凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾,隶属于对虾科对虾属动物,具有生长周期短、抗病能力强、适应范围广等特点,已成为我国集约养殖的优良品种[1]。凡纳滨对虾营养丰富、味道鲜美,是消费者最喜爱的水产品之一[2]。但凡纳滨对虾本身具有高蛋白、高水分的特性,使其在捕捞、运输、贮藏等过程中容易发生腐败变质而导致品质下降,市场上一般采取冷冻贮藏与添加抗冻保水剂的方式维持冻藏凡纳滨对虾品质[3]。
冷冻贮藏可以显著延长水产品的货架期,是水产品长期贮存中最常用的的方法之一[4]。但冷冻过程中冰晶的形成与重结晶会严重影响水产品原有的品质,导致颜色、气味、质地等发生变化,从而对销售商造成重大经济损失[5]。因此,在冷冻贮藏期间如何维持水产品品质仍然是水产品加工行业面临的重要挑战。添加抗冻剂可在一定程度上抑制冷冻水产品内部冰晶的生长,降低冰晶对肌肉组织的机械损伤,减少蛋白质变性,可以保留水产品基本的功能特性[6]。虾类产品中最常用的抗冻剂主要包括磷酸盐与糖类[7]。磷酸盐是含有磷元素和其他矿物成分的天然化合物,作为传统抗冻剂,因其价格低廉、使用方便等优点,成为冷冻水产品中使用最广泛的抗冻剂[8]。虽然磷酸盐抗冻剂能显著提高水产品的持水能力、延长贮藏期,但过量食用含有磷酸盐的水产品会影响钙的吸收,导致体内钙磷代谢紊乱,造成钙质流失,从而增加消费者患上佝偻病、骨质疏松等疾病的风险[9]。因此,研发绿色、高效的无磷抗冻保水剂具有重要意义。蔗糖作为最常用的糖类抗冻剂,具有良好的抗冻效果且价格相对较低,但由于高甜味、高热量的特性,使其在工业生产中的应用受到很大限制[10]。显然传统糖类抗冻剂因其自身特性明显不符合当下人们所追求的低甜低热消费趋势,也不适合糖尿病患者食用,但从自然界中提取的天然多糖因其绿色、健康等优点越来越受到人们关注,有望作为新型抗冻剂应用于水产品的品质维持[11]。
坛紫菜(Porphyra haitanensis)属红藻门、红毛菜科植物,是我国特有的具有经济效益的大型海藻之一[12]。坛紫菜作为可食用藻类,主要分布于我国福建、浙江和广东沿海[13]。末水坛紫菜属于坛紫菜的一种,因其价格低廉通常被养殖者弃收,但末水坛紫菜仍然含有多种活性物质,因此其经济效益有待进一步开发[14]。坛紫菜被称为“营养宝库”,含有蛋白质、多糖、矿物质和维生素等多种成分,其中多糖约占其干重比例的20%～40%[15]。坛紫菜多糖(polysaccharides derived from Porphyra haitanensis, PHP)作为坛紫菜中主要功能因子与营养成分,国内外研究主要集中于抗氧化、降血糖、降血脂以及免疫调节等生物活性方面,然而将坛紫菜多糖应用于水产品抗冻保水方面的研究却鲜有报道[16]。
因此,本研究以去壳凡纳滨对虾为研究对象,探究坛紫菜多糖对冻藏凡纳滨对虾的抗冻保水效果,从品质维持角度揭示坛紫菜多糖抗冻规律,从而为坛紫菜多糖应用于冷冻水产品抗冻保水方面提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活凡纳滨对虾,广州市华润万家超市;复合磷酸盐(食品级),广东康达生物科技有限公司;坛紫菜,潮州市饶平县;丙二醛含量检测试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;总巯基测定试剂盒、蛋白质羰基含量测定试剂盒,南京建成生物工程研究所;Bradford蛋白浓度测定试剂盒,碧云天生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Sunrise-basic吸光度酶标仪,德国TECAN公司;H-1850R高速离心机,长沙湘仪离心机仪器公司;T25组织匀浆机,德国IKA公司;光学显微镜,日本OLYMPUS公司;su8020扫描电镜,日本日立公司。
1.3 实验方法
1.3.1 坛紫菜多糖(PHP)提取
坛紫菜多糖的提取工艺如下:
坛紫菜粉末→脂溶性色素去除、干燥→坛紫菜干粉与水料液比16∶1(g∶L)超声40 min→90 ℃振荡水浴浸提4 h、离心→上清液旋蒸浓缩、95%(体积分数)乙醇醇沉过夜、离心→沉淀复溶、木瓜蛋白酶50 ℃酶解2.5 h→90 ℃水浴15 min、离心→Sevage法脱蛋白→透析、旋蒸、冷冻干燥→坛紫菜多糖(PHP)。
1.3.2 原料处理
鲜活凡纳滨对虾在0～4 ℃冰水中清洗、去头去尾去壳,选取大小均匀的完整虾仁(8～9 g),沥干后用滤纸轻拭去表面水分。随后将虾仁随机分成5组,以料液比1∶2(g∶mL)分别用去离子水(空白对照)、1 mg/mL PHP、5 mg/mL PHP、10 mg/mL PHP以及5 mg/mL磷酸盐(阳性对照)混合,在4 ℃冰箱中完全浸泡30 min,每隔10 min搅拌1次。取出虾仁,再次沥干后装入封口袋中,置于-18 ℃冰箱贮存30 d,每隔5 d取样1次置于室温条件下解冻2 h,进行后续指标测定。
1.3.3 肌原纤维蛋白提取
根据杨肖杰等[17]提取肌原纤维蛋白的方法并略作修改,并用Bradford法测定肌原纤维蛋白浓度。
1.3.4 保水能力测定
解冻损失率与离心损失率根据ZHANG等[18]的方法并稍作修改。解冻损失率计算如公式(1)所示:
解冻损失率
(1)
式中:m1,样品浸泡后的质量,g;m2,样品解冻后的质量,g。
离心损失率计算如公式(2)所示:
离心损失率
(2)
式中:m3,样品解冻后的质量,g;m4,样品离心后的质量,g。
1.3.5 理化指标测定
色差值测定方法:以虾仁第2腹节为测试点,ΔE代表虾仁颜色的总变化程度,计算如公式(3)所示:
ΔE=[(ΔL*) 2+ (Δa*)2+ (Δb*)2]1/2
(3)
pH值测定方法:根据GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》方法并稍作修改,测定样品pH值。
质构特性测定方法:以硬度和弹性为检测参数,对解冻虾仁第2腹节肌肉中央进行质构特性分析。
丙二醛含量测定方法:采用丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量检测试剂盒对冻藏虾仁MDA含量进行检测。
1.3.6 蛋白质氧化程度测定
羰基测定方法:采用蛋白质羰基含量测定试剂盒对冻藏虾仁羰基含量进行检测。
总巯基测定方法为:采用总巯基(—SH)含量测定试剂盒对冻藏虾仁总巯基含量进行检测。
1.3.7 微观结构分析
光学显微镜测定方法:采用HE染色法对虾仁切片进行染色,在显微镜下观察虾仁组织结构。
扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)测定方法:冻藏虾仁加入10倍体积2.5%(体积分数)戊二醛在4 ℃下固定4 h以上,0.1 mol/L PBS洗涤3次,随后用不同体积分数(30%、50%、70%、80%、95%、100%)乙醇梯度脱水,再用乙酸异戊酯置换乙醇,真空冷冻干燥后,在样品表面溅射镀金后用扫描电镜拍摄。
1.4 数据处理
采用IBM SPSS Statistics 22软件进行数据分析,选择单因素方差分析中的邓肯模型,P<0.05表示数据间有显著性差异,使用Origin 2021进行图像绘制。
2 结果分析
2.1 PHP对冻藏凡纳滨对虾水分变化的影响
解冻损失率是评定冷冻水产品保水性能的重要指标。不同处理方式对冻藏虾仁解冻损失率的变化如图1-A所示。0～30 d,各组解冻损失率均呈现显著上升趋势(P<0.05),经去离子水处理的虾仁在冻藏后产生较高的解冻损失率,与PHP处理组存在显著差异(P<0.05),表明PHP处理可降低冻藏虾仁的解冻损失率,增强保水能力。出现这一结果的原因可能是PHP附着在虾仁表面形成保护膜,阻碍水分流失;此外糖类含有的羟基可以与肌肉中蛋白质极性氨基酸残基发生氢键,阻止肌肉组织内游离水分子之间的结合,并进一步抑制蛋白质周围冰晶多晶态的生长和聚集,从而减少冷冻肌肉的解冻损失率,提高持水性能[19]。本研究中坛紫菜多糖提取得率为13.75%,分子质量为283.89 kDa,其作为水溶性多糖,可能与虾仁内部水分相互作用,抑制冰晶生长与重结晶,进而减少冰晶带来的机械损伤。离心损失率也是衡量冷冻水产品持水性能的另一重要指标。离心损失率越大,则丢失水分越多,冰晶对肌肉组织的破坏也越严重[20]。如图1-B所示,冻藏条件下所有处理组的离心损失率均呈显著上升趋势(P<0.05),去离子水处理组离心损失率明显高于其他各组,失水率最高。冻藏15 d后,与去离子水组相比,PHP处理产生更小的离心损失率,说明PHP能提高冻藏虾仁的保水性能,减少冰晶对肌肉组织造成的损伤。PHP能够减小冰晶对肌肉组织的破坏可能是由于其可以与肌肉组织当中的蛋白质相互作用,限制住自由水的流动,从而减少大冰晶的形成,更好地保护虾仁肌肉组织[19]。
A-解冻损失率;B-离心损失率
图1 PHP对冻藏虾仁水分变化的影响
Fig.1 Effect of PHP on moisture change of frozen shrimp
注:不同大写字母表示相同处理方式不同冻藏时间的数据有显著差异,不同小写字母表示相同冻藏时间不同处理方式的数据有显著差异(P<0.05)(下同)。
2.2 PHP对冻藏凡纳滨对虾理化指标的影响
颜色是反应水产品品质最直观的参数,不同处理方式对冻藏虾仁L*值、a*值、b*值的变化见附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.039317)。如图2-A所示,冻藏条件下虾仁表面逐渐变暗、变红,引起L*值、a*值、b*值发生变化,导致色差ΔE呈现上升趋势,表明虾仁品质正不断劣化。冰晶生成给肌肉组织带来机械损伤,随着水分流失增加,造成色素不断丢失,这是导致虾仁表面变暗的原因之一;此外由于冻藏时间延长,假单胞菌属、希瓦氏菌属和嗜冷菌属活性逐渐增强以及蛋白质、脂质等营养物质的氧化也是引起黑变的重要因素[21]。虾仁内部蛋白质的变性降解破坏了原有的化学键,使虾青素显现原本的桔红色,引起虾仁体表颜色变红。冻藏20 d后,5 mg/mL PHP组与10 mg/mL PHP组色差ΔE显著低于空白组(P<0.05),推测原因可能是PHP与水分子结合,降低冰晶带给肌肉的机械损伤,减少蛋白质降解,延缓冻藏虾仁颜色劣化,从而维持冻藏期间虾仁的品质。pH值是用来评价新鲜度的重要指标。如图2-B所示,新鲜虾仁各处理组pH值无显著差异(P>0.05),但随着时间延长,均呈现先降后升的趋势。0～10 d内,虾仁内部糖原的无氧酵解生成酸性物质导致pH值降低;10～30 d内各处理组pH值持续升高,这可能是内源酶和微生物共同作用的结果,其自溶机制产生大量的碱性化合物,它们的积累导致冻藏期间虾仁的pH值显著增加[22]。整个冻藏周期内,5 mg/mL PHP组与10 mg/mL PHP组pH值显著低于去离子水组(P<0.05),可能是由于坛紫菜多糖自身所具有的抗菌特性可以减缓或抑制微生物活性,防止蛋白质水解,减少碱性物质的产生,因而延缓了pH值升高[16]。
A-色差值;B-pH值
图2 PHP对冻藏虾仁理化指标的影响
Fig.2 Effect of PHP on physicochemical indexes of frozen shrimp
硬度、弹性是评价水产品品质的常用物理指标。由图3-A可知,各处理组硬度在冻藏过程中呈现下降趋势,这可能是因为冻藏过程中冰晶的生长促使肌原纤维蛋白之间的间隙不断增大,破坏了肌纤维原有的组织结构,给肌肉组织带来不可逆的机械损伤,从而引起水分流失、加速蛋白质劣化,导致硬度降低[23]。新鲜状态下各个处理组的硬度无显著差异(P>0.05);5～30 d,5 mg/mL PHP组与10 mg/mL PHP组硬度均显著高于去离子水组(P<0.05),推测原因是PHP能保护肌原纤维蛋白,抑制冰晶的生成与重结晶,降低肌肉组织受到的损伤,因此能更好维持冻藏虾仁的硬度[19]。由图3-B可知,各处理组弹性在整个冻藏周期内也整体呈现下降趋势,这可能是因为虾仁在水解酶作用下,肌动球蛋白与结缔组织蛋白发生降解导致肌肉组织空间结构不断松散,从而逐渐丧失弹性[23]。0～10 d,各处理组弹性下降速率明显增加,这可能是因为冻藏前期微生物与酶仍保持较高活性,不断降解结构蛋白,加速弹性下降;10 d以后,各处理组弹性下降速率逐渐变缓,可能原因是冻藏后期微生物与酶活性受到抑制,延缓了弹性下降。整个冻藏周期中,5 mg/mL PHP组与10 mg/mL PHP组弹性显著高于去离子水组(P<0.05),表明PHP能够有效维持冻藏虾仁的质构特性,更好地保留虾仁原本的弹性。
A-硬度;B-弹性
图3 PHP对冻藏虾仁质构特性的影响
Fig.3 Effect of PHP on texture properties of frozen shrimp
丙二醛是脂质氧化分解的重要产物,其含量可反映脂质氧化程度。由图4可知,各处理组丙二醛含量在整个冻藏周期中总体呈现上升趋势。脂质氧化是肉类贮存过程中丙二醛含量上升的主要原因,即使在冻藏条件下,也容易发生脂质氧化产生自由基,造成丙二醛含量升高,导致冷冻水产品变质[24]。此外,丙二醛作为脂质氧化过程中的中间产物,随着脂质的进一步氧化,丙二醛容易被氧化成其他物质,导致丙二醛含量出现波动[25]。虾仁内部的冰晶不断生长,温度的波动不断使小冰晶积聚生成大冰晶,从而加剧脂质的氧化,造成冻藏末期丙二醛含量进一步升高[26]。随着冻藏时间延长,PHP处理组虾仁丙二醛含量显著低于去离子水组(P<0.05),说明PHP处理具有降低脂质氧化的效果,原因可能是PHP具有较强的抗氧化能力,可以清除冻藏期间产生的自由基,从而延缓了丙二醛含量的升高[15]。
图4 PHP对冻藏虾仁丙二醛含量的影响
Fig.4 Effect of PHP on malondialdehyde content of frozen shrimp
2.3 PHP对冻藏凡纳滨对虾蛋白质氧化的影响
羰基含量可用来判断蛋白质的氧化程度,是评定冻藏水产品新鲜度的重要化学指标[22]。由图5-A可知,各处理组羰基含量在冻藏期间均呈现显著上升趋势(P<0.05),这可能是因为水产品在冷冻贮存过程中,肌原纤维蛋白的氧化会形成羰基化合物[27]。除此以外,脂质氧化产生的自由基也会促进蛋白质氧化,加速羰基化合物的形成。在整个冻藏周期中,PHP处理后的虾仁羰基含量显著低于去离子水组(P<0.05),表明PHP能够减少羰基化合物的生成、维持肌原纤维蛋白的稳定性。这是因为PHP具有较强的抗氧化能力,能够清除冻藏过程中产生的自由基,而且PHP还可能与蛋白质结合,通过抑制冰晶的生长与重结晶来减少肌肉组织的机械损伤,从而有效维持冻藏虾仁的品质。冻藏过程中肌原纤维蛋白巯基氧化后形成二硫键,导致含量减少,因此总巯基含量可反映蛋白质氧化程度,是检测水产品品质的常用指标[17]。由图5-B可知,所有处理组在整个冻藏周期中总巯基含量显著降低(P<0.05),表明肌原纤维蛋白正不断被氧化。冻藏末期,PHP处理组总巯基含量与去离子水组存在显著差异(P<0.05),表明经PHP处理后的虾仁氧化程度更低。实验结果说明PHP可有效抑制总巯基含量下降,防止蛋白质氧化,这可能是因为PHP能够降低肌原纤维蛋白巯基对氧化的敏感性,同时掩盖肌动球蛋白分子的反应性巯基结构,进而降低了酶活性,因此减缓了蛋白质氧化程度,延长冻藏虾仁的货架期[28]。
A-羰基含量;B-总巯基含量
图5 PHP对冻藏虾仁蛋白质氧化的影响
Fig.5 Effect of PHP on protein oxidation of frozen shrimp
2.4 PHP对冻藏凡纳滨对虾微观结构的影响
图6是不同处理方式冻藏虾仁200×苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色结果图,粉红色部分对应已染色的虾仁肌肉组织,白色部分对应细胞间隙[20]。新鲜虾仁肌肉纤维排列紧密,结构清晰完整,仅能观察到少部分的细胞间隙。随着冻藏时间延长,细胞中的冰晶不断生长与重结晶,导致肌肉纤维受到不同程度的损伤。图6-A显示的是虾仁HE染色横切面的结果,冻藏30 d后,去离子水组生成大量形状不规则的冰晶,肌肉组织被分成较小的块状,部分肌肉纤维已扭曲断裂。图6-B是虾仁HE染色纵切面的结果,与横切面类似,可以观察到虾仁肌肉细胞中形成较大冰晶,导致解冻后细胞间隙增大。相比于去离子水组,PHP处理组形成的冰晶较小,未出现较大的细胞间隙,组织结构相对完整。这可能是因为PHP可以与冰晶表面结合,通过抑制其生长来防止大冰晶对肌肉造成的机械损伤[19]。HE染色结果表明,PHP能较好地维持虾仁组织微观结构的完整性,对冻藏凡纳滨对虾肌肉组织有一定的保护作用。
A-横切面;B-纵切面
图6 200× HE染色结果图
Fig.6 200× HE staining results
冻藏虾仁真空冷冻干燥后,检测冰晶升华留下的空隙能够间接观察样品中冰晶的大小和分布,可以进一步了解冻藏条件下虾仁的组织结构变化[20]。图7是不同处理方式的冻藏虾仁300×扫描电镜结果图。虾仁扫描电镜横切面结果如图7-A所示。新鲜状态下虾仁肌肉纤维外形饱满,彼此之间只有极小的空隙;随着冻藏时间延长,肌肉纤维结构开始松散,外形逐渐干枯;到冻藏末期,空隙达到最大,肌肉纤维断裂,表面粗糙松散。图7-B显示的是虾仁扫描电镜纵切面的结果。与横切面结果类似,新鲜的虾仁肌肉纤维紧密排列,结构完整;随着时间延长,肌肉纤维之间的空隙也在不断增加;到冻藏末期,冰晶对去离子水组造成不可逆的机械损伤,肌肉纤维之间已经形成较大空隙,导致彼此之间出现分离,而PHP处理组则能较好地维持肌肉纤维之间的紧密性与完整性。这可能是因为PHP能够抑制冰晶生成,减小其对肌肉纤维的挤压,从而较好保护肌肉纤维原有的组织结构与形态[29]。扫描电镜结果表明,PHP能够减少冻藏期间冰晶对肌肉纤维的损伤,有效维持了冷冻贮藏期间虾仁品质。
A-横切面;B-纵切面
图7 300×扫描电镜图
Fig.7 300×SEM
A-去离子水组;B-1 mg/mL PHP组;C-5 mg/mL PHP组;D-10 mg/mL PHP组;E-5 mg/mL磷酸盐组
图8 各组指标相关性分析
Fig.8 Correlation analysis of the indexes of each group
结合微观结构结果,对水分指标与品质指标之间进行Pearson相关性分析,所得结果如图8所示。各处理组解冻损失率、离心损失率均与硬度、弹性、总巯基含量呈显著负相关,与色差值、pH值、丙二醛含量、羰基含量呈显著正相关(P<0.05)。在冻藏期间,水分在细胞间隙中形成的大冰晶会造成解冻时水分流失的增加,由图6、图7可知,去离子水在冻藏期间形成的冰晶最大,对肌肉组织造成的损伤最严重;由图8可知,相对于其他处理组,去离子水组水分指标对色差值、pH值、羰基含量等品质指标相关系数更高,影响最严重。综上所述,水分指标与品质指标息息相关,水分变化是导致品质下降的主要原因。
3 结论
本研究以去壳凡纳滨对虾为研究对象,探讨坛紫菜多糖对其冻藏期间的影响,从品质维持角度揭示坛紫菜多糖抗冻保水作用。实验结果表明,坛紫菜多糖处理后的凡纳滨对虾可以提高持水能力,降低解冻损失率与离心损失率;可以维持理化性质稳定,延缓pH值升高和颜色劣化,减少硬度与弹性下降;可以降低脂质与蛋白质氧化程度,延缓丙二醛含量、羰基含量上升与总巯基含量下降;可以阻碍冰晶生长与重结晶,减少冻藏过程中虾仁肌肉纤维所受到的机械损伤,维持微观结构完整性。水分指标与品质指标相关性结果表明,水分通过影响色差值、pH值、丙二醛含量、羰基含量,导致冻藏虾仁品质劣化;而坛紫菜多糖通过影响水分变化,进而维持冻藏期间虾仁的品质。结合实验结果与相关性分析可知,5 mg/mL坛紫菜多糖有望作为一款绿色抗冻保水剂应用到冷冻水产品中,为低甜、低热的抗冻剂开发与应用提供一定的理论基础和指导。
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