中国白酒(Baijiu)作为嗜好性风味饮品,千百年来深受国民喜爱。现如今社会中白酒更是中国传统文化的重要组成部分,不仅承载着深厚的历史底蕴,还是现代饮食文化与社交活动中不可或缺的元素。白酒行业中认可的白酒香型基本上包括浓香型、酱香型、清香型、凤香型等[1]。白酒中醇、醛、酸、酯等物质能决定香味与口感的成分一般不超过2%,酸类和酯类物质占这类微量香味成分的70%以上,因此两者的含量对白酒的风味起关键作用[2-4]。白酒中己酸、乳酸、乙酸、丁酸占酒体总酸含量的90%以上,己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯四大酯类占总酯含量的90%～95%[5-6]。不同香型白酒在发酵过程中生成的酯类物质比例有差异,白酒在贮存过程中酸和对应的酯达到动态平衡[7-8]。GB/T 10781.1—2021《白酒质量要求 第1部分:浓香型白酒》、GB/T 10781.8—2021《白酒质量要求 第8部分:浓酱兼香型白酒》、GB/T 10781.9—2021《白酒质量要求 第9部分:芝麻香型白酒》对浓香型白酒、浓酱兼香型白酒、芝麻香型白酒均新增加了酸酯总量的要求,例如浓香型高度白酒(40%vol～68%vol)和浓酱兼香型白酒(25%vol～68%vol)中要求一年期以上优级白酒中酸酯总量≥35.0 mmol/L、一级白酒酸酯总量≥30.0 mmol/L。因此需要研究一种快速、准确的酸酯总量分析方法,便于调整生产工艺,把控酒体品质[9-11]。
白酒中酸酯总量检测一般参照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》进行酸碱中和滴定,酯类需要加热回流皂化,一套装置每次只能处理一个样品,样品用量大需50 mL,一个工作日才能出具检测结果[12]。黄清霞等[13]利用近红外建立了一种检测白酒中酸酯总量的模型,该模型在44.66～85.96 mmol/L有较好的预测能力,但对于低浓度的酸酯总量的预测效果不达标。类似的,唐云容等[14]利用中红外技术分析了酱香型白酒中酸酯含量,总酸与总酯的决定系数(R2)分别为0.994以及0.987,模型预测能力较低。熊秋萍等[12]利用色谱分析技术对白酒中四酸四酯进行了定量,较指示剂法大幅度的缩短了检测时间,但仍需耗费2 h。中高端酒中四酸四酯总量与总酸总酯存在一定偏差,但白酒中四酸约占总酸的90%[15],四酯约占总酯的90%～95%,可近视将四酸四酯看作总酸总酯。近年来,核磁定量法(quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)在食品、药品、中药材分析中应用日益广泛[16-18],且制样简便,样品用量仅需600 μL,检测时间快速,可重复性高。核磁谱图信息丰富,可以定量白酒中乙醇浓度,糠醛含量等相关信息[19-20]。借鉴相关研究成果,本研究拟建立一种利用核磁对白酒的酸酯总量快速定量的方法,为企业和相关部门提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验所用6种优质基酒样品,某浓香白酒生产企业提供;标示的商品白酒样品,自贡沃尔玛等大型超市及专卖店,共12个样品。
重水(D2O,D≥99.9%)、3-三甲基硅基丙酸钠[sodium 3-(trimethylsilyl)propionate-2,2,3,3-d4,TMSP(98%)],Cambridge Isotope Laboratories公司;无水乙醇(99.5%,HPLC)、乙酸(99%,HPLC)、己酸(99%,RG)、乳酸(90%,试剂级)、丁酸(99%,试剂级)、乙酸乙酯(99.8%,HPLC)、己酸乙酯(99%,试剂级)、丁酸乙酯(99%,试剂级),上海泰坦科技股份有限公司;乳酸乙酯(99%,GC),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Bruker Avance Ⅲ HD 600 MHz核磁共振波谱仪,Bruker公司;ME204分析天平(d=1 μg),Mettler-Toledo/梅特勒-托利多公司;Wiggens Vortex 3000涡旋振荡器,德国Wiggens公司。
1.3 实验方法
1.3.1 核磁共振波谱法
准确移取540 μL样品至核磁管中,加入60 μL D2O溶液[含内标3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠5 mmol/L,TMSP,δ=0],涡旋30 s混合均匀,待测。
核磁共振波谱仪共振频率为600.13 MHz,5 mm BBO探头;采用布鲁克标准脉冲序列noesygpps1 d压制白酒中水峰(δ=4.80)和乙醇峰(δ=1.18和δ=3.64);采样点数(time domain,TD):64 K;采样时间(acquisition time,AQ):2.73 s;扫描次数(number of scans,NS):32;检测温度:298 K;数据采集时间约19 min,样品检测前等待5 min用于稳定温度。
核磁共振谱图采用MestReNova 14.3.3软件进行相位矫正,零点矫正,多点基线自动矫正;对定量信号区间和内标信号区间自动积分。参照《中华人民共和国药典(2020年版)》中核磁检测方法,将积分数值带入工作曲线,计算得到酸酯总量结果。
1.3.2 指示剂法
酸酯总量的测定参照白酒分析方法GB/T 10345—2022《白酒分析方法》中指示剂法,吸取50.0 mL样品于250 mL烧瓶中,先以0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定游离酸。再加入上述50.00 mL的氢氧化钠标准滴定溶液,加热回流30 min使酯皂化,用0.05 mol/L硫酸标准滴定溶液滴定。然后吸取50.0 mL乙醇(无酯)溶液(40%vol),处理方法同上,用硫酸标准滴定溶液滴定做空白实验。最后通过计算得出样品中的酸酯总量[12]。
1.3.3 溶液配制
标准溶液:参考真实白酒基酒中各成分的含量,各物质以纯品计,精密称取乙酸2 000 mg、乙酸乙酯4 000 mg、乳酸1 000 mg、乳酸乙酯3 000 mg、己酸3 000 mg、己酸乙酯8 000 mg、丁酸400 mg、丁酸乙酯1 000 mg,以52%(体积分数,下同)乙醇溶液定容于1 000 mL容量瓶;用52%乙醇溶液配制200、150、100、50、25、10、5、2.5 mmol/L的梯度混合溶液。
内标溶液:精密称取TMSP,配制成含量为5.0 mmol/L的D2O溶液。
2 结果与分析
2.1 定量峰的选择
定量分析的关键就在于定量峰选择,如图1所示,根据物质结构和在核磁谱图出峰位置的不同,将白酒中的酸酯分为4类,A:α甲基酸酯,包含乙酸和乙酸酯,积分区域为δ=2.00～2.14;B:α亚甲基酸酯,包含己酸及己酸酯、丁酸及丁酸酯等,积分区域为δ=2.24～2.40;C:α次甲基酸酯,主要是乳酸及乳酸酯,积分区域为δ=4.26～4.40;D:α氢酸酯,主要是甲酸及甲酸酯,出峰区间δ=8.20～8.35。通过将基酒样品1与各种酸酯标准品的核磁共振氢谱进行比对,代表性酸酯如图1所示。从D处积分可以看出该部分主要代表的甲酸及甲酸酯含量很低,仅占有总积分值的0.1%左右,本次定量研究中忽略,酸酯总量近似等于A、B、C三部分物质量的和。
图1 基酒样品1的核磁谱图分析
Fig.1 Analysis of NMR spectrum of base wine sample 1
2.2 标准工作曲线与定量公式
配制的梯度浓度混合溶液,进行核磁检测,如图2所示,用TopSpin 4.1.3软件对不同浓度的混合溶液的氢谱图进行叠图,可以看出3个目标积分区域有良好的辨识度。目标峰的高度和面积随浓度递减呈现出下降和减小的趋势,与总酸总酯随浓度下降而酸酯含量减小的结果相符合,也从侧面验证了标准曲线的准确性。
图2 不同浓度混合液的核磁共振氢谱叠图
Fig.2 Comparison of 1H NMR stacks of mixed solutions with different concentrations
以A(α甲基)、B(α亚甲基)、C(α次甲基)三部分的物质的量浓度为横坐标(x,mmol/L),A、B、C定量区间的积分值(内标积分为1)为纵坐标(y),用最小二乘线性回归模型对曲线进行拟合:y=ax+b,其中b是y轴截距,a是直线的斜率,参照文献方法[21]计算了检出限(limit of detection, LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ),结果如表1所示。决定系数(R2)≥0.999 8,则校准曲线的线性可以接受,测试结果表明,以TMSP为内标测试酸酯含量时,线性关系良好。LOD和LOQ的值表明该定量方法满足白酒分析要求。
表1 总酸总酯的积分区间和线性结果
Table 1 Integral interval and linear results of total acid ester content
H部分LOD/(mmol/L)LOQ/(mmol/L)线性范围/(mmol/L)R2y=ax+bA:CH30.6642.0130.881～70.4550.999 9y=1.229 4 x+0.467 4B:CH20.2920.8841.181～94.4800.999 9y=1.800 4x+0.503 9C:CH0.1540.4650.442～35.3870.999 8y=3.854 2 x-0.107
2.3 精密度及加标回收
在相同的测试条件下,对基酒1溶液每隔1 h检测1次,连续测定6次,计算酸酯总量,分别为108.3、108.7、108.5、108.3、108.2、108.4 mmol/L,平均值为108.4 mmol/L,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.17%,表明仪器精密度高。
分别取基酒1样品,在相同的测试条件下进行6次平行测定,计算酸酯总量,分别为108.5、108.9、108.4、108.0、108.0、108.7 mmol/L,平均值为108.4 mmol/L,RSD为0.34%,说明该方法具有良好的准确性和重现性。
分别取基酒1样品,加入100 μL 50 mmol/L的酸酯混合标准溶液,平行3次,并通过标准曲线拟合的方程对各部分的加标回收率进行计算。结果如表2所示,甲基部分的回收率为99.3%～101.7%,RSD=1.31%;亚甲基部分的回收率为99.6%～101.4%,RSD=0.93%;次甲基部分的回收率为99.7%～101.7%,RSD=1.12%。每一部分的相对标准误差都在2%以下,这说明利用核磁共振技术对白酒的酸酯总量的测定结果是准确可靠的。
表2 加标回收率实验结果
Table 2 Experimental results of spiked recovery rate
积分区域标准溶液中含量/(mmol/L)加入量/(mmol/L)测得量/(mmol/L)回收率/%RSD/%38.617.655.899.3甲基部分38.717.656.199.71.3138.817.657.4101.754.523.679.2101.4亚甲基部分54.623.677.999.60.9354.523.678.7100.815.18.823.999.7次甲基部分15.38.824.1100.01.1215.28.824.5101.7108.250.1158.9100.4酸酯总量108.650.1158.199.70.80108.550.1160.6101.3
2.4 测定基酒样品中酸酯总量
对某企业6份基酒样品进行检测,该批次基酒的酸酯总量为90.1～109.0 mmol/L。表3中核磁法与国标指示剂法相比,2个方法定量结果的相对偏差介于0.56%～1.02%,小于2%,说明核磁定量的可行性和准确性。相对于核磁法,国标指示剂法耗时长、样品用量大,难以批量操作。
表3 白酒基酒样品酸酯总量测定结果
Table 3 Determination results of acid ester content in baijiu base liquor samples
酒样编号CH3部分/(mmol/L)CH2部分/(mmol/L)CH部分/(mmol/L)酸酯总量(核磁法)/(mmol/L)酸酯总量(指示剂法)/(mmol/L)相对偏差/%基酒138.754.515.2108.4107.80.56基酒229.461.617.3108.3107.40.84基酒328.840.321.090.189.50.67基酒433.543.619.896.996.00.94基酒531.649.720.1101.4100.60.80基酒635.958.914.2109.0107.91.02
2.5 测定商品白酒中酸酯总量
选用3种主要香型的部分市售商品进行白酒检测,从表4可以看出,相比其他几种白酒,酱香型白酒总体酸酯总量更高一些,乳酸及乳酸酯的含量也比其他香型白酒高,特别是茅台酒中酸酯总量高达62.2 mmol/L,青花郎中乳酸及乳酸酯含量为25.4 mmol/L;清香型白酒中乙酸及乙酸乙酯比例较高,其次为乳酸及乳酸酯,汾酒中乙酸及乙酸乙酯比例达到了78%(物质的量),衡水老白干中乳酸和乳酸乙酯比例高达33%;而浓香型白酒中含有α亚甲基的酸酯含量较高,间接佐证了己酸和己酸乙酯是浓香型白酒的主要风味成分。在不同档次泸州系列酒中高端产品中酸酯总量较高,国窖1573酸酯总量为36.0 mmol/L,低端产品中泸州老窖二曲只达到了14.6 mmol/L。
表4 商品酒中酸酯总量
Table 4 Acid ester content in commercial Baijiu
香型名称酒精度/(%vol)CH3含量/(mmol/L)CH2含量/(mmol/L)CH含量/(mmol/L)酸酯总量(核磁法)/(mmol/L)酸酯总量(指示剂法)/(mmol/L)酱香型贵州茅台酒5335.72.324.262.261.7青花郎5333.13.325.461.861.4潭酒5330.83.212.045.945.5浓香型五粮液5214.420.35.039.739.4国窖15735214.317.54.436.236.0泸州老窖特曲605211.911.64.127.527.3剑南春527.913.63.625.124.9泸州老窖特曲5211.213.33.427.427.2泸州老窖二曲527.35.91.614.714.6清香型汾酒5222.01.15.128.228.0天佑德(出口型)5224.82.97.435.134.8衡水老白干(优级十)5212.01.56.820.320.1
3 结论与讨论
酸酯总量是白酒检测中的重要指标之一,现行的国家标准中对酒中酸酯总量的测定方法沿用酸碱滴定,该方法繁复、耗时长,文献介绍的近红外等方法也有着各自的局限。本研究采用核磁共振技术分别定量白酒中羰基α位氢不同的3种酸酯,总和后近似得到酸酯总量,其方法具有简便快捷、测定值准确等特点。通过验证样品检测,核磁法与指示剂法相对偏差均小于0.02,已达到国家安全标准要求。白酒的核磁图谱信息丰富,检测酸酯总量的同时也可以定量其他风味成分,具有一定的学术价值和较好的应用前景。本研究建立的方法尚未见文献报道,可为白酒生产企业及相关监管部门提供参考。
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