肉制品在食品消费中占很大比例,肉制品的质量安全受到政府及消费者广泛关注。其中兽药的不合理使用、甚至滥用,导致动物源性食品中存在兽药残留超标的问题[1]。磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine, SMZ)属于磺胺类药物,是一种广谱抑菌剂,能够治疗溶血性链球菌、脑膜炎球菌和肺炎球菌等引起的传染病,具有持久的效果[2]。有研究表明,SMZ能破坏人的造血系统而造成溶血性贫血症[3-5],会引起过敏反应、急慢性中毒、破坏泌尿系统[6],同时也存在潜在“三致”的危害[7]。根据GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》可知,SMZ在奶中的最大残留限量为25 μg/kg,在其他食品中的最大残留限量为100 μg/kg。目前,SMZ检测方法有超高效液相色谱串联质谱[8]、LC-MS[9]和HPLC-MS[10]。这些方法具有灵敏度高、准确度高[11]等优点,但不适用于快速检测或现场检测场所。
适配体是指对目标物具有高度特异性识别作用的单链DNA或RNA[12]。适配体电化学传感器因其响应快、简单便携等特点,被广泛应用于兽药残留检测方面[13-15]。MALECKA-BATURO等[16]构建了适配体电化学传感器测定四环素。此适配体的两端分别修饰巯基及二茂铁,通过Au-S将适配体固定在金电极表面,利用适配体识别四环素时构象变化导致二茂铁信号响应变化,从而实现四环素定量分析。SUI等[17]构建基于光活性材料g-C3N4纳米片和适配体的光电化学传感器。二茂铁标记的适配体(aptamer-Fc)作为抗生素氯霉素的识别元件和光电化学生物传感器的电子供体。加入氯霉素后,aptamer-Fc识别氯霉素,从g-C3N4纳米片表面释放,导致光电化学响应降低。该传感器在1 pmol/L ～100 nmol/L呈现良好的线性,检出限低至0.22 pmol/L。GAO等[18]基于Fc标记引物和石墨烯-亚甲基蓝纳米复合材料,制备了卡那霉素的比率型电化学传感器。Fc标记引物与适配体杂交形成刚性结构,当卡那霉素与适配体特异性结合后,引物被释放并形成发夹结构,使Fc靠近电极表面,从而增强Fc信号,实现卡那霉素的定量分析。然而,此类传感器需要标记电化学信号物,标记过程耗时、成本高且标记后的适配体识别能力受到一定影响。
介孔二氧化硅纳米材料(mesoporous silica nanoparticles, MSN)[19]作为一种多孔的纳米材料,具有结构稳定,比表面积比较大、孔隙率高和生物相容性好等优点。本研究引入MSN,富集电化学信号增强探针亚甲基蓝(methylene blue,MB)[20],构建基于介孔二氧化硅的无标记适配体电化学传感器,实现快速、高灵敏SMZ的检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
3- 氨丙基三乙氧基硅烷[(3-aminopropyl) triethoxysilane, APTES]、正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS),美国Damas-beta公司;NaOH,中国重庆川东化工(集团)有限公司;十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB),美国Biosharp公司;亚甲基蓝(methylene blue,MB),中国医药集团上海化学试剂公司;SMZ,阿尔塔科技有限公司;SMZ适配体(5′-TTAGCTTATGCGTTGGCCGGGATAAGGATCCAGCCGTTGTAGATTTGCGTTCTAACTCTC-3′),生工生物工程(上海)股份有限公司。猪肉,重庆本地超市。
1.2 仪器与设备
JEM-1200EX透射电子显微镜,日本电子株式会社;CHI660E电化学工作站,上海辰华公司。所有的电化学测量均在室温下使用三电极体系进行。以铂丝电极为对电极,Ag/AgCl为参比电极,玻碳电极(面积0.07 cm2)为工作电极。
1.3 实验方法
1.3.1 MSN制备
参考文献[21]制备MSN。称取0.45 g CTAB放入烧瓶中,加入200 mL的纯水充分溶解,然后加入1.5 mL浓度为2 mol/L的NaOH溶液,然后油浴至80 ℃并保持搅拌。逐滴加入2.25 mL TEOS,继续搅拌2 h使反应物完全反应后,静置并冷却以获得白色絮状沉淀。沉淀用乙醇和水分别洗涤3次,并放置在真空干燥箱中过夜,将干燥后的颗粒放入马弗炉中,在550 ℃下焙烧5 h,得到MSN颗粒。
称取0.75 g MSN颗粒和1.75 mL APTES,放入50 mL无水乙醇中,调节油浴温度为110 ℃,缓慢搅拌10 h后,12 000 r/min离心10 min,沉淀用乙醇和水分别洗涤3次,并放置在真空冷冻干燥箱中过夜,得到氨基化的MSN颗粒(NH2-MSN)。
1.3.2 电化学信号增强探针的制备
取40 mL 100 mg/L的MB溶液置于锥形瓶中,再加入40 mg NH2-MSN颗粒,在40 ℃下振荡1 h,过滤水洗后将颗粒干燥,得到负载MB的MSN颗粒,形成电化学信号增强探针。
1.3.3 电化学传感器的构建
取40 mg 信号增强探针溶于1 mL PBS缓冲液(pH 7.4)中,超声混合后吸取10 μL滴涂在玻碳电极表面,放置过夜。之后用PBS缓冲液冲洗电极表面。再将10 μL 50 μmol/L的磺胺二甲嘧啶适配体溶液滴加在电极表面,常温下放置5 h。在电极表面添加10 μL不同浓度的目标物,常温下放置1 h充分反应。利用循环伏安法(cyclic voltammetry,CV)测定其电信号。CV测量是在0.1 mmol/L KCl含有5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的电解溶液中进行,扫描速率为50 mV/s,电压为-0.2～0.7 V。
1.3.4 实际样品测定
SMZ标准溶液加入0.5 g猪肉中,静置10 min。将此猪肉均质为匀浆状,用1 mL乙酸乙酯超声提取,离心10 min后收集上清液。氮吹后溶解在10 μL PBS缓冲液(pH 7.4)中,得到样品溶液。采用电化学传感器进行测定。
2 结果与分析
2.1 磺胺二甲嘧啶的适配体电化学传感器构建及可行性分析
适配体电化学传感器构建原理图如图1所示,利用经典水热方法制备MSN,再利用硅烷化试剂制备氨基修饰的MSN。MSN具有多孔结构,可以吸附电化学活性物质MB。将负载MB的MSN滴涂在玻碳电极表面,氨基修饰的MSN通过静电成膜吸附固定在玻碳电极表面。加入适配体后,由于带负电适配体与氨基修饰MSN的静电结合作用,MB被封闭在MSN空隙中。当目标物SMZ出现时,适配体与SMZ发生特异性识别作用,从而脱离MSN表面,其中的MB逸散在体系中,加速电子传递,通过检测体系电化学信号的变化能间接反应SMZ的含量。
图1 电化学传感器构建示意图
Fig.1 Schematic diagram of electrochemical sensor construction
利用CV研究电化学适配体传感器的构建。由图2可知,氨基修饰后的MSN(a)固定在电极表面后,有一对较为对称的氧化还原峰。当负载MB的MSN修饰在玻碳电极表面时,氧化还原峰值电流明显增加(b),因为负载的MB具有良好的电活性,显著加快了阴离子向电极表面迁移的速率,说明MB负载成功。当加入适配体后,氧化还原峰值电流明显减少(c),因为带负电的适配体由于静电作用覆盖在氨基修饰MSN的表面,阻碍MB的扩散,实现MSN封盖,形成电化学信号增强探针。添加目标物SMZ后,适配体识别SMZ引起适配体构象改变,导致MB逸散,氧化还原峰值电流增加(d)。
a-NH2-MSN修饰的电极;b-负载MB的NH2-MSN修饰的电极;c-电化学信号增强探针修饰的电极;d-加入SMZ后电化学信号增强探针修饰的电极
图2 不同修饰电极的CV图
Fig.2 CV diagram of different modified electrodes
2.2 NH2-MSN形貌及结构研究
采用透射电镜研究NH2-MSN形貌,结果如图3-A所示,所制备MSN具有良好的分散性,粒径约为100 nm的规则球状。利用红外光谱研究MSN的结构,从图3-B(a)中可以看出,在1 060 cm-1和800 cm-1处有2个强峰,分别为Si—O—Si的不对称和对称伸缩振动峰,说明MSN制备成功。在图3-B(b)中1 550 cm-1附近出现了新峰,这是NH2基团的伸缩振动峰,说明介孔颗粒表面已成功修饰上氨基。
A-透射电镜图;B-红外光谱图(a-MSN;b-NH2-MSN)
图3 NH2-MSN透射电镜图及MSN和NH2-MSN红外光谱图
Fig.3 TEM image of NH2-MSN and Fourier transform infared spectra of MSN and NH2-MSN
2.3 传感器构建条件的优化
2.3.1 适配体浓度的研究
适配体的浓度是影响电化学传感器成功构建的一个主要因素。若适配体浓度过低,则介孔材料表面吸附量少,孔隙没有被完全封盖,导致部分MB逸散,电流强度增大;而当适配体浓度过高,介孔材料表面吸附量多,目标物与适配体结合时仍有部分适配体封盖在介孔材料表面,影响了MB的外逸,导致电流偏低。由图4可知,随着适配体浓度的增加,电流呈下降趋势。这是由于随着适配体浓度的增加,MSN的封盖效果逐渐明显,当适配体浓度达到50 μmol/L时,电流强度最低且趋于稳定。故选择50 μmol/L适配体构建传感器。
图4 适配体浓度对电流强度的影响
Fig.4 Effect of aptamer concentration on current intensity
注:封盖时间5 h。
2.3.2 适配体封盖时间的研究
由图5可知,随着封盖时间的延长,电流呈下降的趋势,这是因为随着封盖时间的延长,更多的适配体吸附在介孔材料表面并将MB封盖在孔隙中。当封盖时间达到5 h之后,电流最低且趋于稳定,说明实现完全封盖的效果,故选择5 h为体系封盖时间。
图5 封盖时间对电流强度的影响
Fig.5 Effect of capping time on current intensity
注:适配体浓度50 μmol/L。
2.3.3 孵育时间的研究
适配体需要与目标物孵育一段时间才能更好地识别目标物。因此本研究探讨了孵育时间对电流强度的影响。由图6可知,随着孵育时间的延长,电流逐渐增加,当孵育时间为1 h时,电流达到最大,并趋于稳定,说明电化学传感器中适配体与SMZ结合已达到饱和。因此,选择1 h为最佳孵育时间。
图6 孵育时间对电流的影响
Fig.6 Effect of incubation time on current intensity
注:适配体浓度50 μmol/L;封盖时间5 h。
2.4 适配体电化学传感器的检测性能
在上述的优化条件之下,以不同浓度SMZ为横坐标,电流为纵坐标绘制标准曲线,结果如图7所示。随着SMZ浓度的增大,电化学传感器电流强度逐渐增大,因为适配体与SMZ特异性结合,引起适配体构象变化,MB从介孔MSN中释放,从而导致电流不断增大。从图7-B中可以看出,电流强度与SMZ浓度的对数在5 pg/mL～10 ng/mL有较好的线性关系,线性回归拟合方程为y=2.633 77x+1.818 6,R=0.999。本方法的检测限为1.024 pg/mL,表明该电化学传感器具有较高的灵敏度。
A-不同SMZ浓度的CV图(a-0;b-5 pg/mL;c-10 pg/mL;d-50 pg/mL;e-100 pg/mL;f-1 ng/mL;j-10 ng/mL);B-电流与SMZ浓度对数的线性关系
图7 电化学传感器对SMZ的电流响应
Fig.7 Current response of electrochemical biosensor with SMZ
2.5 电化学传感器的特异性
本实验以敌敌畏、敌百虫和高效氟氯氰菊酯为对照农药研究电化学传感器的特异性,结果如图8所示。加入1 pg/mL,SMZ引起的电流响应最好,而其他农药造成的电信号很低,甚至无响应,因为电化学传感器中的适配体与SMZ可以特异性结合,而与其他农药无明显作用。结果表明该电化学传感器对SMZ具有良好的特异性。
图8 电化学传感器选择性
Fig.8 Selectivity of the electrochemical biosensor
2.6 实际样品测定
本实验以猪肉为实际样品研究电化学传感器的实际测定效果。加标回收实验结果如表1所示,本研究对SMZ检测的回收率为98.3%～100.2%,说明该电化学传感器可以用于真实复杂样品中SMZ的测定。同时,较低的相对标准偏差进一步证明了本研究在SMZ检测方面具备优异的准确度和精密度,从而确保了检测结果的可靠性和稳定性。
表1 实际样品加标回收率(n=3)
Table 1 Actual sample spiked recovery rate (n=3)
样品加样量/(ng/mL)检出量/(ng/mL)回收率/%相对标准偏差/%10.10.100 2100.21.3210.99799.74.8354.9198.32.8
3 结论
本研究构建了一种基于核酸适配体封盖介孔材料的无标记电化学传感器用于检测猪肉中磺胺二甲嘧啶。在最优条件下,该电化学传感器的线性范围为5 pg/mL ～ 10 ng/mL,检测限为1.024 pg/mL,并成功用于猪肉中SMZ的测定,加标回收率为98.3% ～ 100.2%。该电化学传感器具有优越的灵敏度、良好的稳定性、优良的选择性和快速响应等优点,为食品安全快速检测技术提供了一定的思路。
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