4 MIC抑菌肽复合膜3组结果可知,复合膜的弹性模量并不随着抑菌肽的加入而表现出明显变化,而断裂伸长率与拉伸强度都随着抑菌肽的不断增加,呈现先降低后回升趋势,但整体呈现下降趋势。这是由于肽的添加引起苦杏仁多肽/壳聚糖在膜内发生团聚,使共混体系中分子链的缠绕减轻,局部区域的相互作用减弱,导致复合膜的拉伸强度有所降低[26]。而当抑菌肽含量增加到4 MIC时,苦杏仁多肽/壳聚糖分子间充分的交联,使分子链在受力时更难发生滑移,从而有效提升了膜的拉伸强度[27]。
表4 苦杏仁多肽/壳聚糖复合膜的机械性能
Table 4 Mechanical properties of bitter almond polypeptide/chitosan composite membrane
样品弹性模量/MPa断裂伸长率/%拉伸强度/MPa对照组0.58±0.13a57.93±9.71a0.51±0.19a1 MIC抑菌肽复合膜0.64±0.08a25.62±1.05b0.21±0.02b4 MIC抑菌肽复合膜0.59±0.06a49.10±5.32a0.43±0.04a
2.2 复合膜对奶酪保鲜效果的分析
2.2.1 奶酪的感官评价
图1为不同复合膜包装奶酪的感官评价结果,由图1可知,有膜包装的奶酪在1个月后的各项指标都较好,显著强于未包装的奶酪,添加了抑菌肽的复合膜包装保鲜了1个月后奶酪的滋味、整体接受度、气味等指标较好,表现出乳白色,入口细腻且奶香浓郁,而抑菌肽的添加量增加对奶酪气味、色泽等指标的影响不大,组织状态与滋味随着肽添加量增加得分略高,可能是由于肽中的抗菌物质抑制了贮藏期微生物的繁殖,使奶酪保持良好的状态。
图1 奶酪的感官评价雷达图
Fig.1 Sensory evaluation radar chart of cheese
2.2.2 奶酪的色度
由表5可知,无膜包装的奶酪样品和添加1 MIC抑菌肽复合膜包装的奶酪样品在30 d贮存期间无明显颜色变化。复合膜包装的奶酪样品和添加4 MIC抑菌肽复合膜包装的奶酪样品其颜色变化在贮存10 d后出现显著差异。随着贮藏时间的延长,4组样品的ΔE*值都逐渐增大,无膜包装的奶酪样品ΔE*值最大,表明其色泽变化最大,易被消费者察觉,影响消费者的购买意向。抑菌肽复合膜包装具有较强的抗菌作用,有助于保持奶酪原有色泽。
表5 不同复合膜包装奶酪的总色差值(ΔE*)
随贮藏时间的变化
Table 5 The total color difference (ΔE*) of cheese packaged with different composite films changed with storage time
贮藏时间无膜对照0 MIC抑菌肽复合膜1 MIC抑菌肽复合膜4 MIC抑菌肽复合膜第10天1.11±0.18a0.95±0.38b0.90±0.25a1.01±0.32b第20天2.41±1.76a2.01±0.80a1.76±0.51a1.75±0.41a第30天2.93±1.18a2.30±0.23a2.00±1.94a2.13±0.21a
2.2.3 奶酪的质构特性
分别取奶酪贮藏0、10、20、30 d的样品,测定其质构的变化,结果如图2所示。整体来看,奶酪的硬度和弹性随着贮藏时间的延长呈现降低的趋势,而咀嚼度逐渐增加。空白组奶酪硬度、弹性迅速下降而咀嚼度呈现先增后降趋势。抑菌肽复合膜包装的奶酪其硬度、弹性、咀嚼度的下降速度都明显低于其他组,这可能是由于随着贮藏时间的延长,无膜包装的奶酪蛋白质水解程度加强,肽链分开断裂,蛋白间相互作用力减弱,酪蛋白的网状结构变得宽松,另外脂肪水解析出,水分含量降低,导致奶酪疏松易碎[28],硬度弹性以及咀嚼度都下降。0 MIC抑菌肽复合膜包装的奶酪,膜孔隙率低,且隔绝外部环境,有效地保护了物质流失及分解,在不同程度减少了蛋白分解程度,脂肪析出和水分损失。1 MIC和4 MIC抑菌肽复合膜包装的奶酪这2组膜中含有的抑菌物质发挥了抗菌功效,减缓了微生物的生长,从而减慢蛋白质的分解,因此变质较为缓慢,可以较好的保持奶酪质地。
a-抑菌复合膜对奶酪硬度的影响;b-抑菌复合膜对奶酪弹性的影响;c-抑菌复合膜对奶酪咀嚼度的影响
图2 不同复合膜包装奶酪的质地随贮藏时间的变化
Fig.2 The texture of cheese packaged with different composite films changed with storage time
2.2.4 奶酪的菌落总数
奶酪在30 d贮藏期间的菌落总数的变化如图3所示。在整个贮藏周期内,奶酪的菌落总数随着时间的延长显著上升。无膜包装的空白组奶酪菌落总数急速增加,第10天达到(7.98±0.34) lg CFU/g,超过国家标准所规定的菌落总数范围7.0 lg CFU/g,说明奶酪已经变质,不可再食用。而抑菌肽复合膜包裹的奶酪在贮藏第30天时,菌落总数仅为6.36 lg CFU/g。这是由于包裹复合膜能防止奶酪直接暴露于外界环境中,阻挡外源微生物侵害奶酪,且有效减少水分流失和脂肪析出。抑菌肽复合膜能够进一步有效阻止空气中的细菌在奶酪表面生长繁殖以及抑制内源微生物的生长,能更大限度地保持奶酪原有的风味和良好的品质,延长其货架期,保证了食用安全性。
图3 不同复合膜包装奶酪的菌落总数随贮藏时间的变化
Fig.3 The total number of colonies of cheese with different composite film packaging changed with storage time
3 讨论
大多数包装材料是石油基塑料,被丢弃后难以降解,造成严重的环境污染和生物多样性的破坏[29]。为了寻找可再生、可降解的环保聚合物材料,以可再生资源为基础的生物降解材料的逐渐兴起。壳聚糖是自然界中天然高分子材料甲壳素的衍生多糖,除了良好的成膜性外,还具有无毒、抑菌、生物降解性等特点,是制备食品包装材料的理想原料[30]。然而壳聚糖成膜后的保湿性和机械性能等不甚理想,限制了壳聚糖作为食品包装材料的应用[31]。抑菌肽作为一种天然防腐剂,因不易产生耐药性和具有广谱的抑菌活性使其在食品工业中也有着广阔的应用前景。近年来抑菌肽复合薄膜以优良的物理性能、完全的生物降解性和独特的保鲜效果已逐渐受到关注[18]。
本研究为探究苦杏仁多肽的加入对壳聚糖复合膜的物理特性和生物活性的影响,及其抑菌膜在食品保鲜中的应用,以壳聚糖、明胶为成膜剂,复配苦杏仁抑菌肽,流延烘干后制成苦杏仁多肽/壳聚糖可食性复合膜。采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为指示菌,采用滤纸片法测定膜液的抑菌活性,实验结果得出,添加抑菌肽对复合膜的抑菌效果具有加强作用,且对革兰氏阳性菌的抑菌效果随着抑菌肽的添加量增多逐渐增大。测定膜的水蒸气透过率与不透明度发现:添加抑菌肽能够降低复合膜的水蒸气透过率、提升膜的不透明度。薄膜的水蒸气透过率越大,阻水率越低,内部食品的水分更容易丧失,提升薄膜水蒸气透过率有利于更好地保护食品品质[32]。使用电子万能试验机测量各复合膜的弹性模量、断裂伸长率和拉伸强度。从测量结果可以看出复合膜的弹性模量并不随着抑菌肽的加入而表现出明显变化,但随着抑菌肽的不断增加断裂伸长率与拉伸强度略微下降。抑菌肽的加入使膜的机械性能略微下降。可以通过改性蛋白[33]或者采用加热处理[34]有效改善膜的物理特性。
将奶酪采用苦杏仁多肽/壳聚糖复合膜包裹处理。以1个月为期,探究苦杏仁抑菌肽/壳聚糖复合膜对奶酪原有的的保鲜效果。通过对贮藏期的奶酪感官评价发现苦杏仁多肽/壳聚糖复合膜能够有效保持奶酪在色泽、滋味、组织结构、异味和整体接受度等方面的理想感官属性。抑菌肽复合膜包装的奶酪的硬度、弹性、咀嚼度下降速度都明显低于空白组奶酪,说明抑菌肽复合膜包装能够保护奶酪在贮藏期的结构与性质,对奶酪品质的影响较少。在整个贮藏周期内,空白组奶酪菌落总数急速增加,仅需10 d就超过国家标准所规定的菌落总数范围7.0 lg CFU/g。而抑菌肽复合膜包裹的奶酪贮藏30 d后,菌落总数仅为6.36 lg CFU/g。因此,用此复合膜进行包装对奶酪保鲜货架期的延长起到一定的推动作用,能够实现奶酪在常温条件的贮藏,并延长奶酪的货架期,降低因腐败变质造成的损失,保证奶酪贮藏过程中良好的品质和食用安全性。
4 结论
本文以明胶、壳聚糖作为薄膜载体,加入苦杏仁抗菌肽,研制出了一种新型的苦杏仁抑菌肽/壳聚糖复合膜,将该膜对奶酪进行包裹处理。探究苦杏仁抑菌肽的加入对壳聚糖复合膜的抗菌性、不透明度、水蒸气透过率和机械性能的改善,并对抑菌肽复合膜包装后奶酪的感官性能、色度、质构、菌落数进行评价。结果表明,随着抑菌肽的加入,复合膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌功效显著增强,加了抑菌肽的复合膜水蒸气透过率下降,对水分的阻隔性变好,但透光性下降,弹性模量未表现出明显变化,断裂伸长率与拉伸强度整体呈现略微下降趋势,但仍然保持者原有的机械性能。将苦杏仁抑菌肽/壳聚糖复合膜应用于奶酪的包装中,能有效保持其原有的色泽、风味和品质,抑制奶酪中腐败微生物的生长。
食品可降解包装有着巨大的发展应用前景,苦杏仁抑菌肽/壳聚糖复合膜的研究是将环保包装技术和保鲜技术进行有效的结合,为今后开发新型食品抗菌保鲜包装提供思路。
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