我国传统的面包在30 ℃的环境中发酵,放入烤箱中烘烤成熟,因其便携、美味的特点深受人们喜爱。已有的研究结果表明,面包中的挥发性物质达73种[1]。传统面包生产工艺通常是在28～30 ℃进行发酵,例如一次发酵法、二次发酵法、三次发酵法以及快速发酵法[2]。影响酵母生长繁殖和活性的重要因素就是温度,低温胁迫环境会使微生物发酵和生长速度均下降。温度会直接影响酵母的生长繁殖,温度较高,酵母生长较快容易加速衰亡,温度较低会导致酵母生长周期变长[3]。低温胁迫环境会使微生物发酵和生长速度均下降,但低温环境下易挥发风味物质更加容易被保留,且有助于控制有害微生物繁殖,从而提高面包品质,还具有面团面筋形成扩展充分的优点。
低温发酵在发酵乳、面包和泡菜等食品中已有相关研究与应用[4-5]。低温发酵常被用于啤酒、日本清酒及白葡萄酒的生产中,被认为可以增加和保留更多的挥发性香气成分,从而改善发酵酒的风味[6]。低温发酵可以促进醇类、酯类、酮类、萜烯类等芳香物质的合成[7],对基因的表达调控、氮代谢抑制(nitrogen catabolite repression,NCR)机制有一定影响,能够降低高级醇的含量,且能够增加萜烯类和乙酸酯类香气物质[8]。发酵对与发酵密切相关的基因及其调控表达可能存在一定影响。如酵母在低温下有较高的糖吸收,糖酵解缓慢。细胞代谢主要依靠通透性酶以驱动培养基中养分摄取,低温会使通透性酶构象发生改变。这些都对低温条件下发酵面包拥有更优质的感官性质有着积极影响。GAMERO等[9]发现低温发酵下生产的葡萄酒中甘油、乙基酯的产量显著上升。URBINA等[10]发现发酵温度与啤酒中高级醇的含量成正比。低温发酵可以使面包产生更丰富的芳香物质,因此本研究旨在提高面包的感官品质。
面包的整体香气取决于风味化合物的种类和含量,风味是评价面包品质的重要指标[10]。关天琪等[1]从薏仁红豆面包及传统红豆面包中共检测出73种挥发性化合物,包含醇类、醛类、酸类、酯类、烃类、杂环类等挥发性物质,发现主要贡献风味的物质为醛类、醇类和酯类。这些物质或构成面包骨架香气,赋予面包独特风格和口感。本研究采用定量描述性分析法研究低温发酵面包特征风味化合物。通过GC-MS确定具有香气贡献的特征化合物,并结合Origin研究面包特征香气化合物,分析低温发酵面包不同发酵时间的挥发性风味化合物特征,为低温发酵面包工艺研究和品质测定提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
低温发酵酿酒酵母菌株W65为本实验室保藏;AR酵母提取物LP0021。
D-(+)-葡萄糖,生物公司(上海)股份有限公司;面包用小麦粉,南顺(山东)食品有限公司;黄油,安琪酵母股份有限公司。
1.2 材料与试剂
Agilent 7890A/7200Q气相色谱-质谱联用仪(集高分辨定性鉴定与高灵敏度定量分析于一体的气相/质谱系统),美国Agilent科技公司;H3-16KR台式高速冷冻离心机(自动计算离心力,转速离心力可以相互一键切换),济南禾普仪器设备有限公司;US910C微量分光光度计,上海元析仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 常温发酵面包
接种选定的酵母菌株,于盛有3 mL YPD培养基的无菌试管中活化14 h,取2 mL无菌试管中的菌液,转接到盛有50 mL YPD液体培养基的100 mL三角瓶中,于振荡培养箱培养45 h,离心菌液,得到菌泥,蒸馏水洗再离心,弃上清液,得到所用鲜酵母。
原料:高筋面粉100 g,酵母3.6 g,盐1.4 g,糖20 g,烘焙奶粉15 g,蛋液18 g,水54 mL,黄油14 g。工艺流程为:
搅拌→发酵→整形→醒发→烘焙→冷却
操作要点:
a)将所有原料(除黄油)进行充分搅拌混合,揉搓出厚膜,加入黄油,充分揉搓直至出现薄且结实的手套膜。
b)面团制作完成后,放入食品级塑封盒中,于30 ℃的生化培养箱中发酵2 h。
c)取出面团,用手将面团由边缘向内折叠按压,将面团内的空气排出,然后进行分割、整形,再次放入30 ℃的生化培养箱中醒发1.5 h。
d)取出后在面团表面刷上一层蛋黄液,于烤箱(上火170 ℃、下火140 ℃)烘烤25 min,烤熟取出,冷却。
1.3.2 低温中种发酵面包
低温中种发酵法包括中种面团和主要面团。中种面团配方为面粉70%、酵母3.6%、水50%。主面团主要配方为面粉30%、盐1.4%、糖20%、烘焙奶粉15%、蛋液18%、水4%、黄油14%。中种面团面粉与主面团面粉质量比为70∶30。本实验各原辅料用量配方均以中种面团和主要面团的总面粉质量为基准,即各成分占总面粉质量的百分数[2](下同)。工艺流程为:
中种面团搅拌→低温发酵→主面团搅拌→发酵→整形→醒发→烘焙→冷却
操作要点:
a)将面粉、水和所制得的酵母进行充分搅拌混合,制得中种面团,放入食品级塑封盒中,放入生化培养箱(10 ℃)中发酵12、24、48、72 h、7 d,共5种不同发酵时间的低温中种面团。
b)取出中种面团后,需要把中种面团撕成小块加入主面团的原料(除黄油)中充分搅拌混合均匀,成团后揉搓均匀,面团出现厚膜,加入黄油,充分揉搓直至出现薄且结实的手套膜。
c)面团制作完成后,放入食品级塑封盒中,于30 ℃的生化培养箱中发酵2 h。
d)取出面团,用手将面团由边缘向内折叠按压,将面团内的空气排出,然后进行分割、整形,再次放入30 ℃的生化培养箱中醒发1.5 h。
e)取出后在面团表面刷上一层蛋黄液,于烤箱(上火170 ℃、下火140 ℃)烘烤25 min,烤熟取出,冷却。
注意事项:
a)鲜酵母应先用温水摇匀,再加入其余原料中,然后揉成面团。
b)当揉出的面团过于黏手时,可以加入少量面粉,不可过量加入,面团太硬不利于发酵。
c)原料中的水应控温在30 ℃左右,再与其他原料进行混合搅拌,避免水温过低影响面包的发酵。
d)烤箱提前预热30 min,使烤箱内上下温度趋于稳定,再进行面包的烘烤。
e)将中种面团与主面团混合的时候,把中种面团撕成小块儿,再进行混合,为的是使材料充分混合均匀,无需害怕破坏面筋结构。
f)黄油于中种面团和主面团混合后加入。
g)烘烤的温度与时间,应根据烤箱的情况和面包的着色情况而定,进行酌情调整。
1.3.3 质谱条件
顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME):称取面包芯样品5 g,将其均匀装入20 mL顶空样品瓶中,且样品不能超过顶空样品瓶的1/2,孵化样品10 min,振摇速度450 r/min,孵化温度60 ℃,萃取深度22 mm,萃取时间20 min,进样深度42 mm,脱附时间180 s,固相微萃取头250 ℃老化5 min,自动进样。
1.3.3.1 GC-MS条件
GC条件:色谱柱:TG-5SILMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气:BIP He,载气流速:1.2 mL/min。柱温:初始温度60 ℃,保留2 min,以10 ℃/min升至200 min,保留0 min,20 ℃/min升到300 ℃,保留3 min;进样孔温度250 ℃,分流流量:50 mL/min,分流比:33.3。
MS条件:电离模式EI;电子能量70 eV;离子源温度250 ℃;检测模式:全扫描,整个质量扫描范围为40～500 m/z,时间为24 min。
1.3.3.2 定性定量分析
进行GC-MS分析后根据正构烷烃的保留时间计算检测物质的保留指数。利用全离子扫描的质谱图,比对NIST数据库(National Institute of Standards and Technology)中的标准谱图确定物质名称。
1.3.4 感官评定
结合国标GB/T 14611—2008《粮油检验 小麦粉面包烘焙品质试验 直接发酵法》和GB/T 14612—2008《粮油检验 小麦粉面包烘焙品质试验 中种发酵法》,制定面包的感官评分标准(表1),总分100分。由10人组成的品鉴小组进行感官品评,包括研究面包风味的5名研究生和5名具有面包品评经验的本单位食品系教师。分析前对本次感官分析人员进行感官分析技术、分析方法和产品知识的培训,确保品评结果可靠有效。品评人员对面包的形态、色泽、气味、口感和组织的感官强度进行评定,每名品评人员对同一样品品评3次。每个面包的感官数据取感官特性结果的平均值。
表1 面包的感官评分标准表
Table 1 Sensory rating scale for bread
项目标准得分/分形态(20分)完整、丰满、无缺损龟裂,表面光洁,无明显斑点16～20较完整,表面有龟裂现象,光泽度差11～15有缺损、龟裂现象,表面粗糙0～14色泽(20分)呈金黄色、淡棕色或棕灰色,均匀一致,无烤焦发白现象16～20色泽较均匀,有烤焦现象11～15颜色不均匀,有烤焦发白现象0～10风味(20分)具有浓郁的烘烤和发酵后的面包香味,无异味16～20具有较淡的烘烤和发酵后的面包香味11～15没有明显的面包特有的香味0～10口感(20分)面包口感细腻,没有粗糙的颗粒感,醇厚、有韧性16～20口感细腻但有一定的颗粒感,比较筋道醇厚11～15粗糙的颗粒感,不筋道没有醇厚感0～10滋味(20分)香甜可口,麦香味浓郁16～20较为香甜,有淡淡的麦香味11～15味道较苦,机会没有麦香味0～10
对常温发酵面包与不同低温发酵时间的低温中种发酵面包的感官评分结果,通过Tukey多重比较检验进行显著分析,95%置信区间。
2 结果与分析
2.1 低温发酵面包感官性状分析
香气是评价面包品质的重要指标之一。低温发酵较常温发酵高级醇含量减少,产生种类更加丰富的芳香物质和铁锌类的乙酸酯类香气物质[8],拥有更优的感官品质。发酵过程中所产生的代谢产物是影响产生呈香物质的主要因素。对低温发酵面包5种发酵方式进行感官定量描述分析。通过分析品鉴小组对面包的评分,发现低温10 ℃条件下发酵12、24、48、72 h、7 d制备的面包的感官评分要显著高于常温发酵面包的感官评分,评分由72分别提高至84.8,86,89.8,90和98.5分(图1)。如图2-a～图2-e所示,低温10 ℃条件下发酵12、24、48、72 h、7 d制备的面包较常温发酵面包面筋网状结构更细腻,丰满且富有弹性,表面光滑有色泽,尤其是低温发酵7 d的实验组较常温发酵面包风味评分提高62.5%。
图1 不同发酵方法的面包感官评分
Fig.1 Sensory score of bread by different fermentation methods
注:***代表差异极显著(P<0.001)。
a-10 ℃/12 h;b-10 ℃/24 h;c-10 ℃/48 h;d-10 ℃/72 h;e-10 ℃/7 d;f-10 ℃下5组低温发酵均值;g-10 ℃/12 h、10 ℃/24 h、10 ℃/48 h、10 ℃/72 h、10 ℃/7 d
图2 常温发酵面包与5种不同低温发酵时间下面包感官评分数据对比
Fig.2 Comparison of bread sensory score between normal temperature and five different low temperature fermentation time
如图2-f和图2-g所示,图2低温发酵下的各个时间的面包感官评分都较为接近,均优于常温发酵面包的感官评分,且均获得较高的面包风味评分。低温中种发酵面包整体色泽均匀、香味浓郁、松软适口。低温发酵7 d的面包感官评分最高,虽然低温发酵72 h和7 d的面包各个方面的感官评分较为接近,但是在7 d低温发酵的面包中,面包的风味更突出,评分更高,低温发酵7 d可能产生了更多的酯类物质和芳香味物质,接下来本研究使用GC-MS对不同发酵处理面包样品的风味成分进行检测。
2.2 面包中挥发性风味成分分析
低温发酵对于产品风味改善有重要作用,PETRUZZIELLO等[11]通过气相GC-MS分析得出一些挥发性物质是葡萄酒的主要来源,通过HS-SPME和GC-MS技术进行香味物质测定。检测出常温发酵法制作的面包共有393种物质,经过菌种筛选得到18种物质,低温中种发酵法共检测出364种挥发性物质,经过菌种筛选得到14种物质,2种面包的主要挥发性香味物质包括酸酐、醇类、酯类、烯烃、烷烃、芳香族及杂环化合物,其中芳香族物质有17种、醇类物质7种、烯烃物质4种、脂类物质4种、酸酐物质3种、杂环化合物4种、烷烃物质2种。由于低温发酵过程中含有一定数量和种类的其他微生物群,生成醇、酯、醛、酮等多种风味物质,使产品质地细致而且香醇可口。
王芮东等[12]对面包的香气成分进行测定,结果显示酯、醇、醛、酚、醚、苯类的含量均高于普通面包,并且香味更明显。本次实验中检测出常温发酵法制得的面包中产生的2-丙-2-基氧基丙-1-醇和(S)-(+)-6-甲基-1-辛醇在其他5种低温发酵方法中未检测出,推测其可能由于高温作用产出并影响常温面包口感的因素之一。并且低温中种发酵法还产生甲酸甲酯、乙二醇苯醚、丁二酸二乙酯等令人愉快的香味物质,具体不同发酵方法下面包中挥发性物质的成分含量请见增强出版附表1(https://10.13995/j.cnki.11-1802/ts.039329)。除此外,低温发酵7 d时检测出3-羟基-2-丁酮、2-壬酮和丁二酸二乙酯,其在另外5种发酵条件下均未出现,并且2-壬酮是天然菌种面包的特征挥发性物质,它具有较强的香气和持久的持续时间,能够显著增强食品的香气和口感[13],2-壬酮具有独特的香气,因此在香料和香精工业中也有一定的应用。3-羟基-2-丁酮间接影响甜味的产生[14],它具有令人愉快的奶油香味,用于奶油、干酪、咖啡、果实、面包的香味增强剂,作为配制奶油、乳品、酸奶和草莓型等的香精。本研究通过感官评定得分发现低温发酵7 d的面包醇香浓郁,风味特征明显。并且3-羟基-2-丁酮呈牛奶香气,丁二酸二乙酯具有微弱的令人愉快的香气,在食品中起到增香的作用,4-甲基-5-噻唑乙醇具有稍好闻的坚果香气,肉香、酵母、面包带油性硫黄气[15]。推测7 d发酵的面包风味较其他手法更好的原因是产生了多种特殊的香气物质。
由图3可知,芳香族物质含量最多。根据感官定量分析低温中种发酵面包的评分远高于常温发酵,低温中种发酵的面包中芳香化合物高于常温发酵。因此,确定芳香族化合物为面包中主要的香味物质。
图3 低温发酵面包挥发性香味物质分析
Fig.3 Analysis of volatile aroma compounds in low-temperature fermented bread
2.3 芳香化合物分析
芳香类物质是面包风味中香气的主要来源,芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是许多具有商业价值的化合物的前体[16],因此芳香族物质是低温发酵面包香味连接的重要纽带。低温发酵面包中芳香化合物热图分析结果如图4所示,发现苯乙醇、丙烯酸异冰片酯、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚在制作的6种面包中均存在,且苯乙醇含量均很高。苯乙醇是小麦香、甜味、松软、弹性、香甜等属性的主要贡献者[17],苯乙醇具有玫瑰花香、蜂蜜香、甜香,低温与常温发酵最大差异在于乙基酯的产量[9],大多数菌株在常温发酵时乙酸酯产量增加,而在低温时相应醇的产量较高,这可能表明乙酰转移酶的活力在较高温度下可能会增加。除癸酸乙酯外,低温发酵明显更有利于乙基酯的生产[9,17]。因此苯乙醇极有可能是面包香气的重要组成部分。
图4 低温发酵面包中芳香化合物热图分析
Fig.4 Thermographic analysis of aromatic compounds in low-temperature fermented bread
低温条件下发酵会对酿酒酵母的代谢产物组成产生影响。较常温条件,2种条件下发酵糖的消耗量基本相同,主要代谢物(乙醇和甘油)的合成量也没有明显差异,但芳香物质的合成量却有着巨大差异。实验中发现,在低温中种发酵法发酵7 d制得的面包中,有特征香气且广泛用于香精香料中的芳香物质种类最多,有9种,分别为:正戊醇、3-羟基-2-丁酮、2-戊基呋喃、2-壬酮、苯乙醇、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、α-亚乙基-苯乙醛、4-甲基-5-噻唑乙醇,而常温发酵法制得的面包中只有3种,分别为:正戊醇、2-戊基呋喃、苯乙醇。其中,常温发酵法制得的面包含有苯乙醇49.48%,低温中种发酵法低温发酵12、24、48、72 h、7 d制得的面包中苯乙醇含量分别为:88.63%、64.13%、61.18%、73.33%、75.51%。可以看出,低温中种发酵法产生的苯乙醇含量显著高于常温发酵法,在此前的研究也证明在低温条件下更容易合成乙酯类物质[7],相反可以使醇类、醛酮类与挥发性酸等物质含量降低,而乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙醇、异戊醇、苯乙醇和苯乙酸乙酯等是面包具有芳香气味的主要物质[18],因此本研究认为苯乙醇是低温中种发酵获得更高感官评分的主要因素。
3 结论
以低温酿酒酵母W65为发酵菌种探究其对面包低温发酵品质的影响,感官评定结果表明,低温中种发酵法制得的面包感官评分要显著高于常温发酵法,获得面包品质优良。通过HS-SPME对制作的6种面包进行处理,提取香味物质,利用GC-MS进行检测,发现获得更高面包风味评分的低温发酵面包中苯乙醇含量要显著高于常温发酵面包中苯乙醇含量,且低温中种发酵法比常温发酵法产生更为丰富的香味物质,包括2-甲基己酸、乙酸苯乙酯、α-亚乙基-苯乙醛、2-甲基丁酸、异丙醇、3-羟基-2-丁酮、2-壬酮、4-甲基-5-噻唑乙醇、甲酸甲酯、乙二醇苯醚、丁二酸二乙酯等。尤其是,在低温中种发酵7 d制得的面包中检测到9种具有特征香气且广泛用于香精香料中的香味物质,明显高于常温发酵的3种,这些因素可能也是低温中种发酵面包获得更高感官评分,特别是面包风味评分的主要原因。
本研究虽然通过感官评定和香味物质含量分析测定初步发现了低温发酵与面包增香的相互关系,但香味物质对低温发酵面包感官品质的贡献程度和主次关系仍需要在未来的工作中进一步探究。
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