起泡葡萄酒陈酿过程中酚类化合物和起泡特性的变化及其关联分析

依据国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》中CO2含量的不同,将葡萄酒分为平静葡萄酒(still wine)和起泡葡萄酒(sparkling wine)。在20 ℃时,750 mL容量的酒中的CO2压力<0.05 MPa的葡萄酒为平静葡萄酒,相反≥0.05 MPa的葡萄酒为起泡葡萄酒[1]。

2022年起泡葡萄酒占全球成交量的11%,但占全球贸易额的23%,成为仅次于瓶装葡萄酒的第二大类别[2]。我国关于起泡葡萄酒领域的文献较少,且文献中陈酿时间过短,大多数内容仍仅限于叙述国际标准和介绍工艺,缺乏深入探讨和创新性研究。李华[1]主要讨论了起泡葡萄酒的国际定义、标准及生产的相关规定。马腾臻等[3]研究发现,发酵前6 ℃浸渍24 h后放汁‘黑比诺’桃红起泡葡萄酒酿造出的品质更佳。俞然等[4]尝试将玫瑰香与霞多丽葡萄按不同比例调配得到了优势互补的起泡葡萄酒基酒。过去20年中,白和桃红葡萄酒合计占消费量一半以上,这主要是由美国、德国和英国的起泡酒市场推动的,而这种结构的转变,主要归因于消费者偏好的整体变化[5]。我国的起泡葡萄酒产业处于起步阶段,人们对于具有改进的感官特征和独特风味复杂性的高品质起泡葡萄酒的需求不断增加。

颜色是第一感官印象,引导消费者对葡萄酒的香气、味道和风格的期望,颜色纯正、亮丽、稳定的葡萄酒通常更受消费者青睐。二次发酵产生的CO2以气泡的形式从液体中释放出来,并通过自由空气/液体界面扩散,形成气泡[6];液体薄膜使得气泡之间相互连接形成泡沫。酚类化合物在葡萄酒酿造过程中,通过浸渍作用转移到葡萄酒中,并在陈酿过程中相互作用从而影响葡萄酒的颜色和起泡特性等感官特性[7-8]。关于酚类化合物与起泡特性的关联分析的相关文献鲜见报道,而起泡特性在起泡葡萄酒的生产中至关重要。

因此,本研究以宁夏贺兰山东麓产区所酿造的调配比例不同的白起泡葡萄酒和桃红起泡葡萄酒为研究对象,进行18个月的陈酿,分析在陈酿过程中酚类化合物、颜色参数和起泡特性的变化,并进行感官特性分析。结合相关性分析进一步探究酚类化合物对感官品质的影响,以期促进工艺技术的创新和改进,并提升酿酒业的质量和竞争力,全力满足消费市场需求。

1 材料与方法

1.1 化学品和试剂

除另有说明,所有试剂均为色谱纯级。16种单体酚混标(包括没食子酸、儿茶素、阿魏酸、芦丁、根皮苷、咖啡酸、槲皮素、丁香酸、金丝桃苷、水杨酸、异鼠李素、绿原酸、山柰酚、对香豆酸、龙胆酸和表儿茶素),美国Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲酸,美国Sigma-Aldrich公司;乙酸乙酯,四川西陇科学有限公司;福林酚试剂(分析纯级),北京索莱宝有限公司。

1.2 仪器与设备

QTRAP 5500型高效液相色谱-质谱仪,配有二极管阵列检测器和三重四极杆质谱检测器,美国AB SCIEX公司;InertSustainTM AQ-C18反相色谱柱(150 mm×4.6 mm×5 μm),日本Shimadzu公司;XW-80A型漩涡混合,上海精科实业公司;Startorius BT25S型十万分之一天平,德国Sartorius仪器公司;5810R型高速冷冻离心机,德国Eppendorf股份公司;FOAMSCANTM泡沫分析仪,法国Teclis仪器公司;Milli-Q BiocelTM超纯水仪,美国Millipore公司;UV-1750型紫外可见分光光度计,日本Shimadzu公司;RE-52C型旋转蒸发器,上海霄汉实业发展有限公司;MD200-2型氮吹仪,杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 实验材料及其酿造工艺

参照SUN等[9]方法,精心挑选宁夏贺兰山东麓产区的霞多丽与黑比诺葡萄,在酩悦轩尼诗夏桐酒庄酿造葡萄酒。采用传统法酿造基酒,瓶内二次发酵结束后,进行750 mL瓶内带酒泥陈酿(15～18 ℃)。带酒泥陈酿结束后,定期转瓶使得酒泥移至瓶口。将瓶颈部分浸入12～24 ℃的丙二醇溶液中,通过冰封瓶颈处的酒泥。然后将酒瓶向上放置,打开瓶塞,酒泥在瓶内CO2的压力下自动喷出。每款起泡葡萄酒分别在陈酿3、6、8、10、12、14、16、18个月时取3瓶酒样经0.45 um水系膜真空过滤脱气,18 ℃回火24 h后用于后续的指标测定。按照国家标准GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒分析方法》中的理化实验方法,测定总酸(以酒石酸计,g/L)、挥发酸(以乙酸计,g/L)、pH值、游离SO2浓度,所有指标重复检测3次。二次发酵前白起泡葡萄酒的pH值为3.27,总酸度为7.80 g/L,挥发性酸度为0.29 g/L,还原糖为1.9 g/L,酒精浓度为11.71 φ/%,游离SO2质量浓度为12.2 mg/L。而桃红起泡葡萄酒的pH值为3.25,总酸度为7.70 g/L,挥发性酸度为0.36 g/L,还原糖含量为3.7 g/L,酒精浓度为11.60 φ/%,游离SO2质量浓度为12.7 mg/L。具体酿造工艺如下:

白起泡葡萄酒:葡萄原料(霞多丽和黑比诺)→果实分选→直接破碎压榨(霞多丽)/除皮破碎压榨(黑比诺)→压榨取汁→酒精发酵→调配[m(霞多丽)∶m(黑比诺)≈7∶3]→瓶内二次发酵→陈酿→转瓶→吐酒泥

桃红起泡葡萄酒:葡萄原料(霞多丽和黑比诺)→果实分选→直接破碎压榨→酒精发酵→调配[m(霞多丽)∶m(黑比诺)≈6∶4]→瓶内二次发酵→陈酿→转瓶→吐酒泥

1.4 实验方法

1.4.1 单体酚的测定

参照吴晓芹[10]方法并进行适当修改,采用高效液相色谱-质谱法(high-performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)测定单体酚。

样品制备:取10 mL的酒样加入离心管中,分3次加入乙酸乙酯进行萃取,每次10 mL,然后漩涡振荡30 s,混匀后,进行离心(3 500 r/min,4 ℃,4 min),取上层有机层。合并3次萃取的有机层,使用旋转蒸发仪减压蒸馏至干(35 ℃)后用2 mL色谱级甲醇溶解残渣,取出该溶液进行过滤,将滤液存贮在-20 ℃冰箱待测。

流速0.7 mL/min;柱温25 ℃;流动相:A相为0.1%甲酸水溶液,B相为乙腈;梯度洗脱;进样量5 μL。梯度洗脱程序:0～1 min,B相25%～35%;1～6 min,B相为35%～95%;6～8.9 min,B相为95%;8.9～9 min,B相为95%～25%。

质谱条件:电喷雾电离源(ESI),负离子模式,离子化电压-4.5 kV,离子源TurbolonSpray探针的加热器气体温度为600 ℃,喷雾气(GS1)和辅助加热气(GS2)分别为60 psi和65 psi,气帘气为35 psi。采用多反应监测(multi reaction monitoring, MRM)扫描方法对单体酚进行碎裂和扫描,所有指标重复检测3次。每种单体酚的具体质谱参数见表1。

最后通过比较单个酚类化合物的保留时间与相应标准品和基质匹配曲线来进行单个酚类化合物的鉴定和定量。以单体酚的质量浓度为横坐标(x),单体酚定量离子对应峰面积为纵坐标(y),校准曲线方程如表2所示,P<0.05(表示数据有显著性差异)。

1.4.2 总酚的测定

参照王华[11]方法,采用福林-肖卡法测定,测量765 nm波长处吸光度值,结果以没食子酸等价值表示(mg/g)。指标重复检测3次,以没食子酸质量浓度为横坐标(x),吸光度值为纵坐标(y),得到标准曲线回归方程y=0.005 71x+0.056 62,R2=0.999 04,线性质量浓度范围是0.05～500 mg/L,P<0.05(表示数据有显著性差异)。

1.4.3 颜色参数的测定

参照李运奎等[12]和强文乐等[13]方法,采用CIElab方法。酒样经0.45 μm水系膜过滤后置于1 mm光径石英比色皿中,以纯水作为参比,在400～780 nm UV-Visible谱段连续扫描,扫描间隔1 nm,计算选用CIE1964做标准,根据光谱值找出450、520、570、630 nm波长处的4个吸光度,依据公式建立CIE颜色坐标系,继而得到L*(亮度)、a*(红绿色调)、b*(黄蓝色调)

(饱和度)、hab(色调角)和ΔE(色差)等参数值。所有指标重复检测3次。

1.4.4 起泡参数的测定

参照SUN等[9]方法,通过使用FOAMSCANTM泡沫分析仪来测定相关起泡参数。在1 bar的恒压下,气体流速保持在120 mL/min,持续2 min。随后停止注气。通过评估60 mL脱气葡萄酒在玻璃柱内通过玻璃过滤器注入空气后高度的增加来量化起泡参数。该评估产生了3种起泡参数,包括通过玻璃熔块注气后泡沫达到的最大高度(maximum height, HM,mm),代表葡萄酒形成泡沫的能力;注气过程中的泡沫稳定高度(stability height, HS,mm),代表葡萄酒产生稳定泡沫并作为泡沫环持续存在的能力;泡沫稳定时间(stability time, TS,s),表示中断注气后泡沫塌陷至消失所需的时间,与泡沫的持久性有关[14]。所有指标重复检测3次。

参照SUN等[9]方法并进行适当修改,对感官剖面进行了细致的分析。起泡葡萄酒感官评估专家小组由8名男性和7名女性组成,均为西北农林科技大学葡萄酒学院攻读硕士学位的研究生,接受了专门的感官训练。小组成员的任务是以嗅觉和视觉角度来评估起泡葡萄酒:花香、热带水果香、温带水果香、浆果香、烘焙香、黄油/奶油香、草本/植物香、蜂蜜香和起泡能力。小组成员使用非结构化的10 cm线量表,随后使用Excel电子表格将其转换为5分量表(1-非常弱,2-弱,3-中等,4-强烈和5-非常强烈),并且使用文字描述视觉属性(起泡程度、澄清度、颜色强度),具体见表3。使用相同的香槟杯进行视觉感官分析,以尽量减少由于最小的玻璃缺陷而产生的潜在差异。每次评估都使用在8～ 12 ℃的温度下提供的30 mL起泡葡萄酒。在样品之间有足够的休息时间来恢复味觉。为了保持标准化和尽量减少疲劳,要求小组成员在口中旋转葡萄酒并保持15 s,然后吐出。在样品之间,要求小组成员用水漱口,吃一块无盐饼干,再次漱口,等待3 min。每个样品进行3次检测和分析。处理的数据代表了检测强度和频率(“修正频率”,modification frequency, MF)的组合,使用公式(1)计算:

式中:F,芳香属性的检测频率,%;I,平均强度,%。

1.5 统计分析

使用R语言(4.3.0版)中的“ggplot”软件包进行Pearson相关分析;使用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(ANOVA),利用Tukey事后检验比较评定样品间的差异性,使用Excel 2019进行差异显著性分析并绘制图表,结果表示为“平均值±标准差”(n=3),P<0.05表示数据有显著性差异,0.01<P<0.05表示数据有比较显著性差异,P<0.01表示数据有极其显著性差异。

2 结果与分析

2.1 酚类化合物分析

酚类化合物通常通过莽草酸途径进行生物合成,使用碳水化合物代谢的中间体从中产生酚类化合物[15]。表4、表5显示了陈酿过程中两款起泡葡萄酒酚类化合物含量的变化。

由于酵母壁细胞释放的多酚和其他物质的吸附或水解,酒泥陈酿影响酚浓度。一般情况下,酒泥陈酿对多酚浓度有正向影响,尤其是水杨酸、异鼠李素和山柰酚浓度,这些浓度随陈酿时间的延长而增加。研究中,水杨酸浓度最大(白与桃红起泡葡萄酒中分别占62%～66%和34%～37%),它也是最主要和最丰富的羟基苯甲酸。观察到的酚类化合物浓度的变化可能与酿造过程中发生的几种反应有关,例如氧化、聚合和共色素沉着反应[16]。

黄酮醇是以糖苷、半乳糖苷和葡萄糖醛酸的形式存在,主要存在于果皮中,是植物组织为减少过度紫外线照射而产生的次生代谢产物。因此,芦丁、槲皮素、异鼠李素和山柰酚等在白起泡葡萄酒中含量微乎其微。此外,观察到在陈酿期间,桃红起泡葡萄酒陈酿18个月时槲皮素浓度达到峰值,可能是由于陈酿过程中槲皮素糖苷的水解或与细胞壁基质结合的槲皮素的释放[17]。注意到芦丁含量随着陈酿时间的延长其质量浓度整体呈现降低趋势(尤其是陈酿6个月时,白与桃红起泡葡萄酒分别从1.24降至0.71 mg/L 和1.73降至1.10 mg/L),可能是由于酚类化合物含量过多,形成较大聚合物而发生沉淀所致。咖啡酸和阿魏酸以反式异构体的形式存在,源自葡萄的果肉,在葡萄压榨过程中迅速释放到酒中[15]。阿魏酸与根皮苷含量低且波动小。咖啡酸在陈酿6个月时含量显著下降,后期含量也处于不断波动状态。没食子酸是羟基苯甲酸的代表,而本研究中没食子酸含量无统计学差异。在葡萄酒陈酿过程中,随着黄烷醇类物质的聚合反应和变化,葡萄酒会逐渐变得圆润、饱满,改变葡萄酒的特有结构感[18]。儿茶素与表儿茶素主要来自于种子、果皮和果梗,发酵过程中通过皮渣浸渍作用等进入葡萄酒中。清汁发酵调配出的白起泡葡萄酒中两者化合物的含量极其低,都≤0.24 mg/L;而含有浸渍发酵的黑比诺葡萄调配出的桃红起泡葡萄酒含量≥ 5.84 mg/L。陈酿过程中儿茶素的显著减少可能与其与花青素的共色素沉着有关[19]。表儿茶素含量变化(如陈酿6个月时含量的显著增加,之后整体呈现下降趋势)可能是这些化合物与其他酚类物质的聚合反应和解聚之间的平衡。同时还可能涉及到缩合和与花青素共色素沉着的反应,形成更稳定的色素[20]。

在起泡葡萄酒生产中,需要最低水平的酚类化合物,因此,对葡萄的轻度压榨会使得果皮中的酚酸、部分儿茶素及丹宁等进入葡萄汁以获得低水平的酚类化合物[21]。同时注意到,总酚含量先上升后下降。可能是因为在葡萄酒的酿造过程中,多酚主要是通过浸渍作用进入葡萄汁,使得桃红起泡葡萄酒的单体酚整体含量是白起泡葡萄酒的1.71～1.97倍。

2.2 颜色参数分析

颜色是第1感官印象,对葡萄酒的口味和风格起重要的暗示作用,它在酿酒和陈酿过程中的稳定性有助于控制葡萄酒质量,颜色参数见表6、7。

葡萄酒经不同时长的陈酿期后颜色特性增加,这可能归因于形成了更复杂的色素结构[22]。由于丙烯酸比甲酸具有更长的碳链,使得分子的柔性更强,在空间构象上更有利于辅色素与花色苷的结合,使得羟基肉桂酸类化合物的辅色效果普遍优于羟基苯甲酸类[23]。陈酿阶段的辅色素对酒体明亮程度起着十分重要的作用。色度值可以反映葡萄酒的颜色强度,L*值表示颜色的明暗程度与颜色深浅成反比,L*值越大表明酒体亮度越高[7]。在陈酿过程中,陈酿8个月的桃红起泡葡萄酒L*值显著升高、a*值显著降低,这可能是葡萄酒中花色苷类物质发生一定程度的氧化降解或者衍生而导致酒体红色色调的损失[24]。同时,阿魏酸作为花青素里最强的辅色素,a*、b*值的变化可能与阿魏酸有关。b*值主要表示葡萄酒中的黄色调,适宜的黄色调也可以使酒体更加鲜艳饱满。陈酿8个月时的桃红起泡葡萄酒b*值显著下降,这可能归因于葡萄中呈黄色调的酚类物质(黄烷醇类)浸入酒体后,与花色苷相作用形成辅色效应,增强葡萄酒色泽,从而导致浸渍后酒体的黄色调不明显。值得注意的是,陈酿10个月的桃红起泡葡萄酒b*值显著升高后保持相对稳定,可能是由于逐渐形成了具有橙/黄色色调的吡喃花色苷[25]。研究中桃红起泡葡萄酒的

显著高于白起泡葡萄酒,说明桃红起泡葡萄酒的色彩饱和度更高,颜色更鲜艳。可能是因为不稳定的花青素会附着或结合形成更复杂和稳定的色素,并且可以在储存过程中通过氧化降解,酚类化合物含量更高的桃红起泡葡萄酒的hab在陈酿14个月时显著增加[26]。ΔE(色差)是由L*、a*和b*定义的三维空间中的位置之间的欧几里德距离,桃红起泡葡萄酒、陈酿3个月和18个月的白起泡葡萄酒是人眼可感知的葡萄酒色度变化(ΔE>3)[13]。在整个陈酿过程,总体视觉效果表现为酒体颜色加深,黄色色调显著增多,颜色更加饱满[24]。

2.3 起泡特性分析

起泡葡萄酒的最初感官印象是由充满了香槟杯的丰富而绵密的泡沫组成。起泡特性主要通过可达到的泡沫可达到的HM、HS和TS进行评估(图1)。

结果表明,陈酿降低了2种起泡葡萄酒的HM参数,尤其是在陈酿6个月后,这可能是由于大分子的减少所带来的结果[14]。陈酿前10个月的白起泡葡萄酒的HM和HS参数高于桃红起泡葡萄酒。2款起泡葡萄酒的TS参数在陈酿过程中是动态变化的,说明泡沫变化不稳定。随着陈酿时间到12个月时,TS参数逐渐变得稳定。整体而言,随着陈酿时间的延长,起泡参数显著降低,但当陈酿时间达到12个月时,起泡参数变动幅度变小。适当的起泡特性有助于提升饮用者品体验感,陈酿16个月有助于获得最佳的起泡参数。

2.4 感官特性分析

结合表6、表7和图1、图2,发现随着陈酿时间的延长,整体感官评分不具有统计学上显著性差异。观察到不同陈酿时间的2款起泡葡萄酒的酒体澄清有光泽,都具有纯正、优雅、和谐的果香(如苹果、香蕉和草莓)与花香(如玫瑰)。白起泡葡萄酒色泽呈现微黄带绿、禾杆黄、金黄色等特征,桃红起泡葡萄酒色泽呈现淡玫瑰红、浅红色等特征。起泡葡萄酒注入酒杯时,表面涌现大量丰富绵密泡沫,底部自下而上不断涌现串珠状气泡,并保持一定持续性,这些显著的起泡特性可能归因于传统法酿造工艺和精加工过程[27]。

2.5 酚类化合物和起泡特性的相关性分析

酚类化合物与起泡特性的相关性分析见图3,圆的大小用来展示相关系数的大小,颜色用来表示相关系数的正负,再单独添加一个正方形的色块用来表示相关性检验的P值。研究发现,酚类化合物整体对起泡特性呈现显著负相关,这种不同的行为可能是由于它们的极性不同而导致的化学反应性差异[8]。其中龙胆酸对HM参数(r=-0.61, 0.01<P<0.05)与HS参数(r=-0.70, P<0.01)呈现显著负相关;绿原酸(r=-0.56, 0.01<P<0.05)和阿魏酸(r=-0.59, 0.01<P<0.05)分别对TS参数起极其显著抑制作用,这与MARTI width=9,height=13,dpi=110

EZ-LAPUENTE等[28]结论类似。值得注意的是,芦丁是唯一一个对整体起泡特性呈正相关的单体酚,尽管相关性弱。单体分子对葡萄酒泡沫的积极作用可能归因于其低分子质量和平面结构,这调节了它们的极性,通过垂直堆叠导致疏水分子相互作用[8]。通过这种相互作用,可以部分减少水对分子的亲核攻击,从而增加疏水性,这与一些强调分子疏水性对葡萄酒起泡特性重要性的研究一致[29]。然而,具有非平面结构的分子可能会阻碍与其他分子的接近,并可能减少可用于疏水堆积的潜在表面积,这可能可以解释观察到的羟基肉桂酸与HM参数负相关[8]。白起泡葡萄酒的HM显著高于桃红起泡葡萄酒,随着陈酿时间的增加,起泡特性的差异变小,2款起泡葡萄酒陈酿16个月的起泡参数接近,这可能是由于酚类成分/浓度的差异导致。总酚含量约为0.30 g/L的葡萄酒颜色饱满,可能更有利于产生绵密稳定的泡沫。

3 结论与讨论

本研究以宁夏贺兰山东麓产区所酿造的调配比例不同的白起泡葡萄酒和桃红起泡葡萄酒为研究对象,进行18个月的陈酿分析。适当低水平的酚类化合物有助于葡萄酒品质的提升。因此,对葡萄的轻度压榨会使得果皮中的酚酸、部分儿茶素及丹宁等进入葡萄汁以获得低水平的酚类化合物。桃红起泡葡萄酒的酚类化合物整体含量是白起泡葡萄酒的1.71～1.97倍,而酚类化合物浓度在陈酿过程中的变化可能与酿造过程中发生的氧化、聚合和共色素沉着反应等有关。葡萄酒在不同时间的陈酿期后颜色特性增加,这可能是形成更复杂的色素结构所导致。整个陈酿期间,总体视觉效果表现为酒体颜色加深,黄色色调显著增多,颜色更饱满。随着陈酿时间的增加,起泡特性的差异变小,这可能是由于酚类成分/浓度的差异导致,发现陈酿16个月可能有助于获得最佳的起泡参数特性。通过相关性分析及感官特性分析证实,总酚及绝大多数单体酚类化合物浓度在和起泡特性存在稳定的负相关关系的形成中起一定程度的抑制作用,高浓度酚类化合物可能直接会降低起泡特性,如龙胆酸可能会降低HM和HS参数、绿原酸和阿魏酸可能会抑制TS参数,白起泡葡萄酒的起泡特性整体高于桃红起泡葡萄酒,可能与这一结果紧密相关。实验酒样中总酚含量约为0.30 g/L的葡萄酒颜色更饱满,泡沫相对更绵密稳定。研究结果可为起泡葡萄酒品质研究,以及酿酒师针对性调整陈酿过程参数,优化气泡葡萄酒质量,提供理论参考。

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