葡萄酒品质的优劣最直观的表现为葡萄酒的色泽,在葡萄酒感官品评时作为第一指标[1-3],专业品酒师可以通过酒体颜色得知葡萄酒的酿造品种、制作工艺、陈酿时间和酒体状态等重要的相关信息[4-5]。新鲜葡萄酒色泽通常会呈现出明亮的紫红色,随着陈酿进行葡萄酒的颜色会逐渐黄化,明度降低,酒体色泽转变为宝石红,在储存条件不当的情况下酒体黄化程度更为严重,直接影响着消费者对葡萄酒的选择[6]。
有机酸是影响葡萄酒协调性和稳定性的重要化合物,作为葡萄酒重要风味物质,其对葡萄酒的理化特性、色泽稳定性具有重要影响,从而影响葡萄酒质量[7-8]。有研究发现在对葡萄酒进行除梗破碎后选择添加复合多种有机酸进行酸化,可以有效补偿葡萄酒中的酸度缺乏,可以改善葡萄酒的酒体颜色,进而有效提高葡萄酒陈酿期间酒体颜色的稳定性[9-10]。
新疆地理位置优越,所生长的酿酒葡萄具有良好的生长条件,在这种环境下酿造的葡萄酒具有明显的地域特色,发展潜力巨大[11]。然而,与其他地区相比,新疆地区因特殊气候,所酿造出来的葡萄酒存在糖高酸低、褪色速度快、同质化严重、平衡性差等问题[12]。目前,化学酸化仍然是国际葡萄与葡萄酒组织(International Organisation of Vine and Wine,OIV)成员国最常用的酸化方法,其中包括在葡萄酒中添加乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸[7,13]。因此,本研究拟在发酵前添加不同比例的酒石酸,苹果酸,乳酸为复合酸,通过检测基础理化、CIELab等多种指标,以及反向高效液相色谱法等方法进行分析,为复合酸添加工艺改善葡萄酒色泽稳定性提供一定的理论依据。
原料采自于新疆天山北麓产区五家渠产地资源圃(2022年9月28日)赤霞珠葡萄果实;商业酿酒酵母FX 10,法国拉氟德公司;酒石酸、L-苹果酸、草酸、柠檬酸(均为分析纯),上海源叶生物科技有限公司;乙腈(色谱纯),美国Sigma公司;KH2PO4、磷酸(均为分析纯),天津市致远有限公司。
LC-20AB高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器、SIL-20A手动进样器,日本岛津公司;UPHW-III-90-T优普系列超纯水机,四川优普超纯科技公司;TGL-16G高速离心机,上海安亭科技科学仪器厂;Foss全自动分析仪,丹麦福斯公司;FE28 Five Easy Plus pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司。
色谱条件参考吕旭聪等[14]的方法进行,所用色谱柱为Diamonsil ODS(4.6 mm i.d.×250 mm,5 μm);采用等度洗脱,流动相为乙腈-0.02 mol/L KH2PO4水溶液(用磷酸调pH 2.34),流动相经溶剂过滤器过滤,滤膜0.22 μm水相滤膜;流速1 mL/min。检测波长210 nm;柱温30 ℃,进样量10 μL。冲洗方式为等度洗脱15 min。
1.4.1 复合酸添加工艺酒精发酵工艺流程与操作要点
工艺流程:葡萄分拣→除梗破碎→添加不同比例的有机酸和果胶酶→添加酿酒酵母FX 10→酒精发酵→皮渣分离、压榨→苹果酸-乳酸发酵→清除酒泥→陈酿
操作要点:除梗破碎,添加偏重亚硫酸钾80 g/L,0.5 h后进行操作;添加200 mg/L果胶酶,冷浸渍24 h;添加200 mg/L酿酒酵母FX 10。
1.4.2 复合酸添加比例
如表1所示。
表1 不同有机酸复配比例
Table 1 Different proportions of organic acid complexes
处理组有机酸复配比(g∶L)添加量/(g/L)L1酒石酸∶苹果酸1∶11L2酒石酸∶苹果酸1∶12L3酒石酸∶苹果酸2∶11L4酒石酸∶苹果酸2∶12S1酒石酸∶苹果酸∶乳酸1∶1∶11S2酒石酸∶苹果酸∶乳酸1∶1∶12S3酒石酸∶苹果酸∶乳酸2∶1∶11S4酒石酸∶苹果酸∶乳酸2∶1∶12
所有实验处理均设3个重复,在酒精发酵结束及结束后半年分别进行取样,通过比较基础理化指标、色泽指标、有机酸含量来确定复合酸添加的最佳比例。
1.4.3 基础理化指标测定
取离心后的澄清液20 mL于试管中,采用Foss机器进行实验分析,重复3次。
1.4.4 葡萄酒色泽指标检测
参考张文昊等[15]使用CIELab方法,样品用0.45 μm水系过滤膜后,选择规格为2 mm玻璃比色皿,检测仪器使用紫外-分光光度计,波长设置为440、530、600 nm,记录样品的透光率,对照组使用蒸馏水处理,由此建立CIE颜色坐标系,计算各样品中的和Hab值,各需3组技术平行数据。
1.4.5 有机酸的测定
使用反向高效液相色谱法,参照吕旭聪等[14]实验方法,将紫外光波长设定在210 nm处,将6种有机酸进行分离,取10 mL样品,10 000 r/min离心2次,待测液由0.45 μm孔径的滤膜过滤后得到,然后进行定性定量分析。
定性分析:在相同的色谱条件下,对照6种有机酸标准品HPLC色谱图出峰时间,对样品中各有机酸进行定性分析。
定量分析:通过HPLC色谱检测葡萄酒样品中各有机酸的峰面积,根据6种有机酸标准回归方程,计算葡萄酒样品中各有机酸的含量。
使用Microsoft Excel 2021和SPSS 26.0软件进行数据处理与分析;使用Origin 2021进行图表制作;采用MetaboAnalyst进行热图的绘制(https://www.metaboanalyst.ca/)。
葡萄汁和葡萄酒中有机酸的含量取决于葡萄品种、成熟度、成熟期的气候条件、葡萄加工方法、酒精发酵和葡萄酒储存条件[16]。在酿造红葡萄酒时,在发酵前添加复合酸可以改善酒的颜色,并延长其陈酿储存期。复合酸的添加可以通过调整有机酸比例分布、降低pH值等多种综合作用来减缓颜色的演变进程,并发挥其在葡萄酒中的抗氧化作用。
对葡萄酒样品的基础理化进行分析,陈酿6个月后的酒样理化指标均符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》规定。由表2可知,在酒精发酵结束后,与对照组相比,所有处理组的总酸浓度得到了提高,其中L2的总酸含量尤为突出,达到了(9.05±0.35) g/L。陈酿6个月之后,只有L1组的总酸含量低于对照组,其余处理组均高于对照组,其中S4与L2的总酸含量较高。
表2 添加不同比例有机酸对基础理化的影响
Table 2 Effects of adding different proportions of organic acids on basic physical and chemical properties
发酵时期处理酒精度/%Vol还原糖/(g/L)总酸/(g/L)挥发酸/(g/L)pH酒精发酵结束后CK15.04±0.49a3.10±0.75a7.75±0.78c0.36±0.03a3.82±0.15aL114.88±0.13a3.10±0.54a8.35±0.21bc0.34±0.04a3.57±0.21aL215.09±0.31a2.90±0.40a9.05±0.35a0.38±0.05a3.53±0.13aL315.10±0.18a3.25±0.05a8.25±0.07bc0.34±0.01a3.72±0.07aL415.29±0.31a3.35±0.10a8.70±0.28ab0.34±0.01a3.52±0.22aS115.34±0.44a3.00±0.65a8.20±0.14bc0.36±0.01a3.72±0.06aS214.87±0.21a3.15±0.29a8.75±0.07ab0.34±0.01a3.56±0.25aS315.44±0.66a3.40±0.09a8.20±0.00bc0.36±0.01a3.78±0.11aS415.21±0.75a3.45±0.35a8.80±0.14ab0.40±0.03a3.73±0.14a陈酿6个月CK15.19±0.03a2.20±0.21a7.40±0.71ab0.44±0.01ab3.86±0.15aL115.29±0.24a2.85±0.14a7.20±0.71b0.44±0.01ab3.82±0.02aL215.24±0.43a2.70±0.21a8.20±0.56ab0.45±0.01a3.74±0.08aL315.10±0.01a2.65±0.07a7.70±0.14ab0.43±0.01ab3.80±0.06aL415.22±0.30a2.90±0.07a7.85±0.07ab0.44±0.01ab3.73±0.03aS115.48±0.35a2.30±0.42a7.60±0.14ab0.43±0.00ab3.90±0.07aS214.58±0.11a2.90±0.07a7.90±0.28ab0.39±0.03b3.76±0.07aS315.43±0.11a3.00±0.21a7.85±0.35ab0.48±0.04a3.84±0.09aS415.61±0.59a2.75±0.01a8.30±0.14ab0.45±0.04a3.81±0.03a
注:同列不同角标字母表示显著差异(P<0.05)。
国际照明委员会提出的CIELab体系是一种用于测量与人类视觉感知相同级别的模型,该模型目前被广泛用于葡萄酒行业等不同领域[17-18]。这种模型利用3个参数L*(明度)、a*(红/绿色度值)和b*(蓝/黄色度值)在空间直角坐标系中定义每种颜色。
2.2.1 明度L*
明度L*反映了物质的亮度,数值越大颜色越亮,反之越暗。根据图1的结果显示,添加复合酸并没有明显提高葡萄酒的亮度。但是在陈酿6个月后,经过L1处理的葡萄酒明度明显高于对照组,并且亮度有所增加。另外,经过S1和S3处理的组别相比对照组的明度降低程度较低。
图1 贮存期间葡萄酒色泽的变化
Fig.1 Changes in wine color during storage
注:同一测定时间内,柱形图上不同字母表示处理间有显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.2.2 红/绿色度值a*
一般来说,a*数值越大,葡萄酒的颜色越鲜艳,外观品质越好。根据图1结果显示,在酒精发酵前添加有机酸,处理组的a*值均超过对照组。陈酿6个月后,只有经过L1处理的组比对照组的a*值低,其他处理组的a*值均高于对照组。这表明复合酸的添加有助于提升葡萄酒红色色调的显示。
2.2.3 蓝/黄色度值b*
当b*>0时说明酒体呈现黄色,数值越大黄色越明显。根据图1结果显示,在酒精发酵前,只有经过L1处理和L3处理的组的黄色度低于对照组,其余处理组均高于对照组。但是在陈酿6个月后,所有处理组的黄色度都低于对照组,且L1、L3、S1这3组在6个月前与对照组相比b*值有所降低,其中L3的降低幅度最大,其他处理组则有所升高。总体来说,陈酿6个月后的b*值都比对照组低。这表明复合酸的添加有助于抑制葡萄酒的黄色色调的显示。
2.2.4 颜色饱和度
对于反应物质的颜色饱和度来说,
越大表示颜色越鲜艳,反之颜色越暗淡。从图1可以看出,在酒精发酵结束时,所有处理组的颜色饱和度都高于对照组。经过6个月的陈酿后,只有L1处理组的
低于对照组。
2.2.5 颜色色调角Hab
对于Hab反应物质的颜色色调角来说,Hab越小表示颜色越接近红色。由图1可知,在酒精发酵之前,只有L1、L2、L3、L4、S1处理组的色调角与对照组有显著差异。经过6个月的陈酿后,所有处理组的色调角都小于对照组,其中L1、L3、S1、S4处理组的色调角有所增加,而L4处理组没有变化,其他处理组的色调角均减小。
综上所述,除了L1处理组外,添加复合酸处理的葡萄酒在各项指标上都优于对照组,延缓了酒样颜色从红色到黄色的转变。这进一步说明复合酸的添加可以提升色泽的稳定性,这与张扬等[18]的研究结果是一致的。
为了更直观地观察不同复合酸添加对葡萄酒色泽的影响,本研究采用主成分分析对经过6个月陈酿的葡萄酒样品组进行了分析。图2展示了色泽主成分分析结果,其中主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分别解释了总方差的84.5%和14.6%,2个主成分合计解释了99.1%的初始数据总方差。这些主成分能够全面反映不同复合酸添加量引起的葡萄酒色泽变化情况,并且基本上可以将不同有机酸处理区分开来。
图2 CIELab指标主成分分析
Fig.2 Principal component analysis of CIELab indicators
注:不同颜色代表不同比例复合酸添加酒样。
从图2中可以观察到,不同处理方式导致的影响各不相同。L*、Hab和b*位于X轴的正半轴,而和a*位于X轴的负半轴。酒样CK、S1和L3位于图中的第一象限,酒样S2和S4位于图中的第二象限,酒样L2、S3和L4位于图中的第三象限,而酒样L1位于图中的第四象限。
2.4.1 酒石酸
酒石酸是葡萄酒和葡萄汁中含量最丰富的有机酸,在维持葡萄酒的化学稳定性(包括颜色和味道)方面发挥着重要作用[19]。由图3可知,在酒精发酵结束时,未添加乳酸的处理组(L1、L2、L3、L4)葡萄酒中酒石酸浓度高于对照组,而添加了乳酸的处理组(S1、S2、S3、S4)葡萄酒中酒石酸浓度低于对照组。经过6个月的陈酿后,处理组和对照组的酒石酸浓度没有显著差异,并且总体呈下降趋势,但添加了乳酸的处理组的酒石酸降低幅度比未添加乳酸的处理组和对照组要小,说明添加乳酸可以影响陈酿过程中葡萄酒中酒石酸含量水平。
a-草酸;b-酒石酸;c-苹果酸;d-乳酸;e-柠檬酸;f-琥珀酸
图3 贮藏期间不同有机酸含量差异分析
Fig.3 Analysis of differences in organic acid content during storage
2.4.2 苹果酸
苹果酸作为一种有机酸,对葡萄酒的口感有着重要的影响[9]。由图3可知,在酒精发酵结束时,与对照组相比,处理组的苹果酸含量(L2、L3、L4)比对照组高,而处理组的苹果酸含量(S3、S4)则低于对照组,这两者之间都有显著性差异(P<0.05)。在经过6个月的陈酿后,处理组和对照组之间没有显著性差异。
2.4.3 乳酸
乳酸是提高果汁中有机酸水平的主要因素[20]。由图3可知,在酒精发酵结束时,添加乳酸的对照组的乳酸浓度明显高于对照组和未添加乳酸的处理组。经过陈酿6个月后,只有L1和L2处理组的乳酸浓度低于对照组,其他处理组的乳酸浓度都高于对照组。值得注意的是,尽管L1、L2、L3和L4处理组都没有添加乳酸,但经过6个月陈酿后,L3和L4处理组的乳酸含量与添加乳酸的处理组接近。这可能是因为酒石酸添加比例增加可以促进微生物的生长,从而促进苹果酸转化为乳酸[21]。
为了能够直观反映陈酿6个月葡萄酒中各有机酸含量与颜色指标的相关性,对其进行了相关性热图分析,结果如图4所示,图中颜色深浅代表相关程度,颜色越深表明相关性越强。陈酿6个月葡萄酒中酒石酸、苹果酸、挥发酸、总酸含量等均与颜色饱和度呈负相关,而与色调角呈正相关;乳酸含量与颜色饱和度呈正相关,与色调角呈负相关。以上结果表明,葡萄酒中酒石酸、苹果酸、乳酸的含量影响着颜色饱和度和色调角,葡萄酒中酒石酸和苹果酸主要来自于葡萄果实,而乳酸主要来源于发酵产生,因此,通过外源添加乳酸增加葡萄酒中乳酸的含量,可以增加颜色饱和度,降低色度角,进一步改善陈酿葡萄酒颜色黄化问题,提高色泽稳定性。
图4 有机酸含量与颜色指标之间Pearson’s相关系数
Fig.4 Pearson’s correlation coefficient between organic acid content and color indicators
通过在葡萄酒发酵前添加不同种类、比例的有机酸发现,酒精发酵结束及陈酿6个月葡萄酒酒体色度指标有明显差异,其中酒石酸∶苹果酸∶乳酸复配比2∶1∶1(添加量1 g/L)的葡萄酒酒体明度L*变化差异小,红/绿色度值a*较高,蓝/黄色度值b*升高缓慢,显著低于对照组,颜色饱和度较高,色调角Hab较小。此外添加不同比例有机酸也会影响葡萄酒中有机酸的比例和分布,以此协同作用来改善干红葡萄酒的颜色和色泽稳定性,这将为新疆产区干红葡萄酒的调酸处理提供了新思路。
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