目前包子、馒头、花卷等面点产品工业化生产大多采用熟制产品包装速冻、再冷藏配送的模式,期间面团容易出现淀粉老化、面筋结构损伤、酵母失活及硬度提高等情况引起产品劣变。同时冷冻面点产品经过二次复蒸之后,口感与风味损失严重,伴有开裂漏底等现象难以满足现代消费者的需求[1-2]。
而冷冻生坯面点产品(冻结前未经加热成熟的速冻食品)应用冷冻面团技术,低温环境下保护面筋蛋白不被破坏,减少酵母菌凋亡,依靠预醒发及蒸制过程中酵母菌的快速醒发,达到发酵成型的效果,能够有效减少复蒸引起的品质下降问题,极大保留了产品原始风味与营养[3-4]。酵母菌最适生长温度一般在20～30 ℃,在低温冻藏环境中冰晶的形成和重结晶会损伤酵母细胞结构造成酵母失活和产气能力下降,同时面筋网络结构和分子间构象的破坏使得面团二次醒发困难[5]。
路雪纯等[6]、沈鑫[7]从传统老面中筛选耐冻藏酵母,通过酵母菌与面团冷冻改良剂的协同作用,改善了低温冻藏对面团组织结构及风味的影响,减少了产品复蒸后的品质劣变。郭璐楠[8]通过探究酵母菌耐冷冻机制,避免酵母面对冷冻胁迫时细胞质水分迁移,减少细胞内外冰晶作用引起的细胞膜破裂,提升了低温环境下酵母菌耐受性。
而目前关于冷冻生坯面点研究主要集中在面团面筋结构的维持和复配改良剂优化上,具有快速醒发、抗冷冻特性的酵母菌的筛选以及对冷冻面团发酵特性、品质风味的改良研究不够系统。生坯面点专用耐冻发酵菌剂仍处于市场空白,因此本研究从传统老面团中筛选产气性能良好、耐冻性强的酵母菌,对比分析了所筛酵母菌与市售酵母菌剂对冷冻面团品质及风味的影响差异,以期为生坯面点产品专用菌剂及新产品开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
传统老面团,四川省食品发酵工业研究设计院有限公司。
市售酵母,标记为S1～S3;安琪高活性酵母,安琪酵母股份有限公司;香满园高活性干酵母,英联(哈尔滨)食品添加剂有限公司;梅山高活性干酵母,河北马利食品有限公司。
YPD培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司;高筋面粉,益海嘉里(重庆)粮油有限公司;二硝基水杨酸、亚铁氰化钾、乙酸锌,成都市科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
SPX-250-C恒温恒湿培养箱,上海沪粤明科学仪器有限公司;H2050R-1冷冻高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;CS-10精密色差仪,上海精密仪器仪表有限公司;TA.XT Plus质构仪,英国Stable Micro Systems公司;LDZX-50L-I立式高压蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;QP2010Ultra GC-MS,岛津;SK-WAX气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),岛津(上海)实验器材有限公司;DL-CJ-2 NDI超净工作台,北京东联哈尔仪器制造有限公司;B20B食品搅拌机,江苏如东瀚邦食品机械有限公司;SDG-16P(-80)速冻柜,昆山蓝海云创电子科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 耐冻酵母的分离筛选
将收集到的老面样本,于-18 ℃冷冻保藏48 h,取出融化后继续冷冻,循环5次。冻融结束后,将样品稀释到10-3～10-6梯度在YPD平板上进行纯化分离。通过显微镜下10×40倍观察菌株细胞形态,结合嗅闻法筛选具有酵母菌特征和明显香味的菌株。在本研究中,共得到5株不同菌落形态和香气特征的酵母菌株,将其标记为Y1～Y5,纯化接种后4 ℃保藏。
1.3.2 酵母生长曲线的测定
将5株酵母于28 ℃下活化24 h,吸取1 mL活化后的菌液,接种到500 mL的YPD液体培养基中,每2 h取样,在波长600 nm处测定吸光度值。
1.3.3 耐冻酵母发酵力的测定
采用排水法测定不同酵母菌发酵力。将100 g高筋小麦面粉,3 g酵母菌菌体(数量级均在109 CFU/g),6 g糖,0.6 g盐和60 g蒸馏水混匀,置于和面机中,搅拌成型。分割成50 g小面团,填实于密闭瓶中,28 ℃、相对湿度75%条件下发酵,每30 min记录1次排水体积,绘制发酵力曲线图,其余面团用于后续实验。
1.3.4 冷冻面团的制备及酵母细胞存活率测定
参考XU等[9]的方法并修改,将添加了酵母Y1～Y5的面团,在35 ℃,相对湿度75%条件下预发酵10 min后在-80 ℃急冻冰箱中快速冷冻,当样本核心温度达到-18 ℃后,转入-18 ℃冰箱中,冷冻120 d,每20 d测定1次酵母菌存活率。根据与新鲜面团酵母活菌数比值计算酵母细胞存活率。
1.3.5 面团比容、质构的测定
将上述冷冻40 d面团取出后,于醒发箱(35 ℃,相对湿度75%)醒发20 min后蒸制20 min,冷却后参考GB/T 21118—2007《小麦粉馒头》测定面团比容。
将冷却后的面团均匀切割为2 cm×2 cm×1 cm规格进行质构测定。选用TPA模式,采用P/50探头进行压缩试验。试验参数:测前速度2.00 mm/s,测试速度1.00 mm/s,测后速度1.00 mm/s,压缩程度50%,触发力5 g,压缩间隔5 s。
1.3.6 耐冻酵母的分子生物学鉴定
将所筛选具有耐冻产香功能的酵母菌,培养成熟后采用Omega M5635真菌DNA提取试剂盒进行提取。酵母菌采用引物26SF(5-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3),26SR(5-GGTCCGTGTTTCAAGAC-GG-3)进行PCR扩增,扩增产物由上海派森诺生物科技有限公司测序,序列利用BLAST程序在GenBank数据库中进行比对,利用Mega 6.0构建系统发育树。
1.3.7 酵母菌发酵面团感官品质的测定
将筛选的耐冻产香酵母菌与3种市售酵母菌剂在相同条件下制备面团,冷冻40 d,取出后,于醒发箱(35 ℃,相对湿度75%)醒发20 min后蒸制20 min,冷却后参考国标GB/T 35991—2018《粮油检验 小麦粉馒头加工品质评价 》中馒头品质评分项目,选择10名食品专业相关人员,按评定表1对熟面团进行感官评定。
表1 冷冻面团感官评定表
Table 1 Sensory evaluation form for frozen dough
项目感官评分颜色(15)深黄灰暗、色泽不均(0～5)浅黄、色泽较均匀(6～10)乳白、色泽均匀(11～15)形状(15)表皮粗糙、有硬块、形状变形严重(0～5)微皱、轻微塌陷、有凹点(6～10)表皮光滑、饱满、无塌陷(11～15)组织结构(15)截面有较多大气孔,且不均匀(0～5)气孔过于细小或有较少的大气孔(6～10)气孔细小、均匀(11～15)弹性(15)按压硬、复原性很差(0～5)回弹稍弱、复原性一般(6～10)回弹快、按压复原性好(11～15)气味(15)无香气,有异味(0～5)有较为适中的发酵香味和麦香,甜味(6～10)有较大发酵的香味和麦香,甜味(11～15)滋味(10)酸味过重(0～3)有轻微酸味(4～6)无酸味(7～10)咀嚼性(15)十分发黏,难以下咽(0～5)轻微黏牙(6～10)咀嚼爽口,不黏牙(11～15)
1.3.8 发酵面团香气成分测定
香气萃取:称取3 g蒸制的面团于顶空萃取瓶中,置于80 ℃恒温水浴锅中,待样品完全解冻且温度稳定,平衡20 min。萃取头插入顶空萃取瓶中吸附40 min后开始进样分析,解析8 min。
GC条件:使用气相色谱柱,以He为载气,进样口温度为250 ℃,不分流进样,流速1.0 mL/min,升温程序:40 ℃保持3 min,以4 ℃/min升温至200 ℃,5 ℃/min升至230 ℃,保留5 min。
MS条件:电子电离源;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;接口温度250 ℃;质量扫描范围35～400 u。
1.4 数据处理
采用SPSS 25.0、Excel 2019软件进行数据相关性统计分析,结果用origin 21软件作图表示。偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)采用SIMCA 14.1绘制。每组样本进行3次平行测定。
2 结果与分析
2.1 不同酵母的生长曲线、发酵力、耐冻性能的测定
传统老面团中微生物具有复杂性,包含多种与风味和品质存在显著关联性的微生物,被广泛用于特色发酵菌株的筛选[10]。如图1所示,实验前期筛选了5株具有耐冻、产香特性的酵母菌,测定了菌株的生长曲线、发酵力及冻藏后存活率。5株菌株的OD值随培养时间延长呈先增加后降低的趋势,其中8～24 h微生物生长明显加快,这与李欢欢等[11]的研究结果一致,该阶段酵母菌以指数增长的速率繁殖,利于酵母菌的收集。Y2在4～32 h的OD值始终高于其他几株酵母,并且在20 h即达到生长最高点,说明Y2酵母生长速率较其他菌株更快。
a-生长曲线;b-发酵力;c-冷冻后存活率
图1 不同酵母菌的生长曲线、发酵力及冷冻后存活率
Fig.1 Growth curves, fermentation power, and survival after freezing of different yeasts
酵母菌在繁殖代谢过程中,水解糖经发酵释放CO2,通过测定发酵力评判酵母菌产气能力的强弱,对于冷冻生坯面团醒发具有重要作用,发酵力越强的菌株,能够使面团在发酵期间产生大量气体膨胀,质地更加松软[12]。如图1-b所示,各株酵母菌在30 min前产气量差异较小,随后产气量显著增长,在180 min后逐渐稳定,5株菌株当中Y2发酵力最强。
面团在低温冷冻过程中,冷冻胁迫对酵母细胞具有严重破坏性,酵母菌会受冻融、高渗透压和氧化应激等各种条件协同影响,引起细胞凋亡[13]。如图1-c所示,各面团在0～60 d时间内酵母菌存活率快速下降,随后下降趋势放缓。酵母细胞存活率曲线趋势与刘海东等[14]对酵母菌多次冻融后的结果相似,由于冻藏过程中在高渗、低温及冰晶带来的机械损伤下,酵母菌细胞膜的组成和结构完整性受到影响,另一方面冰晶的形成使胞外基质浓度升高,胞内渗透压增大,导致细胞迅速脱水死亡[15]。而随着冻藏时间的延长,冷冻耐受型酵母菌能够通过调节基因表达,以反渗透作用将细胞内水分快速排出胞外,以减少胞内冰晶形成和对细胞伤害。同时耐冷冻酵母能够通过积累代谢物如胞内海藻糖等方式保护细胞免受损伤[16]。Y2在整个冻藏过程中存活率均高于其余菌株,证明了该酵母具有较强的抗冻稳定性。
2.2 耐冻酵母对面团比容及质构特性的影响
传统冷冻面团储藏过程中不可避免的会导致面团品质劣化,适口性降低。冷冻引起组织水分分布状态改变,结合水向可冻结水转化,冰晶数量的增多以及重结晶的不断出现使面筋网络遭到破坏,导致产品硬度增加、出现开裂现象,因此酵母菌二次醒发过程对面团质构的维持至关重要。由表2可知,5株酵母发酵的冷冻面团中,Y2组比容和高径比显著高于其他面团(P<0.05),咀嚼性为372.32 mJ,硬度为611.73 g,显著低于其他样本(P<0.05)。杨锦胜等[17]、苏安祥等[18]研究结果表明,硬度与咀嚼性在一定范围内与面团的食用品质呈负相关性,即硬度和咀嚼性数值越大,面团口感越差。这是由于冷冻复蒸后面团的持水力减弱,导致硬度和咀嚼性增大,使得面团缺乏绵软口感[19]。因此Y2发酵面团冷冻后的质构特性要优于其他菌株,表明了其良好的耐冷冻和快速产气性能,这与之前的发酵力和存活率测定结果一致。
表2 不同冷冻面团的比容和质构特性
Table 2 Specific volume and textural properties of different frozen doughs
菌株比容/(mL/g)高径比/(d/h)咀嚼性/mJ弹性/gf硬度/gY11.47±0.12bc0.48±0.02c403.28±4.19c0.85±0.03bc692.05±5.66cY21.84±0.03a0.66±0.02a372.32±4.25e0.97±0.01a611.73±4.22eY31.65±0.17b0.57±0.01b413.86±5.60b0.87±0.02b684.14±3.88dY41.37±0.02cd0.51±0.01c391.56±6.15d0.81±0.03c708.98±5.27bY51.23±0.03d0.41±0.02d477.43±3.75a0.74±0.02d746.33±5.24a
注:同列不同小写字母表示存在显著性差异(P<0.05)。
2.3 耐冻酵母菌菌落及分子生物学鉴定
通过对比分析,Y2酵母菌株的生长特性耐冻性及产气能力优于其他几株酵母菌,因此对Y2菌株进行分子生物学鉴定,测序结果在NCBI进行BLAST对比,通过邻接法构建系统发育树。如图2所示,Y2是一株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae),其菌落形态呈乳白色黏稠状、表面光滑整齐且质地均匀,形态凸起明显,细胞形态为圆球形或椭圆形。酿酒酵母菌普遍具有良好的生长适应性,耐受温度范围广,兼具产酯增香提升风味的作用,在酿酒、发酵食品等领域应用广泛。其代谢机理复杂,能够通过糖酵解途径,在酶促反应作用下产生醇类、酸类等芳香化合物,改善产品风味特性。
a-菌落;b-细胞形态(400倍);c-系统发育树
图2 Y2酵母菌菌落、细胞形态及系统发育树
Fig.2 Y2 yeast colony, cell morphology,and phylogenetic tree
2.4 耐冻酵母发酵面团感官评定
在冷冻面团中,酵母活性的丧失和面团结构的破坏是面团品质下降的主要原因。而冷冻生坯面团在产气快、活性强的耐冷冻酵母作用下能够在二次醒发过程中快速成型,维持产品良好的柔软质地和弹性[20]。将耐冻产香酵母Y2与3种市售酵母菌剂(标记为S1～S3),在相同条件下(相同添加方式、相同数量级)制备成面团,经40 d冷冻后取出,二次醒发后从颜色、结构、风味等方面进行感官评价,结果如图3所示。由于冷冻带来的影响,各组面团老化程度不同,普遍存在表皮皱缩、凹陷,容易掉碎屑等现象,色泽不均匀、口感粗糙等问题,品质感官劣变。其中酵母Y2感官评价总分为84.2分显著高于其余3组,尤其在咀嚼性、组织结构上明显优于市售普通酵母菌,说明耐冻酵母菌株对于面团冷冻后的劣变具有改善作用,能够减少低温环境下对面团组织结构、水分迁移造成的影响,在二次醒发过程中能够提升一定的感官特性。
图3 不同冷冻面团的感官评定图
Fig.3 Sensory evaluation of different frozen dough
2.5 耐冻酵母发酵面团香气成分分析
由图4-a及表3可知,在冷冻面团香气物质中,醇类、酯类和酸类物质含量较高。酵母菌通过Ehrlich代谢途径及醛类物质氧化可生成醇类物质,通常具有酒香味及清香味,酸类化合物则是某些风味物质的前体[21]。醇类风味化合物在S2样本中占比最高达到40.67%,酸类物质在S3样本中占比达到30.51%。而酯类化合物由酸和醇的酯化反应产生,该类风味物质阈值低,大多具有花、果的芳香气味,含量较低的情况下也对香气具有较大贡献。Y2样本酯类风味化合物含量占28.39%,高于其他样本。醛类化合物一般来说在低浓度时对气味起到积极作用,浓度较高时则会产生令人不悦的异味。酮类、烷烃类化合物由脂质的氧化分解形成,对香气基本无贡献,在面团中占比较低。
a-挥发性风味物质相对含量;b-差异挥发性物质VIP值;c-共有香气成分PLS-DA;d-关键差异物质热图
图4 不同发酵组面团挥发性风味物质相对含量、差异挥发性物质VIP值、共有香气成分PLS-DA及关键差异物质热图
Fig.4 Relative contents of volatile flavor substances in doughs of different fermentation groups, VIP values of differentiated volatile substances, PLS-DA of shared aroma components and heatmap of key differentiated substances
表3 不同挥发性风味物质的相对含量
Table 3 The relative contents of different volatile flavor substances
物质名称保留时间/min相对含量/%Y2S1S2S3气味特征乙醇4.4830.790.260.860.72酒香异丁醇6.7900.990.510.60-葡萄酒香异戊醇10.27910.6810.116.7911.93威士忌味、麦芽酒味、烧焦味、玫瑰香、甜橙香正己醇15.0831.781.61.111.54树脂香、花香、青味1-辛烯-3-醇18.2931.791.481.001.72土壤香、油脂香、花香味、蘑菇香庚醇18.4101.30-0.15-辛辣、青草香、果味正辛醇21.5770.790.770.410.72玫瑰香、青香味1-壬醇24.6043.172.821.562.26玫瑰香、甜橙香顺-3-壬烯-1-醇25.2680.990.580.780.90-香叶醇29.7550.20---玫瑰香、甜香苯甲醇30.4250.89-0.74-甜香、花香苯乙醇31.2888.025.538.617.20蜂蜜、香料、玫瑰丁香月桂醇32.8654.303.450.525.36月下香、紫罗兰香2-己基-1-癸醇39.58-0.420.33--十六醇42.3831.390.380.48--(E)-2-庚烯醛13.8730.65---正壬醛16.3594.392.341.262.44脂肪、柑橘、青香味反-2-辛烯醛17.49-0.930.821.63草本植物香癸醛19.7001.990.610.480.63蜡香、柑橘香、花香苯甲醛20.328-1.602.494.07坚果香味反-2-壬醛20.7293.692.532.045.24-月桂醛23.2190.61--0.90松叶油香、橙油香、脂肪香反式-2-癸烯醛23.3031.190.67--甜橙香气,带脂蜡样气息壬二烯醛25.592-0.260.72酯香、花香2-十一烯醛27.0361.191.71.37-醛香、蜡香、柑橘香、脂肪香、青香反-2-十二烯醛27.0431.22--2.26-癸二烯醛28.5990.300.740.741.90-肉豆蔻醛31.6780.20---脂肪香、蜡香、牛奶香、奶油香、鱼香、果香反式-4-癸烯醛33.505-0.190.370.27-椰子醛34.0650.790.71-1.18椰子香、茴香味、杏李香味十四醛34.3470.300.160.41--
续表3
物质名称保留时间/min相对含量/%Y2S1S2S3气味特征十五醛36.876-0.420.630.36-(Z)-9-十六碳烯醛42.1390.420.83--辛酸乙酯17.762-1.190.561.72白兰地酒香壬酸乙酯20.948-0.640.300.99果香、蜡香、酯香、青香,并有香蕉、葡萄味戊二酸二甲酯25.7433.89-0.781.63-乙酸苯乙酯28.810.990.190.220.45蜜甜香、玫瑰香丙位壬内酯34.07--0.74--肉豆蔻酸异丙酯34.6720.590.290.450.81微弱的油脂酸味十四酸乙酯34.9230.49----肉桂酸乙酯36.605-0.771.081.18强烈肉桂草香味棕榈酸甲酯38.8450.400.770.740.45-十六酸乙酯39.731.02--3.44淡奶油味-十三酸乙酯39.7292.454.68---棕榈酸乙酯39.738.41-2.19-蜡香、果香、奶油香气硬脂酸甲酯43.3840.240.740.74--反-9-十八碳烯酸甲酯43.811-1.671.48--油酸乙酯44.6563.460.960.89-花香、果香以及油脂气息硬脂醇乙酸酯45.3561.14-0.97--亚油酸乙酯45.883-4.333.904.34果香和花香的结合邻苯二甲酸二异丁酯46.0326.457.964.165.97-亚麻酸乙酯47.6340.49----棕榈酸乙烯酯52.9990.29-1.74--棕榈酸缩水甘油酯53.088-4.25.08--乙酸18.7862.681.732.232.17酸味正己酸29.947-4.492.33.71奶酪味庚酸32.709-0.550.740.45发酵香、蜡香、果香、乳酸、菠萝蜜的香气辛酸35.3340.692.312.750.90-正壬酸37.8391.881.992.61.72-正癸酸40.248-2.694.71--反-3-癸烯酸41.465-0.190.48--十一烷酸42.5490.18-0.26--月桂酸44.9392.373.303.90-月桂油香气硬脂酸49.66---5.53略带脂肪气味十四酸50.1484.555.108.052.89微弱的蜡香、奶香9-氧代壬酸51.805-0.220.41--十五烷酸52.2880.430.512.08--苯乙酮24.095-0.190.45甜橙香气橙化基丙酮29.895--1.08--十七烷酮39.1080.32-0.26--2,4-二叔丁基酚41.03-0.35---十四烷16.7930.170.42---1-十四烯18.615-0.22---正十九烷23.0260.231.03---1-十七碳烯26.375-0.42---正十六烷28.7091.58-1.971.72-戊基环戊烷30.5410.40----十八烷33.8980.89-0.56--
各组间风味成分占比差异并不明显,在醇、醛类类香气物质中,乙醇、异戊醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、正壬醛、反-2-壬醛的含量较高,正己醇由亚油酸氧化和酵母代谢生成,具有水果香气,是面粉中主要醇类物质,这与赵畅雯等[22]、高雪等[23]的研究结果一致。而异戊醇和苯乙醇分别由亮氨酸和苯丙氨酸脱羧转化而来,带有甜香、玫瑰香等香气,酿酒酵母经由Ehrlich途径能够高效完成该过程的转化[24]。在面团混合和发酵过程中,这些挥发性醇类、醛类化合物作为基础风味物质,能够赋予样本不同风味特色[25]。
由表3可知,Y2组含有香气物质54种,其中醇类14种,醛类13种,酯类14种,酸类7种,酮类1种,烷烃类5种。S1香气物质为56种,S2香气物质为57种,S3香气物质为40种。对各组面团中共有的21种香气物质相对含量进行PLS-DA,能够对组间风味成分特征进行有效区分,解释不同发酵组面团中风味物质差异。将VIP值≥1的风味物质定义为对风味具有较大贡献的差异物质。如图4-b和图4-c可知,差异标志物质共11种,其中醇类4种,酸类1种,酯类2种,醛类4种。Y2组与S3组样本间距离接近,处于同一象限,且两个样本与大部分关键差异风味物质具有关联性,说明两种酵母发酵后的面团风味具有一定相似性。以不同冷冻面团中11种关键差异风味物质相对含量绘制热图,根据图4-d结果,Y2和S3中关键差异风味物质含量显著高于其他几组,与PLS-DA结果一致,表明了Y2发酵面团冷冻后关键的醇类、酯类、醛类等风味化合物相对含量高于其他菌株,其香味特征更具复杂性和独特性。因此耐冻酵母菌Y2在冷冻面团中的应用效果和风味促进作用优于普通酵母菌剂。
3 讨论与结论
从传统老面团中筛选了5株产香、耐冻性能良好的酵母菌株。对酵母菌生长活性、产气性能、冷冻存活性和应用于面团后的质构特性进行测定。结果表明:Y2菌株具有较强的抗冻稳定性,发酵力及生长活性优于其他菌株,Y2发酵面团冷冻后二次醒发具有更高的比容且更佳的质构特性。经分子生物学鉴定,Y2是1株酿酒酵母菌,对比分析了该菌株与3款市售酵母菌剂相同条件下应用于冷冻面团的感官与风味差异。添加Y2组含有香气物质54种,其中醇类14种,醛类13种,酯类14种,酸类7种,酮类1种,烷烃类5种。经PLS-DA,以VIP值≥1筛选了具有较大贡献的11种差异风味物质并绘制热图,Y2中关键的醇类、酯类、醛类等风味化合物相对含量高于其他菌株,结合感官评定结果,耐冻酵母菌Y2在冷冻面团的应用效果和风味促进作用优于普通酵母菌剂。
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