川味香肠是由碎肉、香辛料等搅拌混匀后灌进肠衣中,依靠环境中的微生物进行发酵和成熟而制成[1]。由于地区和气候的差异性,以麻辣味为主的川味香肠深受消费者的喜爱,但川味香肠高度依赖自然发酵,在生产过程中极易被微生物污染,存在质量不稳定、风味衰减、易于氧化酸败等问题[2]。而为了改善其品质,会在发酵过程中添加微生物发酵剂。乳酸菌则是香肠中常用的发酵剂,在肉制品发酵过程中,乳酸菌可以将脂肪分解成游离脂肪酸,并产生挥发性化合物,从而改善发酵香肠的风味,同时可以将肉中的蛋白质降解成小分子物质,如肽、胺、醛或氨基酸,提高肉制品的质地和口感,促进消化吸收[3-4]。WANG等[5]发现用植物乳杆菌接种香肠可以增加游离脂肪酸含量而改善香肠的风味。GE等[6]筛选的植物乳杆菌可以改善香肠的颜色和质地。发酵肉制品含有的蛋白质会在氨基酸脱羧酶作用下脱羧形成生物胺,而酪胺是肉制品中含量最高的生物胺。少量摄入酪胺可以增强呼吸、促进心率,可调节血压和血糖浓度[7],但过量则可能会导致偏头痛、心悸、胃肠道问题和过敏反应等[8]。接种乳酸菌可以通过产生有机酸或分泌细菌素来抑制有害微生物和腐败菌的生长,并且可以减少生物胺积累,确保发酵肉制品的安全性。DIAS等[9]将沙克乳酸杆菌接种到干腌香肠中,不仅没有损害传统干腌香肠的质量,还降低了70%组胺含量。

目前将乳酸菌单一接种应用于发酵肉制品中的研究较多,BA等[10]将植物乳杆菌接种到发酵羊肉香肠中,发现接种植物乳杆菌能改善香肠品质,如:增加酸化活性,减少产品中的腐败细菌数量。HUGAS等[11]研究发现单独接种乳酸杆菌时,可以迅速降低产品pH,但是所得产品褪色严重,而HU等[12]研究发现同时接种植物乳杆菌和弯曲乳杆菌对香肠的香气、颜色和硬度属性具有积极影响。故乳酸菌复配发酵能弥补单一菌种的单调性,可利用菌种之间的协同作用改善产品品质,降低产品酪胺含量,提高产品安全性。

本研究采用植物乳杆菌L57和戊糖片球菌P25接种发酵生产川味香肠,对香肠的感官品质、微生物数量、理化指标、挥发性物质及酪胺含量进行分析,为生产中采用不同乳酸菌复配发酵生产发酵肉制品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌L57和戊糖片球菌P25,由四川农业大学肉品科学实验室从川味香肠中筛选鉴定得到(酪胺降解率分别达到23.47%、23.27%,并符合发酵肉制品发酵剂相关标准);猪肉、香辛料和猪肠衣等调料,四川省雅安市吉选超市;MRS培养基、氯化钠、氧化镁、甘油、甲基红、溴甲酚绿、硼酸、盐酸、高氯酸,成都浩搏优科技有限公司;酪胺、丹磺酰氯等,美国Sigma公司;

1.2 仪器与设备

NR110色差仪,深圳三恩时科技有限公司;TA.XT质构仪,超技仪器有限公司;PHS-3E pH计,上海仪电科仪有限公司;HD-3A智能水分活度测量仪,山东龙煤工矿机械有限公司;Ultimate 3000高效液相色谱仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;Agilent 7890A/5975气相色谱-质谱联用仪,安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的活化与制备

将乳酸菌以1%的接种量接种至MRS培养基中,37 ℃,24 h培养后,于4 ℃,8 000 r/min,离心15 min。弃去上清液,生理盐水洗涤2次。

1.3.2 发酵香肠的制作

发酵香肠制作工艺如下:

原料肉预处理→腌制→配料接种→搅拌均匀→灌肠→发酵成熟→成品

操作要点:1)原料肉预处理:去除猪肉筋膜、血渍后,清洗干净,切成肉丝;2)腌制:将切好的肉片中加入盐腌制剂,4 ℃下腌制4 h;3)配料接种:m(猪瘦肉)∶m(背膘)=3∶7,加入调味料(食盐2.5%,白砂糖1%,白酒1.5%,辣椒粉1%,花椒粉0.5%,胡椒粉0.05%,五香粉0.1%,亚硝酸盐0.007 5%,质量分数)、接种量107CFU/g;4)灌肠:将搅拌好的肉馅填充到30 mm的猪肠衣中;5)发酵成熟:温度20 ℃,相对湿度75%,发酵2 d,温度13 ℃,湿度60%下成熟28 d。4个分组:CK(不接种对照组);L57(只接种植物乳杆菌);P25(只接种戊糖片球菌);L57+P25(植物乳杆菌和戊糖片球菌按活菌比1∶2添加)。

1.3.3 感官品质的测定

1.3.3.1 感官评价

制作好的香肠于沸水中煮20～25 min,冷却后切成2 mm左右的片状,邀请10名具有食品相关专业背景且有感官品评经验的学生进行品尝评分,评分标准如表1所示。

1.3.3.2 色差仪

将香肠切成4.0 mm的薄片,用校正后的色差仪测量样品的L*值、a*值和b*值。

1.3.3.3 质构

质构仪参数参照张楠[13]的方法,略作修改,选用P/5R探头进行测定。

1.3.4 微生物计数

乳酸菌总数测定参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验》;菌落总数测定参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验》。

1.3.5 理化指标的测定

1.3.5.1 pH和水分活度的测定

pH:取5 g香肠绞碎,置于45 mL生理盐水中,摇匀过滤后用pH计测定;水分活度:将香肠样品置于水分活度仪中,记录仪器显示的测量值。

1.3.5.2 挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)的测定

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。

1.3.5.3 肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的提取

参照张培培[14]的方法。取4 g肉样,按料液比1∶8加入磷酸缓冲溶液A(0.03 mol/L,pH=6.5,提前预冷到4 ℃),高速均质匀浆,12 000 r/min、4 ℃离心20 min,取上清液过滤后即为肌浆蛋白溶液,重复上述步骤2次,沉淀按料液比1∶4加入磷酸缓冲液B(0.45 mol/L KCl,15.6 mmol/L Na2HPO4,3.5 mmol/L KH2PO4,pH=7.5),12 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min,取上清液过滤即为肌原纤维蛋白溶液。采用总蛋白(total protein,TP)测定试剂盒进行蛋白浓度的测定。

1.3.5.4 挥发性物质的测定

参照罗玉龙等[15]的方法,取5.0 g香肠绞碎,放于20 mL样品瓶,并加入100 μL的2-甲基-3-庚酮溶液(200 μg/mL)混合,在60 ℃条件下吸附45 min后取出,并插入GC进样口,在250 ℃条件下解吸附4 min。

GC-MS条件:VF-WAXms色谱柱,载气为He;载气流速1.0 mL/min,不分流进行。进样温度250 ℃,初始温度为40 ℃,保持1 min,以4 ℃/min升温到150 ℃,保持1 min,再以5 ℃/min升温到200 ℃,并以20 ℃/min升至230 ℃。保持5 min;离子源温度250 ℃;传输线温度250 ℃;质量扫描范围m/z 30～400;溶剂延迟1 min。

定性定量分析:通过与NIST11普库中的质谱对比,选取匹配度大于80的图谱进行分析,确定风味物质。采用内标法进行定量,内标物质为2-甲基-3-庚酮溶液。

1.3.5.5 酪胺含量的测定

参照GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》中规定的液相色谱方法测定酪胺的含量。

1.4 数据处理与统计分析

实验数据运用Excel 2021整理;采用IBM SPSS Statistics 20进行统计分析;Origin 2021作图。每个实验3组平行,结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 感官品质测定结果

2.1.1 感官评价结果

感官评价是食品品质评价的关键指标之一,本研究分别从色泽、质地、滋味、风味4个方面对不同组别的川味香肠进行评价。结果如表2所示,L57组、P25组和L57+P25组与CK组香肠在滋味方面无显著差异(P>0.05),都具有酸味适中,咸淡均匀的特性。色泽、质地和风味方面,L57组、P25组和L57+P25组得分均显著高于CK组(P<0.05),但单一接种组与复配接种差异不显著(P>0.05)。总分方面,L57+P25组为86.6±6.36,显著高于L57(81±5.55)、CK组(74.4±4.08)(P<0.05),这说明接种乳酸菌能够从产品的色泽、质地等方面产生比CK组更好的效果。

2.1.2 色差仪测定结果

颜色是发酵的一个重要属性,可以影响香肠的整体质量。表3给出了L57组、P25组、L57+P25组和CK组香肠的色泽变化,结果显示试验组的b*值无显著性变化(P>0.05),而L57+P25的L*值最高并显著高于P25、CK组(P<0.05),L57+P25的a*值显著高于CK、L57、P25组(P<0.05),说明协同发酵能促进生长明显改善香肠色泽,优于接种单一乳酸菌,这与杨小莹等[16]研究结果相同。

2.1.3 质构仪测定结果

各处理组香肠的质构结果如表4所示,CK组的硬度值最高,而L57+P25组香肠的硬度值最低,并显著低于P25、CK组(P<0.05)。BA等[17]也认为CK组有较高的硬度可能与发酵剂的蛋白质水解作用有关。而在恢复性和弹性方面,各组无显著性差异(P>0.05)。接种植物乳杆菌和戊糖片球菌香肠的黏性值低于CK组,L57+P25显著低于CK、P25组(P<0.05),可能是植物乳杆菌和戊糖片球菌协同提升了产酸能力,加速了pH值的降低,从而加速蛋白质的降解、破坏蛋白质组织纤维结构[18]。

2.2 微生物数量变化

不同处理组香肠乳酸菌总数变化如图1-a所示,添加的乳酸菌从发酵开始到发酵结束都与肉类基质相适应,乳酸菌生长速度快,成为优势菌群,导致乳酸菌数量显著高于CK组(P<0.05),这也说明乳酸菌可以通过酸化或抗菌剂的产生来抑制病原体和腐败细菌的生长[19]。发酵14 d后,各组乳酸菌生长趋势趋于平缓甚至有所下降,这可能是发酵底物的耗尽所致[20],这些结果与ELADAB报道结果相似[21]。第30天时,接种L57和P25香肠均与CK组香肠存在显著性差异(P<0.05),且L57+P25组香肠显著高于L57组和P25组(P<0.05)。

不同处理组香肠菌落总数如图1-b所示。加工0～6 d时,4组香肠的菌落总数都呈现上升趋势,14 d后,菌落总数开始下降,这可能是pH降低抑制了部分有害微生物的生长。第30天时,接种L57、P25和L57+P25香肠的菌落总数显著高于CK组香肠(P<0.05),但L57、P25和L57+P25之间差异不显著(P>0.05),吴双慧等[22]也得出类似结果。

2.3 理化指标测定结果

2.3.1 pH值和水分活度的变化

不同处理组香肠pH值随时间的变化结果如图2-a所示。pH值均呈现先下降后缓慢升高的趋势,pH值的下降可能与碳水化合物分解产生的有机酸积累有关,而回升可能是香肠中蛋白质的水解以及肽、氨基酸和胺等物质的产生对有机酸有一定的缓冲作用[23],这与WANG等[24]结果一致。第30天时L57+P25组的香肠pH值显著低于P25、CK组(P<0.05),说明相比单一接种戊糖片球菌,菌种复配能产生大量乳酸维持发酵香肠的pH值。

水分活度是发酵香肠生产中一个关键的工艺指标,不同处理组香肠水分活度变化结果如图2-b所示。加工0～14 d,L57组和L57+P25组香肠的水分活度下降速度明显快于CK组,可能是接种L57和P25的香肠酸度值下降,接近蛋白质的等电点,导致蛋白质结合水的能力下降[25]。香肠中微生物的快速生长和繁殖也会促进水分流失,从而降低香肠的水分活度。第30天,各组水分活度无明显差异(P>0.05),说明在相同温度、湿度条件下,单独接种和混合接种对香肠水分活度无影响,这与穆婷婷[26]研究结果一致。

2.3.2 TVB-N含量变化

TVB-N是肉制品被微生物污染或在细菌酶的作用下引起脱羧、脱氨反应,导致蛋白质分解产生氨、胺类等碱性含氮物,且与氨基酸的受破坏程度呈正相关[17]。TVB-N值越大,说明肉制品腐败程度越严重。由图3可知,4组发酵香肠的TVB-N值在0～14 d呈现上升趋势,LEE等[27]认为TVB-N值的增加可能是微生物和氨基酸自解脱胺的共同作用,14 d时P25组的TVB-N值显著低于CK组、L57组(P<0.05)。第30天时,L57组、P25组和L57+P25组香肠的TVB-N值差异不显著(P>0.05),但都显著低于CK组(P<0.05),说明添加乳酸菌,能通过降低pH从而抑制杂菌的生长,阻止挥发性含氮化合物的生成,能明显保证川味香肠的品质,这与杨乐研究结果一致[28]。

2.3.3 肌浆蛋白和肌原纤维蛋白降解变化

川味香肠加工过程中CK、L57+P25组肌浆蛋白变化如图4-a、图4-b所示,分子质量大小在180 kDa左右的蛋白条带在原料肉中存在明显,随着发酵进行逐渐变浅,95、70 kDa以下的蛋白条带随着发酵进行颜色逐渐变浅,大分子肌浆蛋白条带逐渐分解为小分子条带,L57+P25组的香肠分子质量大小蛋白条带变浅速度明显慢于CK组,例如95 kDa条带在22 d时变浅,直至30 d时逐渐消失,25、10 kDa左右发酵2、6、14 d时有明显条带,22 d后才明显变浅,这表明复配接种能够延缓香肠中肌浆蛋白的降解时间。肌原纤维蛋白变化如图4-c、图4-d所示,随着加工进行,蛋白片段发生了不同的变化,180、130 kDa蛋白条带随着加工进行逐渐变浅甚至消失,95 kDa以下的蛋白条带发酵初期颜色变浅,至6、14 d时条带颜色加深。与CK组相比,L57+P25组的蛋白条带变浅速度较缓慢,低于25 kDa分子质量的蛋白条带有少量增加,说明接种植物乳杆菌和戊糖片球菌能抑制川味香肠肌原纤维蛋白的降解。

2.3.4 挥发性物质测定结果

各个处理组香肠分别检出18、18、19和26种挥发性化合物,主要为醛类、醇类、酯类、酮类、烷烃类、烯烃类和其他化合物。相较于CK组,接种植物乳杆菌和戊糖片球菌的香肠增加了挥发性物质的种类和含量,各组挥发性化合物的组成和含量如表5所示。

醛类物质是脂质氧化形成的典型产物,对香肠风味影响较大,不仅可以影响香肠的整体风味,还可以作为合成香肠中其他芳香族化合物的前体物质。己醛、2-庚烯醛、苯甲醛、2,4-葵二烯醛和壬醛等为香肠中主要检出的醛类物质,其中含量最高的是己醛,具有清香青草味,通常是所有肉类制品中含量最丰富的脂质氧化产物,已作为脂质氧化的指标[29]。而接种L57+P25的己醛含量[(0.53±0.01) μg/kg]最低且显著低于CK、L57和P25组(P<0.05),说明菌种复配抑制了脂质氧化,且优于单一乳酸菌接种。壬醛赋予康乃馨、柑橘和月桂的气味,由油酸氧化产生,2-庚烯醛具有烧烤及黄油味[30]。醇类化合物主要作为脂质氧化反应产物生成,对香肠独特风味的形成起着至关重要的作用,常见的醇类物质种类在接种L57+P25的香肠中均有提高,这可能归因于乳酸菌参与的碳水化合物发酵和脂质氧化。酯类物质由酸类和醇类物质酯化反应生成,对香肠风味具有较大的贡献,丁酸乙酯、正己酸乙酯在4组中均有检出,其中接种L57+P25的香肠中酯类物质种类要多余于其他3组,这表明复配发酵促进了香肠中风味物质的形成。酮类物质通常通过美拉德反应生成,也能通过脂肪的氧化分解生成[31],能够促进奶香味生成。

2.3.5 酪胺含量的变化

发酵香肠中高含量的酪胺是某些细菌对游离酪氨酸的脱羧酶活性产生的[32]。由于其毒理学效应,它构成了潜在的公共卫生问题。不同处理组香肠的酪胺含量测定结果如图5所示,发酵初期接种L57、P25和L57+P25和CK组中的酪胺含量为0,而在第6天时,4组的酪胺含量分别为(15.34±3.11)、(5.95±0.96)、(3.12±0.52)和(8.27±0.38) mg/kg。14 d时,L57、L57+P25组的酪胺含量低于CK、P25组(P<0.05),可能是乳酸菌通过抑制脱羧和蛋白水解微生物的生长和活性来影响酪胺的形成。30 d时,L57+P25组为(30.06±2.3) mg/kg,显著低于P25组[(37.09±1.09) mg/kg]、CK组[(56.57±3.37) mg/kg](P<0.05),说明复配发酵能显著抑制酪胺的产生[33],并且优于单一接种戊糖片球菌的香肠。

3 结论

将植物乳杆菌L57和戊糖片球菌P25以单一和复配方式接入川味香肠后,以不接种乳酸菌作为对照组,通过对感官评价、微生物数量、理化指标、挥发性物质及酪胺含量进行分析,得到以下结果,接种植物乳杆菌和戊糖片球菌香肠的色泽、质构特性都优于CK组,增加了香肠中乳酸菌的数量,能够抑制香肠中杂菌的生长,并减少了挥发性氮类化合物的生成,保证川味香肠的品质。其中,复配发酵能够使川味香肠有较低的pH、硬度、咀嚼性及黏性值,且具有较高的感官评价,相较于CK组和单一接种组有较多酯类物质的产生,并对川味香肠中的酪胺有明显的降解作用,第30天时L57+P25组降低了46.86%的酪胺含量,显著低于P25组(P<0.05),说明复配发酵可改善川味香肠的食用品质,提高川味香肠的稳定性和安全性,之后的工作可探究乳酸菌协同生长的机理,并对川味香肠中酪胺形成及控制机理进行深入研究。

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Effects of combined fermentation with lactic acid bacteria on quality and tyramine content of Sichuan sausage

ZHANG Yue, YANG Xinyue, HUANG Li, MA Shuaiyu, XU Chang, YANG Lamei, PEI Huijie, HE Wei, YANG Yong*

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

ABSTRACT To explore the effect of lactic acid bacteria combination fermentation on the quality characteristics of Sichuan sausage processing, this study produced Sichuan sausage by single and compound fermentation (L57∶P25=1∶2, live bacteria ratio) of Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceus P25, which were screened from Sichuan sausage earlier.The sensory quality, microbial quantity, and physicochemical index of sausage were analyzed.Results showed that after inoculation with L57+P25, the sensory scores of Sichuan sausage were improved, the color and texture characteristics of sausage were improved, the pH value and water activity of sausage were decreased rapidly, the production of volatile nitrogen compounds was inhibited, and the degradation of protein was delayed.Compared with the CK group, the types of volatile substances in sausages inoculated with L57+P25 increased to 26, and the proportion of ester substances was 30.77%.The content of tyramine on the 14th day of processing was the lowest compared with the other three groups, and the content of tyramine on the 30th day was 30.06 mg/kg, which was significantly lower than that in the P25 and CK groups (P<0.05).The tyramine content was reduced by 46.86%.Results showed that the combined fermentation of lactic acid bacteria could improve the edible quality of Sichuan sausage and inhibit the formation of tyramine in Sichuan sausage.

Key words Lactobacillus plantarum;Pediococcus pentosaceus;Sichuan sausage;tyramine

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038938

引用格式：张月,杨新玥,黄莉,等.乳酸菌复配发酵对川味香肠品质及酪胺含量的影响[J].食品与发酵工业,2025,51(6):83-90.ZHANG Yue, YANG Xinyue, HUANG Li, et al.Effects of combined fermentation with lactic acid bacteria on quality and tyramine content of Sichuan sausage[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(6):83-90.

第一作者：硕士研究生(杨勇教授为通信作者,E-mail:yangyong676@163.com)

基金项目：国家自然科学基金项目(32272435)

收稿日期：2024-02-22,改回日期:2024-04-12