蛋清蛋白(egg white protein,EWP)不仅富含多种人体必需的营养物质,而且具有多种功能特性,比如起泡性、乳化性、凝胶性等,在改善食品的质地和结构方面具有重要作用[1]。EWP的凝胶性是其重要的功能特性之一,但其凝胶特性会受到多种因素的影响,比如pH值、离子强度以及多糖的添加等[2]。研究表明,多糖的添加能够改善EWP的凝胶特性。ZHANG等[3]研究发现,添加低浓度的黄原胶能够提高EWP的硬度和弹性,改变EWP的二级结构,微观结构也更加致密和光滑。谭芦兰等[4]通过添加魔芋胶提高了EWP凝胶的持水力和表面疏水性,微观结构更加平滑均匀。这些多糖都属于食用胶,而食用胶在食品生产中都有限量要求,因此寻找一些具有相同功能性质的天然多糖来代替部分食用胶的使用是非常重要的。HE等[5]研究发现,不同浓度的枸杞多糖对乳清分离蛋白的凝胶特性会有不同的影响,可以根据生产需要调节枸杞多糖的浓度以满足不同消费者的需要。PAN等[6]发现金针菇多糖的添加增强了热诱导大豆分离蛋白凝胶的强度,降低了其黏度,形成了更加均匀致密的凝胶网络结构。
银耳多糖(Tremella fuciformis polysaccharide,TFP)是从银耳中提取出来的天然多糖,是由甘露糖、木糖、葡萄糖以及半乳糖等单糖组成的一种酸性杂多糖[7]。TFP具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化及调节免疫活性等功效[8]。此外,TFP在食品上还能用作增稠剂、乳化剂等[9]。TFP在水中形成的胶体有一定的凝胶性,可以用于改善食品的凝胶特性[10]。因此,将TFP添加到EWP中,可能是改善EWP凝胶特性的一种有效途径。
目前,TFP对EWP凝胶特性的影响还不清楚。因此,本试验以TFP和EWP为试验原料,研究了不同TFP添加量对EWP凝胶的流变特性、热稳定性、水分分布等的影响。通过内源性荧光光谱、傅里叶变换红外光谱和扫描电镜,评估了TFP添加后EWP结构的变化,以期为TFP在改善蛋白凝胶特性上的应用提供理论依据。
EWP,亳州市海川蛋制品有限公司;TEP,含量90%,山西南坝生物化工有限公司;溴化钾,(光谱纯,SP),天津市科密欧化学试剂有限公司;磷酸盐缓冲液,以达科技有限公司。
YRLG-10A真空冷冻干燥机,德国CHRIST公司;SN-CJB-M1磁力搅拌器,浙江艾科仪器设备有限公司;HH-2数显恒温水浴锅,常州朗越仪器制造有限公司;DHR-1流变仪,美国TA公司;N9010A差示扫描量热仪,深圳弗布斯公司;VERTEX 70傅里叶红外光谱仪,德国Bruker公司;Cary eclpise荧光分光光度计,美国Aglient Cary elipse公司;NI.M120-015V-1-I.核磁共振成像分析仪,上海纽迈电子科技有限公司;EM-30Plus电子扫描显微镜,日本岛津公司。
1.3.1 TFP-EWP凝胶的制备
TFP-EWP凝胶的制备参考XU等[11]的方法,将EWP和TFP分别用去离子水溶解在烧杯中,在室温下用磁力搅拌器搅拌2 h,然后将其置于4 ℃冰箱中贮藏12 h以保证完全水合。最后将EWP溶液和TFP溶液混合并搅拌2 h,最终使EWP的质量浓度为20 g/100 mL,TFP的质量浓度为0、1、2、3、4 g/100 mL(后文简写为0%、1%、2%、3%、4%)。将制备好的TFP-EWP复合溶液,在90 ℃水浴锅中水浴40 min,水浴完成后立即冷却凝胶,并将其放置在4 ℃冰箱中过夜以待分析。
1.3.2 流变学特性分析
1.3.2.1 黏度-剪切速率扫描
参考陈焓淇等[12]的方法并稍作修改。选择45 mm的平板,温度设置为25 ℃,平板间距设置为1 mm,在剪切速率为0.1~10 s-1下测定复合凝胶的黏度随剪切速率的变化。
1.3.2.2 模量-频率扫描
参考刘莹等[13]的方法并稍作修改。在温度为25 ℃,扫描应变为1%下,测定频率为0.1~10 Hz内复合凝胶的储能模量和损耗模量。
1.3.3 热稳定性分析
将冷冻干燥后的复合凝胶研磨成粉末,分别精确称量2.0 mg各样品于密闭坩埚中,使用差示扫描量热仪进行测定。温度变化范围20~150 ℃,升温速率10 ℃/min,氮气流速20 mL/min。
1.3.4 低场核磁共振分析
取2 g复合凝胶样品放入核磁共振玻璃管内,测量样品的弛豫时间(T2)。设置参数为:测量温度32 ℃,主频率21 MHz,重复采样等待时间7 000 ms,回波个数10 000,重复扫描次数4。
1.3.5 傅里叶变换红外光谱分析
参照WU等[14]的方法,并稍作修改。将复合凝胶粉末与溴化钾按照1∶100质量比混合并压片,用傅里叶红外光谱进行扫描,测试条件:扫描范围为4 000~400 cm-1,分辨率为4 cm-1,总扫描次数为32次。利用Peak Fit软件v4.12对蛋白质的酰胺Ⅰ带进行去卷积和二阶导数拟合处理,分析蛋白质二级结构含量的变化。
1.3.6 内源性荧光光谱分析
用磷酸盐缓冲液将复合凝胶配制成0.1 mg/mL的溶液,以磷酸盐缓冲液作对照测定样品的荧光光谱。参数设置为:激发波长280 nm,发射波长300~500 nm,扫描速率600 nm/min,狭缝宽度5 nm。
1.3.7 扫描电镜分析
将制备好的含有不同质量浓度TFP的EWP凝胶切成2 mm3小正方体进行冷冻干燥。冷冻后的样品用导电胶固定,并进行喷金处理,然后在扫描电镜下观察样品的微观结构。
每组试验数据取3次结果的平均值,利用OriginPro8.5软件绘图,使用SPSS对数据进行显著性分析。
图1显示了添加不同浓度的TFP后,EWP凝胶体系表观黏度随剪切速率的变化情况。由图1可知,不同TFP添加量的凝胶体系的表观黏度在低剪切速率下迅速下降,在高剪切速率下逐渐下降,表明TFP与EWP形成的凝胶体系具有剪切变稀行为,是一种假塑性流体。这可能是因为EWP凝胶体系中高分子相互缠绕,限制了分子间的移动,当受到剪切作用时,分子间结构被拉直和解缠绕,因此凝胶体系的表观黏度降低[15]。在相同剪切速率下,添加TFP的EWP凝胶的表观黏度均大于纯EWP凝胶并随着TFP添加量的增加而增加。在TFP浓度为0%~4%范围内,TFP添加4%时EWP凝胶的表观黏度达到最大值(1 421.82 Pa·s)。这归因于添加的TFP覆盖在了EWP的表面,促进了TFP与EWP之间的相互作用,限制了蛋白质分子的运动,增强了多糖与蛋白质之间的交联[11]。TFP自身也具有增稠作用[16],因此凝胶体系的表观黏度得到了提高。
图1 不同TFP添加量对EWP凝胶表观黏度的影响
Fig.1 Effect of different TFP additive amounts on the apparent viscosity of EWP gel
储能模量(G′)反映了凝胶体系在应力作用下一个周期内贮存能量的能力,代表凝胶体系的弹性性质。损耗模量(G″)反应了凝胶体系因为其黏度而发生不可逆变形时的能量损失,代表凝胶体系的黏性性质[17]。图2测量了EWP凝胶体系的G′和G″。由图2可知,不同TFP添加量的EWP凝胶的G′和G″都随着角频率的增加而增加并且在测得的频率内,G′始终大于G″,表明EWP凝胶呈现出的是固体凝胶的弹性流变行为且弹性行为占主导地位。随着TFP浓度的增加,EWP凝胶的G′和G″都随之增加。这是因为添加TFP后的EWP凝胶有更多的分子参与了非共价交联,使得分子间互相缠绕聚集形成了更复杂的网络结构,从而削弱了流动性能,这与WANG等[18]的结论一致。
a-储能模量(G′);b-损耗模量(G″)
图2 不同TFP添加量对EWP凝胶储能模量(G′)和损耗模量(G″)的影响
Fig.2 Effect of different TFP additive amounts on energy storage modulus (G′) and loss modulus (G″) of EWP gel
差式扫描量热法可以测定生物大分子的热力学性质,用于反映蛋白质分子之间或蛋白质与多糖分子之间的相互作用[19]。热变性温度指的是当蛋白质中去折叠状态和折叠状态含量相等时的温度,其值越大表明蛋白质越稳定[20]。由图3可知,在加热过程中,各样品在60~80 ℃时有一个较宽的吸热峰,这可能是EWP凝胶在加热过程中逐渐由规则的有序结构变为不规则的无序结构造成的[21]。与纯EWP凝胶的热变性温度65.13 ℃相比,添加TFP后的EWP凝胶的热变性温度均得到了提高,大小依次为3%>4%>2%>1%>0%。其中添加3%TFP的EWP凝胶热变性温度为77.91 ℃,提高了19.62%,表明TFP的添加能够改善EWP凝胶的热力学稳定性,促进三维结构更加稳定的EWP凝胶的形成。这可能是因为TFP与EWP之间通过分子间相互作用形成了更紧密的键,产生了更强的交联,生成了一种更具耐高温能力的凝胶网络结构。添加4%TFP的EWP凝胶热变性温度比添加3%时有所下降,可能是过量添加TFP会引起TFP与EWP之间的不相容性,使其之间的相互作用减弱[22]。JIANG等[23]研究了凉草粉多糖对乳清分离蛋白凝胶形成的影响,结果表明凉草粉多糖的添加提高了乳清分离蛋白凝胶的热稳定性,与本文结论一致。
图3 不同TFP添加量对EWP凝胶热稳定性的影响
Fig.3 Effect of different TFP additive amounts on the thermal stability of EWP gel
低场核磁共振可以反映凝胶体系中水分的分布状态。其中第1个峰(T2b)代表结合水,表示与凝胶网络紧密结合的水,第2个峰(T21)代表存在于凝胶网络中的固定水,第3个峰(T22)代表与凝胶网络结合较弱且容易流失的自由水[24]。添加TFP后,EWP凝胶体系的T2均提前,T2越早,表明TFP与EWP形成的凝胶体系中的水分与凝胶网络结合更紧密,水分流动性更弱,即TFP的添加提高了EWP凝胶固定水分的能力[25]。由图4可知,TFP添加为1%~3%时,EWP凝胶体系中的结合水和固定水的峰面积比例逐渐增大,最大占比分别为1.23%和3.60%,TFP添加为4%时,结合水和固定水的比例降低,但仍然高于未添加TFP的EWP凝胶,这表明了凝胶体系中的自由水向结合水和固定水转化。加入TFP后,EWP凝胶体系中的自由水比例降低,这可能是因为TFP与凝胶体系中的自由水之间形成了氢键,削弱了水的流动性,使更多的自由水被束缚在凝胶网络结构中[26]。
图4 不同TFP添加量的EWP凝胶T2弛豫时间曲线
Fig.4 T2 relaxation time curves of EWP gel with different additive amounts of TFP
多糖和蛋白质之间的相互作用主要包括氢键、疏水相互作用、静电吸引、范德华力等[22]。傅里叶红外光谱可以反映样品的分子结构和相互作用,不同波长的峰与多糖和蛋白质之间形成的官能团有关。由图5可知,添加TFP的EWP凝胶与未添加TFP的EWP凝胶具有相似的红外光谱并且在测定的波长范围内没有新的吸收峰出现。这说明TFP和EWP之间并没有形成新的共价键,而是通过非共价键进行相互作用。与未添加TFP的EWP凝胶相比,添加1%~2%TFP的EWP凝胶在3 388.88 cm-1波长处的O—H和N—H伸缩振动发生了轻微蓝移,分别蓝移至3 387.87 cm-1和3 382.51 cm-1,添加3%~4%TFP的EWP凝胶发生了轻微红移,分别红移至3 389.15 cm-1和3 391.41 cm-1,这可能是因为TFP和EWP之间形成了氢键,促进了更加稳定、网络结构更加致密的凝胶的形成[27]。
图5 不同TFP添加量的EWP凝胶的红外光谱图
Fig.5 Infrared spectra of EWP gel with different TFP additive amounts
为进一步表征EWP凝胶的二级结构,对酰胺Ⅰ带(1 600~1 700 cm-1)的特征峰进行去卷积和二阶导数拟合,通过峰面积计算出蛋白质二级结构的含量。由图6可知,添加TFP后的EWP凝胶中α-螺旋的含量显著低于纯EWP凝胶(P<0.05),β-折叠、β-转角和无规则卷曲的含量显著增加(P<0.05),这表明添加TFP后促使了α-螺旋向β-折叠、β-转角和无规则卷曲的转变。α-螺旋含量降低表明EWP分子去折叠和有序结构减少,β-折叠含量增加表示EWP聚集程度增强,这两者均有利于EWP的凝胶化,并且β-折叠含量的增加有助于形成更加有序和紧凑的凝胶网络结构[28]。
图6 不同TFP添加量对EWP凝胶二级结构的影响
Fig.6 Effect of different TFP additive amounts on the secondary structure of EWP gel
注:不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
蛋白质中主要的荧光残基是色氨酸和酪氨酸,可以用于表征蛋白质的去折叠,反映蛋白质三级结构的变化[29]。由图7可知,添加TFP的EWP凝胶的荧光强度都大于未添加TFP的EWP凝胶。随着TFP添加量的增加,EWP凝胶的荧光强度逐渐提高,这可能是在热诱导的作用下,TFP与EWP之间的静电相互作用改变了EWP的空间构象,促进了蛋白质的展开,使EWP内部的色氨酸暴露在表面导致的[30]。添加1%TFP的EWP凝胶最大发射波长发生轻微红移,可能是因为色氨酸基团转移到了更亲水的周围以及微环境极性的增加[31]。添加2%~4%TFP的EWP凝胶最大发射波长发生轻微蓝移,可能是因为在高浓度TFP下蛋白质的三级结构过度展开,环境的疏水性增加造成的[32]。总之,TFP的添加对EWP的三级结构产生了一定的影响。
图7 不同TFP添加量的EWP凝胶荧光光谱图
Fig.7 Fluorescence spectra of EWP gel with different TFP additive amounts
为了观察不同TFP添加量的EWP凝胶的微观结构,利用扫描电镜对冷冻干燥后的凝胶样品进行拍照分析。图8显示了扫描电镜200×下观察到的EWP凝胶的网络结构,未添加TFP的EWP凝胶网络不规则,结构破碎且无序,这可能是EWP在热变性过程中没有充分展开,导致不能与邻近的EWP充分结合造成的[26]。随着TFP添加量的增加,EWP凝胶网络结构逐渐变得有序且致密,这说明TFP的添加可以促进EWP的有序展开和相互交联,从而提高了复合凝胶的致密性。由图8可知,与未添加TFP的EWP凝胶相比,添加1%~2%TFP的EWP凝胶网络变得有序,但是存在细小的孔洞和较大的水通道。添加3%~4%TFP的EWP凝胶中的多孔结构和水通道逐渐减少并且更加致密。这可能是因为TFP中的羟基与水分子之间形成了氢键,减少了EWP与水分子形成的氢键,促进了EWP分子间氢键的形成,从而形成了孔洞更小、更均匀致密的凝胶网络[33]。
a-0%TFP;b-1%TFP;c-2%TFP;d-3%TFP;e-4%TFP
图8 不同TFP添加量的EWP凝胶扫描电镜图
Fig.8 Scanning electron microscopy of EWP gel with different additive amounts of TFP
探讨了不同TFP添加量对EWP凝胶的性质及结构的影响。随着TFP添加量的增加,凝胶体系的表观黏度、G′和G″逐渐增大,并且G′始终大于G″,凝胶体系中的弹性行为占主导地位,形成的凝胶网络结构更加有序且致密。添加3%TFP的EWP凝胶的热稳定性最强,与水分子的结合最为紧密。TFP和EWP之间没有形成新的化学键,两者可能是通过氢键进行相互作用的。TFP的添加使EWP凝胶的α-螺旋含量显著降低,β-折叠、β-转角和无规则卷曲含量升高(P<0.05),促进了有序凝胶网络的形成。综上,TFP的添加可以改善EWP的凝胶性质和结构,为TFP在食品凝胶上的应用提供了一定理论基础。
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