酱油是我国独特的调味品,以多种微生物代谢活动为基础酿造制成[1]。在酱油发酵过程中,微生物将原料蛋白质和多糖水解成小分子肽、游离氨基酸、有机酸等,再经过生物化学反应形成具有特殊色、香、味的液体[2]。国内传统酿制酱油工艺主要有高盐稀态发酵和低盐固态发酵,高盐稀态发酵工艺采用了连续封闭式发酵和高盐浓度发酵,降低了有害微生物污染的风险,但也影响了部分风味生产菌的生长,发酵产品存在风味不足的问题[3]。酱油风味的提升可通过原料优选、发酵工艺优化、菌种强化、后调配等方式进行。近年,添加功能微生物进行酱油强化发酵是一种有效可行的提升风味的手段,其中,较多使用产酯酵母进行试验。彭东等[3]分别将3株生香酵母添加至酱油中发酵,酯类风味物质分别提升了188.60%、296.13%和226.87%。续丹丹等[4]使用耐盐产香酵母菌FA-1强化发酵酱油,使其醇类和酯类物质含量提高131.05%和189.65%,并提高了酱油的香气成分种类数目。韩冉等[5]将假丝酵母添加至酱油中发酵后,酯类物质增多7种,使其达到更高的酱油等级。陈强等[6]将球形球拟酵母接种至低盐固态酱油中发酵,使总酯提升了28.40%。李学伟等[7]在低盐稀态酱油中添加2株生香酵母进行发酵后总酯提升了25.64%,乙酸异戊酯和醋酸苯乙酯等含量比例提升,风味得到改善。
然而,自然筛选的产酯酵母其酯类物质合成能力和环境耐受性未能广泛地满足不同生产需求,对菌株进行驯化、诱变是一种有效提升性能的手段[8]。目前产酯酵母诱变方法包括了紫外诱变、物理诱变、ARTP(atmospheric and room temperature plasma)诱变、航天诱变等[9]。航天诱变是一种利用太空中微重力、超真空、强辐射等特殊条件引起生物体发生遗传性变异的技术,具有突变频率高、突变幅度大、突变谱广且突变后的变异性状较稳定的优势,目前已应用于园艺作物育种和微生物育种等不同领域[10-11]。
葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)是一种产酯酵母,目前在酒类和调味品酿造工业中应用于香气提升[12]。本研究通过航天空间诱变技术,对一株来源于酒曲且有较好产酯能力的C.lusitaniae进行诱变,以期获得更适合于高盐酿造环境且产香能力有所提升的突变株,为酱油生香发酵提供优质种子资源,推动酱油酿造工业的发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
原始菌株:葡萄牙棒孢酵母,菌株编号为YJ26,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC62906。
1.1.2 材料
氯化钠、甘油,天津市永大化学试剂有限公司;葡萄糖,天津市大茂化学试剂厂;蛋白胨、酵母提取粉、技术琼脂粉、麦芽汁培养基,广东环凯微生物科技有限公司;无水乙醇,天津市百世化工有限公司。
1.1.3 培养基
YPD液体培养基(g/L):蛋白胨20,葡萄糖20,酵母提取粉10。
YPD固体培养基(g/L):蛋白胨20,葡萄糖20,酵母提取粉10,琼脂粉20。
黄豆生香培养基(g/L):黄豆粉50,葡萄糖20。
酱油发酵培养基:市售酱油中添加4 g/100 mL的葡萄糖。
1.2 仪器与设备
SHA-BAB数显冷冻水浴恒温振荡器,常州荣华仪器制造有限公司;DW-88L388 J医用低温保存箱,青岛海尔特种电器有限公司;SPL-150生化培养箱,天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司;NEOFUGE 15R高速冷冻离心机,上海力申科学仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,广州市星烁仪器有限公司;TU-1901双光束紫外线可见分光光度计,北京普析通用仪器责任有限公司;6890 N-5973气质联用仪,Agilent Technologies;SUNRISE酶标仪,帝肯(上海)贸易有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株诱变
将菌株YJ26的单菌落放入冻存管,通过航天器搭载进入航天轨道,在轨时间为67 h;轨道为大椭圆轨道,高度为324～7 970 km,期间穿越范艾伦辐射带,倾角为42.5°,舱内温度为(20±5) ℃,返回地面后加入1 mL 50g/100 mL甘油重悬菌液并分装至新的离心管,-80 ℃保藏备用。
1.3.2 突变菌筛选
使用YPD液体培养基活化诱变后的C.lusitaniae YJ26,涂布在120 g/L盐质量浓度的YPD固体培养基,28 ℃恒温培养2 d,并收集平板上所有单菌落进行下一步实验。同时,将相同菌体浓度的菌液涂布在不额外加盐的YPD固体培养基,统计各平板上长出的菌落个数,按公式(1)计算致死率:
致死率/%
×100
(1)
1.3.3 菌株耐盐测定
不同突变株的单菌落分别接种到YPD液体培养基中,28 ℃、150 r/min振荡培养48 h。用无菌水将菌液稀释至106 CFU/mL,以10%的接种量分别接入到120、140、160、180、200 g/L的YPD液体培养基,28 ℃、150 r/min振荡培养7 d,用酶标仪测定OD600值。
1.3.4 菌株发酵力测定
按10%接种量接至麦芽汁培养基中(菌液浓度为106 CFU/mL),在28 ℃下培养。每24 h称量CO2失重量。以CO2失重为纵坐标,发酵时间为横坐标,绘制发酵力曲线,并比较菌株发酵力的强弱。
1.3.5 黄豆生香培养基产酯测定
取突变菌株和原始菌株的单菌落,分别接种到YPD液体培养基中,28 ℃、150 r/min振荡培养48 h。将活化好的菌液倒入离心管中,8 000 r/min离心10 min。弃掉上清液后用无菌水洗涤,8 000 r/min离心10 min,重复2次。用无菌水将菌液稀释至106 CFU/mL,以10%的接种量接入到发酵产香培养基的锥形瓶中,28 ℃培养3 d后对其进行挥发性酯类物质定性与定量检测。
1.3.6 酱油生香发酵
将发酵产香筛选出的菌株活化,扩大培养并配制种子液(106 CFU/mL)。以10%接种量接种到酱油发酵培养基中,28 ℃静置发酵7 d。发酵结束后,10 000 r/min,10 min,取上清液备用。
1.3.7 顶空固相微萃取检测
称取NaCl于气质进样瓶中,移取已离心好的发酵液样品于气质进样瓶中,加入内标溶液和转子,盖塞备用。将萃取针(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)在250 ℃条件下烧针15 min。搅拌加热进样瓶(调节转速使转子能够稳定搅拌样液,调节温度稳定在45 ℃),插入已老化的萃取针,并将内管按出,吸附萃取50 min。
1.3.8 GC-MS分析
吸取待测液至容量瓶中,用60%乙醇定容,再加内标溶液(乙酸正戊酯),振荡机混匀,移取到棕色气相瓶中。
气相色谱条件:色谱柱:DB-WAX UI(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度220 ℃;进样量1.0 μL;分流比100∶1;流速1 mL/min;FID检测器温度220 ℃;氢气(H2)∶空气(O2)∶尾吹气(N2)=40∶400∶25(体积比);升温程序:起始温度30 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升温到100 ℃,保持10 min,以10 ℃/min升温到200 ℃,保持10 min。
质谱电离方式:EI电离源,离子源温度:230 ℃;开始时间电离电压:70 eV;采集模式:全扫描;质量扫描范围(m/z):50～550。
挥发物定性分析:选取匹配度>80或者峰面积百分比>1%的物质,通过查询CAS号找出对应的挥发物挥发性化合物半定量按公式(2)计算:
(2)
式中:C1,挥发性化合物质量浓度,mg/mL;C2,内标物质量浓度,mg/mL;A1,挥发性化合物峰面积,mV/min;A2,内标物峰面积,mV/min。
1.4 数据处理
利用SPSS 26软件进行方差分析,并通过多重比较字母标记法(Duncan’s)进行显著性差异分析(P<0.05)、Origin软件进行数据可视化处理。
2 结果与分析
2.1 菌株诱变与筛选
2.1.1 菌株耐盐筛选与发酵力测定
在120 g/L高盐YPD固体培养基筛选致死率为97%,共筛出8株突变菌,编号分别为YJST27、YJST28、YJST29、YJST34、YJST38、YJST39、YJST41和YJST46。
在高盐条件下菌株的生长受到抑制,为探究突变菌株的耐盐性能,采用酶标仪测定菌株生长情况,并以此对不同菌株的耐盐能力进行比较。现代高盐稀态酱油普遍的盐质量浓度为160～200 g/L[13],实验发现,原始菌不能在该盐质量浓度下生长,突变菌株YJST27、YJST28、YJST34、YJST38表现较佳,符合高盐稀态酱油生产对盐耐受能力的需求。其中,只有突变菌株YJST28、YJST34可以在180 g/L盐质量浓度的条件下缓慢生长,其他菌株则未能在此浓度下生长。另外,所有突变菌株均未能在200 g/L盐质量浓度的条件下生长。
对筛选出的菌株进行发酵力测定,如图1所示,在发酵前期YJ26的发酵力较强,其他突变菌株较弱。YJST27、YJST28、YJST34、YJST38、YJST41在整个发酵过程中CO2失重的波动不大,发酵力偏弱。发酵力低,发酵速度相对平稳,对酱油香气的形成和风味物质的积累有利。
图1 菌株发酵力测定
Fig.1 Fermentation ability of strains
2.1.2 黄豆生香培养基发酵产酯测定
总酯量为产酯酵母在生长代谢中产生酯类的总量,是用于评价菌株产香能力的标准之一[14]。在图2-a中,所有突变菌株突变菌在黄豆生香培养基发酵生产的酯类数目均高于出发菌株。其中,突变菌株YJST28和YJST34合成的酯类数目较多。另外,由图2-b可知,突变菌株YJST28、YJST34和YJST38的合成总酯量显著高于出发菌株,而其余的突变菌株产酯量与出发菌株无显著差异。突变菌株YJST28、YJST34和YJST38合成总酯量分别为1.47、0.38和0.32 g/L。总酯产量能反映酵母菌酯的合成能力,但酱油中的营养物质较黄豆培养基复杂,不同培养体系所造成的营养物质不同对产酯有较大影响。为了验证菌株是否适合应用于酱油生香发酵,需要对其在酱油中的生香特性进行研究。综合比较酯类数目、总酯量和发酵力,选择突变菌株YJST28和YJST34进行酱油生香实验。
a-酯类数目;b-总酯含量
图2 不同菌株的生香发酵酯类数目及总酯含量的比较
Fig.2 Comparison of total ester number and content between different strains
注:不同字母表示显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.2 菌株强化酱油生香发酵
2.2.1 酯类物质变化的比较
酯类物质是酱油中的香气成分之一,在发酵过程中由酵母菌能催化有机酸或醇合成不同的酯类物质[15-17],提供花香和果香,使酱油整体风味浓郁且柔和。由表1可知,添加菌株进行生香发酵后,酱油酯类物质结构发生了明显的变化。添加菌株进行酱油生香发酵后一共检出25种酯类物质,挥发性酯类物质总量排序为YJST34>YJ26>YJST28。YJST28组检出酯类物质数量较出发菌株组多9种,但相应的酯类物质含量较低,推测YJST28经诱变后耐盐能力有所提升,但其在酱油环境下的代谢能力受到限制。YJST34组与出发菌株组相比其酯类物质的种类数无显著差异,但总酯量有显著差异,提升了473.18%。与未添加菌株的对照组相比,YJST34组检出酯类物质数量减少,但酯类总量提升了2 092.13%。在YJST34组中含量提升较大的酯类物质主要有具有果香的甲酸异戊酯和丁二酸二乙酯。其次,还检测到乙酸己酯、4-羟基丁酸内酯、3-羟基丁酸乙酯与丙位壬内酯的生成,其中具有果香的乙酸己酯含量较高,占检出总酯含量的24.13%,这些物质未在出发菌株组中检出。因此,突变菌株YJST34相比出发菌株具有更优的发酵酱油产酯能力。
表1 酱油生香发酵酯类化合物检出表
Table 1 Detection table of ester compounds in soy sauce aroma fermentation
注:“空白”为不添加酵母发酵的酱油;UO(unknown ordour),表示未知气味;ND(no detected),表示未检测出;不同小写字母肩标表示差异显著(P<0.05)。
化合物名称香味描述酯类物质含量/(mg/L)空白YJ26YJST28YJST34甲酸异戊酯果香[18]ND255.14±9.26bND1 321.30±24.17a乙酸己酯果香[19]ND NDND474.50±10.34乙酸异戊酯果香[19]43.80±0.10a ND25.17±2.84bND4-羟基丁酸内酯UO1.19±0.02aNDND9.73±0.69b3-羟基丁酸乙酯果香[20]ND ND ND9.73±0.12丁二酸二乙酯果香[21]4.65±0.02c8.76±0.29b2.08±0.10d75.43±2.20a月桂酸乙酯花生香[18]1.43±0.04 NDNDND三甲基甲硅烷醇三硅甲烷氧基水杨酯UO2.03±0.02 NDNDND丙位壬内酯果香[22]7.69±0.04bND1.38±0.17c60.83±2.64a棕榈酸乙酯奶油香[23]5.84±0.04aND4.28±0.21bND亚油酸乙酯酯香[21]ND ND1.26±0.05 ND苯乙酸乙酯甜香[24]ND1.64±0.11b0.38±0.07b14.60±1.49a邻苯二甲酸二乙酯UO1.37±0.04aND0.25±0.02bND邻苯二甲酸异丁酯UO2.98±0.04aND1.83±0.07bND邻苯二甲酸二异丁酯芳香[21]9.30±0.03aND3.78±0.18bND香草酸乙酯花香[20]1.07±0.01 NDND ND邻苯二甲酸正辛酯UO6.08±0.05aND3.08±0.14bND硼酸三(三甲硅烷基)酯UOND6.30±0.94NDND壬酸乙酯果香[24]ND2.74±0.12NDND丙位辛内酯椰子香[20]ND9.86±0.27a1.57±0.12bND乙酸辛酯UOND58.58±1.12a25.17±0.39b ND丙位庚内酯坚果香[20]2.26±0.02NDND ND氯乙酸十六酯UONDND0.63±0.05 ND十八酸乙酯UONDND0.76±0.03 ND1,2-苯二甲酸1-丁基2-(8-甲基壬基)酯UONDND3.78±0.16 ND总酯89.69±0.03c343.02±11.91b75.40±2.93c1 966.12±36.87a
2.2.2 其他关键挥发性物质总量比较
酸、醇、醛是酱油中除了酯以外比较重要的几类挥发性风味物质。酸类物质本身具有酸味和特殊口感,在酱油中起到形成香气并缓解酱油咸味的作用。添加突变菌株YJST34及出发菌株发酵后的酱油中均检出10种酸类物质,数量高于未添加菌株的对照组。此外,其分别定量检出酸类物质1 603.57、369.84 mg/L,均高于对照组,且YJST34组中积累酸类挥发性物质较出发菌株组提高了333.58%。醇类物质在酱油中起到形成醇香并为酯类物质合成提供前体物质的作用。由图3可知,在突变菌株YJST34组及出发菌株组分别检出醇类物质11种和9种,数量较空白组少,总醇类物质含量分别为3 615.93、2 568.99 mg/L,均显著高于对照组。而且,YJST34组中积累醇类挥发性物质较出发菌株组提高了40.75%。醛类物质具有一定的愉悦香味,对发酵食品风味有一定影响。如图3-b所示,在突变菌株YJST34组和出发菌株组均检出醛类物质5种,数量高于对照组。定量检出醛类物质为255.5、55.02 mg/L,均显著高于对照组,且YJST34组中积累醛类挥发性物质较出发菌株组提高了364.38%。综上,空白对照组、YJ26组和YJST34组检出的酸类物质、醇类物质与醛类物质的数量无显著差异。而突变株YJST34组的总酸、总醇和总醛合成量均显著高于出发菌株组。
a-风味物质的种类数目;b-风味物质的含量
图3 酱油生香发酵其他风味物质的种类和含量比较
Fig.3 Comparison of the types and contents of flavor substances in soy sauce aroma fermentation
3 结论
本研究以一株产酯酵母C.lusitaniae为出发菌株,通过航天诱变、高盐压力、菌株发酵力比较、黄豆生香培养基产酯能力比较、酱油生香性能比较,最终获得了1株耐盐性能和产酯性能有所提高的突变菌株YJST34。突变菌株YJST34能在180 g/L盐质量浓度的YPD下缓慢生长,较出发菌株提升了28.6%的耐受能力。添加YJST34发酵7 d后酱油中酯类物质含量较出发菌株提高了473.18%,其中以提升果香味的甲酸异戊酯和丁二酸二乙酯的能力较为突出。此外,对总酸、总醇、总醛等其他风味物质含量也有一定提升能力。综上,突变菌株YJST34具备较强的耐盐能力和酱油生香能力,后续将对该菌株进行安全性比较实验、组学机理研究和进一步开发该菌株的高盐稀态酱油强化发酵工艺等。
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