五倍子树又称盐肤木(Rhus chinensis Mill.),主要分布在我国长江以南区域,如重庆、贵州、四川、湖南、云南等地,具有很高的经济价值和药用价值[1-2]。五倍子树为应对寄生蚜虫而产生的虫瘿称为五倍子,其富含单宁、没食子酸、氨基酸等成分,现已有研究表明,五倍子具有抗菌[3]、抗氧化[4]、调节肠道菌群[5]、抗炎[6]等功能活性。五倍子蜂蜜作为一种特色中草药蜜,主要由蜜蜂采集五倍子树花蜜酿造而成。成熟的五倍子蜂蜜在蜂巢中呈现深绿色,取出后则变为淡黄色或金黄色。作为重庆地区秋季的主要蜜源之一,五倍子树因其蜜源充足且产蜜稳定的特性,在重庆蜂产业中占据着重要的经济地位[7]。尽管五倍子蜂蜜的重要性不言而喻,但当前关于其挥发性成分的研究却相对不足,尤其是针对重庆地区五倍子蜂蜜的系统性分析更是鲜有报道。因此,为了更全面地了解五倍子蜂蜜的特性并挖掘其潜在价值与应用前景,有必要对五倍子蜂蜜挥发性成分进行深入研究。
挥发性化合物是评估蜂蜜质量的重要指标,也是蜂蜜成分差异的重要特征。蜂蜜中挥发性化合物主要取决于地理来源、蜜源植物种类和数量,也受到气候环境、蜂群种类、成熟阶段等因素的影响[8]。顶空固相微萃取联合气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术具有成本低、萃取效率高、灵敏度良好等优点[9],在鉴别蜂蜜的种类和产地的研究中得到广泛应用。KARABAGIAS等[10]使用该技术鉴定出癸醛、壬醛、2-甲基丁醛等15种物质,有助于地中海地区柑橘蜂蜜的地理来源鉴别;该学者[11]还采用该技术对希腊5个不同产区百里香蜂蜜挥发性物质进行定性和半定量分析,并通过化学计量学方法分析出甲酸甲酯、癸酸乙酯、甲酸和乙酸等9种挥发性物质可作为百里香蜂蜜的地理源标记物。DURU等[12]采用HS-SPME-GC-MS技术结合主成分分析(principal components analysis,PCA)和分层聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA),对来自土耳其爱琴海和地中海地区7个产地的松树蜂蜜进行研究,结果表明壬醛、壬醇、辛醇和β-大马士酮等13种物质可作为土耳其松树蜂蜜的标志物。
本研究以重庆市6个地区的五倍子蜂蜜作为研究对象,采用HS-SPME-GC-MS技术对五倍子蜂蜜的挥发性成分进行分析和鉴定,通过比较不同产地之间的物质差异并明确五倍子蜂蜜的香气特征,为重庆市五倍子蜂蜜的开发提供理论依据,为五倍子蜂蜜的深入研究提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
为保证样品真实性,本实验所用的五倍子蜂蜜样品均于盛花期直接从蜂农处采集,经简单过滤、装罐后,保存在4 ℃。样品于2023年9月采自重庆市6个区县,每个地方采集5～8个样本,分别命名为NC1-7(南川区)、YY1-5(云阳县)、PS1-6(彭水苗族土家组自治县)、SZ1-8(石柱土家自治县)、WL1-6(武隆区)、WZ1-6(万州区)。
氯化钠(分析纯),成都市科隆化学品有限公司;二苯甲酮(纯度>98%),上海阿拉丁生化股份有限公司;C7～C40正烷烃标准品,坛墨质检标准物质中心。
1.2 仪器与设备
SPME装置(100 μm DVB/CAR/PDMS),美国Supleco公司;GCMS-2010气相色谱质谱联用仪,日本岛津公司;数显式电热恒温水浴锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.3 实验方法
1.3.1 五倍子蜂蜜挥发性物质测定
参考ZHU等[13]的方法,并根据实际情况略作修改。准确称取2.000 g蜂蜜置于顶空进样瓶中,加入2 mL蒸馏水和0.20 g氯化钠,以20 μL二苯甲酮(100 mg/L)作为内标,涡旋混匀。将磁力搅拌器的速度设置为600 r/min,在60 ℃条件下平衡15 min。将装有固相微萃取纤维的手动进样器插入瓶中,60 ℃萃取40 min。萃取完成后,迅速拔出手动进样器在270 ℃解析5 min。
GC条件:DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);不分流进样;氦气流速为1 mL/min;40 ℃保持3 min,以3 ℃/min速度升温至160 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min速度升温至270 ℃,保持5 min。
MS条件:离子源温度230 ℃,离子化方式:电子轰击离子源(electron impact ionization,EI),电子能量70 eV,接口温度250 ℃,质量扫描范围25～490 m/z,四极杆检测器。
1.3.2 化合物定性定量分析
测定结果扣除因色谱柱流失和萃取针涂层掉落的硅氧烷类化合物的杂质峰后,以C7～C40正构烷烃作为碳标,根据保留时间计算目标化合物的保留指数,结合NIST17 Library谱库检索结果,匹配度>80%即判断为对应化合物,对样品中化合物进行定性。保留指数的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:RI,挥发性化合物的保留指数(retention index);n,该化合物碳标原子数;RTx,该化合物的保留时间;RTn,碳数为n正构烷烃的保留时间;RTn+1,碳数为n+1正构烷烃的保留时间。
以样品中添加的二苯甲酮作为内标物,计算各化合物峰面积与内标物峰面积的比值,对目标化合物进行半定量分析。化合物含量的计算如公式(2)所示:
化合物含量
(2)
1.3.3 五倍子蜂蜜香气分析
用气味活性值(odor activity value, OAV)和气味贡献率(odor contribution rate, OCR)对五倍子蜂蜜的香气进行分析。OAV被定义为挥发性物质的浓度与其在水中的阈值的比值,当OAV>1时,可以认为该物质是五倍子蜂蜜香气的主要贡献者。OCR是挥发性物质的OAV值与总OAV值的比值。OAV和OCR值越大,表明该物质对五倍子蜂蜜的贡献越大,可认为是关键香气物质。
1.4 数据分析
每组样品至少进行5次平行实验,实验结果表示为“平均值±标准差”。采用Origin 2021软件绘图,GraphPad Prism.8.0.2进行标准化处理,SIMCA14.1进行PCA和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA),利用IBM SPSS Statistics 23进行单因素方差分析,显著性差异分析采用Duncan检验,P<0.05表示存在显著性差异。
2 结果与分析
2.1 五倍子蜂蜜挥发性成分分析
为了充分了解五倍子蜂蜜的挥发性物质组成,使用HS-SPME-GC-MS对五倍子蜂蜜进行检测,从中鉴定出83种挥发性化合物,包括17种醇类、10种酯类、13种醛类、11种酮类、6种萜烯类、16种烷烃类和10种其他类物质。如图1所示,不同地区五倍子蜂蜜中的挥发性物质组成类别和相对含量存在较大差异,其中石柱和南川地区五倍子蜂蜜中占比最高的是醇类物质,万州地区五倍子蜂蜜中烷烃物质数量最多,而武隆和云阳地区五倍子蜂蜜则以醛类物质为主。
a-挥发性物质个数;b-挥发性物质相对含量
图1 五倍子蜂蜜挥发性物质组成
Fig.1 Composition of volatile substances in Rhus chinensis honey
根据检测结果绘制UpSet图,清楚地展示了不同组样本的挥发性成分数量、共有挥发性成分及各组特有的挥发性成分。如图2所示,6个产地五倍子蜂蜜之间有10种共有成分,分别为苯乙醇、庚醇、苯甲醛、癸醛、苯乙醛、4-氧代异佛尔酮、异佛尔酮、辛烷、反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇和2,4-二叔丁基苯酚,除癸醛外,其余9种成分在各地区样品中的含量均存在显著性差异。而南川、彭水、石柱、武隆、万州和云阳6个地区的五倍子蜂蜜中分别有5、4、8、3、8、9种特有的挥发性成分。不同组样本间挥发物分类一致且存在共有成分,表明挥发性成分组成具有一定相似性,这可能是因为实验样本均为五倍子蜂蜜,但共有成分含量存在显著差异,也说明即便是同种蜂蜜,产地不同也会导致挥发物具有一定差异性。
图2 不同产地五倍子蜂蜜挥发性成分UpSet图
Fig.2 UpSet plot of volatile substances in Rhus chinensis honey from different regions
蜂蜜收获前的各项因素如植物来源、地理位置、蜂群质量等是影响蜂蜜成分和质量的关键因素[14]。重庆地区以山地和丘陵为主,地貌结构复杂,东西部海拔可相差2 756 m[15],立体气候显著,因此尽管2个产地毗邻,但五倍子蜂蜜的物质组成差异明显。南川和石柱位于重庆市东南部,海拔高度在500 m以上,气温较其他地区更低[16],这可能是两地样本成分相似,同时与其他地区有明显差异的原因。不同气候地貌对五倍子树生长的影响以及蜂群自身代谢情况的差异,可能造成了重庆各地区五倍子蜂蜜挥发性成分的不同,而这些因素对五倍子蜂蜜成分的影响机制还需进一步研究。
醇类物质是蜂蜜中常见的挥发性成分之一,来自还原酶催化蜜蜂和污染微生物的醛或脂质的氧化分解,赋予蜂蜜花香及果香气。6个地区五倍子蜂蜜共检测出17种醇类挥发性化合物,其中石柱样品中含量最高,占其总挥发性成分的62.27%,云阳地区样品中含量最低,只占其总挥发性成分的7.38%。苯乙醇(0.09～0.30 μg/g)和庚醇(0.13～1.80 μg/g)是仅有的2种在6个地区五倍子蜂蜜中均检出的醇类化合物,各组样本间庚醇含量具有显著差异。
酯类赋予蜂蜜典型的果香味,是蜂蜜中一类重要的挥发性化合物。在所有五倍子蜂蜜样本中检测出10种酯类物质,相对含量为0.33%～10.58%,没有发现6组样本共有酯类化合物。异丁酸苯乙酯(0.01 μg/g)、辛酸乙酯(0.09 μg/g)和乙酸己酯(0.03 μg/g)仅在石柱地区样本中检测出,庚酸乙酯(0.02 μg/g)仅在万州地区五倍子蜂蜜中检出,2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯(0.30 μg/g)经检测仅存在于云阳地区样本中。
醛类化合物是蜂蜜中常见的挥发性化合物,本研究共检测出13种醛类化合物,其中南川和彭水样品均为7种、石柱和万州样品均为5种、武隆样品9种、云阳样品8种。6个产区五倍子蜂蜜中云阳地区样品醛类物质含量最高,占其总挥发性成分的70.76%,万州地区样品中含量最低,为5.96%。不同产地的五倍子蜂蜜醛类成分的组成不同,13种醛类化合物中,只有3种醛类化合物在所有样品中均检测出,分别是苯甲醛(0.21～1.40 μg/g)、癸醛(0.06～0.24 μg/g)和苯乙醛(1.12～5.35 μg/g),云阳地区蜂蜜中苯甲醛含量显著高于其他地区,石柱地区蜂蜜中癸醛含量与其他地区有显著差异,苯乙醛是五倍子蜂蜜中含量最高的醛类物质,武隆和云阳地区苯乙醛含量显著高于其他4个地区。此外,2,5-二甲基苯甲醛(0.04 μg/g)仅在彭水地区样品中检出,丁香醛A(0.09 μg/g)仅在南川样品中检出,阿托醛(0.05 μg/g)和正辛醛(0.02 μg/g)仅在云阳地区蜂蜜中检出。
酮类成分具有特征气味,且一般阈值很低,是蜂蜜的重要化合物之一,本研究检出的酮类化合物含量占总挥发性成分的7.16%～15.27%。4-氧代异佛尔酮(0.47～2.28 μg/g)和异佛尔酮(0.05～0.23 μg/g)是所有产地五倍子蜂蜜共有的挥发性化合物,4-氧代异佛尔酮是五倍子蜂蜜中含量最高的酮类物质,在石柱地区样本中含量显著高于其他地区。2-壬酮(0.08 μg/g)仅在南川地区样本中检出,5-甲基-3-(1-甲基亚乙基)-4-己烯-2-酮(0.09 μg/g)和6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮(0.01 μg/g)仅存在于彭水五倍子蜂蜜中,6-甲基-6-(5-甲基呋喃-2-基)庚烷-2-酮(0.17 μg/g)仅在石柱地区样本中检出,2-癸酮(0.02 μg/g)、苯乙酮(0.03 μg/g)和苯基丙酮(0.07 μg/g)为云阳五倍子蜂蜜独有的化合物。但这些特有化合物中仅2-壬酮和苯乙酮对蜂蜜气味有贡献。
本研究未检测出对蜂蜜香气成分有贡献的萜烯类化合物。烷烃类物质也是蜂蜜中常见的一类挥发性成分,重庆市五倍子蜂蜜中检测到烷烃类物质4～13种,石柱地区五倍子相对含量占比最高,为12.44%,其中辛烷(0.29 μg/g)是含量最高的烷烃类物质。烷烃类化合物阈值一般较高,对蜂蜜风味的贡献较小,但在特定条件下,一些烷烃可以转化为具有香气的化合物[17]。有学者认为烷烃来源于蜂蜡[18],蜂蜜中检测出烷烃类化合物可能是蜂蜡残留导致。现有研究中,蜂蜜检测出大量烷烃的现象较为常见,如飞龙掌血蜂蜜中检测到52种烷烃物质,数量占比30%[17];树参蜜中烷烃物质含量占比为9.42%[19];罗布麻和紫穗槐蜂蜜中的烷烃含量分别为31.7%和31.2%[13]。
2.2 五倍子蜂蜜差异挥发性化合物分析
2.2.1 系统聚类分析
为初步了解重庆市6个地区五倍子蜂蜜香气成分之间的差异,对检测到的挥发性物质含量进行聚类分析,结果如图3所示,在距离为0.3处可将样品聚为三类,南川和石柱地区样品为一类,彭水地区样品单独聚为一类,万州、武隆和云阳地区样品聚为一类。不同地区同种蜂蜜在气味表现上存在差异,这与已有研究结果一致[23]。
图3 五倍子蜂蜜挥发性物质含量聚类分析
Fig.3 Cluster analysis of volatile substances in Rhus chinensis honey
2.2.2 主成分分析
按照聚类分析结果对五倍子蜂蜜进行分组,即南川和石柱地区样品为一类,彭水地区样品为二类,武隆、云阳、万州地区样品为三类,以83种挥发性化合物含量为变量,通过SIMCA软件共提取到6个特征值>1的主成分,共能解释总方差的68.86%。如图4所示,前2个主成分仅共同解释了37.4%,且石柱和云阳地区样本分散程度较大。PCA是一种无监督模式识别方法,可以最大限度地提取样本之间的差异,但它无法区分差异来自于组内还是组间[24]。第三类样品主要分布在图的左侧;第二类主要聚集在中心点附近;第一类样品由于PCA没有识别组内和组间差异,分布较为分散。结果表明,PCA不能完全区分这三类样本,然而从图中能够观察到三类样品间存在分离趋势。
图4 五倍子蜜PCA样品散点得分图
Fig.4 Scattered score plot of PCA samples of Rhus chinensis honey
2.2.3 OPLS-DA
为了最大化样本组间的差异,进一步建立OPLS-DA模型,以筛选出不同产地样本间的差异物质。如图5-a所示,南川和石柱地区样品分布较为集中,云阳、万州和武隆地区样品分布较为集中,彭水五倍子蜂蜜与其他地区样品分散分布,这与聚类结果一致。图5-b显示了样本分组与挥发性成分的位置,可以直观地看出每个成分对于不同组样本的重要程度。二氢芳樟醇、橙花醚和苯乙醛等物质在荷载图中与1类样品最相近,说明这些化合物对南川和石柱地区五倍子蜂蜜相似性有重要贡献;同理,2,4-二甲基苯甲醛、5-甲基-3-(1-甲基亚乙基)-4-己烯-2-酮和丁酸酐是彭水五倍子蜂蜜的主要风味成分;十一醛、叔丁基对苯醌和苯甲醛对于区分三类样品与其他地区样品的贡献度较大。
a-得分图;b-荷载图
图5 五倍子蜂蜜OPLS-DA分析样品得分图和荷载图
Fig.5 OPLS-DA score and loading diagram of volatile components of Rhus chinensis honey
为了检验OPLS-DA模型是否出现过拟合,对模型参数进行评估(图6)。五倍子蜂蜜监督模型的R2Y为0.944,Q2为0.863,R2和Q2超过0.5表示模型拟合结果可接受;对OPLS-DA模型可预测性进行验证,左端任意一次随机排列所产生的R2和Q2分别为0.655(>0)和-0.595(<-0.05),其数值均小于右端原始值,说明该模型具有预测性可靠。
图6 OPLS-DA模型置换检验
Fig.6 Permutation verification results of OPLS-DA
通过变量重要性投影值(variable importance in project, VIP)可以判断对五倍子蜂蜜分类产生影响的关键物质。一般认为,VIP值>1时,该物质在分类判别过程中具有重要作用。图7是基于挥发性成分含量分析的6个产地五倍子蜂蜜OPLS-DA模型VIP值>0.5的变量,其中有25种VIP>1的挥发物可能有助于五倍子蜂蜜产地的分类。
图7 五倍子蜂蜜OPLS-DA模型VIP图
Fig.7 The VIP values of OPLS-DA of Rhus chinensis honey
2.2.4 聚类热图分析
为了进一步了解区分不同产地五倍子蜂蜜的关键挥发物,运用单因素方差分析的Duncan检验与VIP值结合,筛选出VIP值>1、P<0.05的差异化合物17种,对不同产地样本中所含的同一化合物含量分别进行标准化处理后,绘制聚类热图,直观地展现这些化合物在不同产地样本中的含量差异。如图8所示,不同产地五倍子蜂蜜的主要挥发性化合物不同,南川地区样本中大马酮、2,6-二甲基十一烷和2,6,11,15-四甲基十六烷含量高于其他地区,石柱地区样本中反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇和橙花醚含量较高,万州地区样本中二十烷含量高于其他地区,云阳和武隆地区样本中苯乙醛、壬醛、庚醛、叔丁基对苯醌和十一醛含量较高,两组样本间除庚醛外均无显著性差异。
图8 不同产地五倍子蜂蜜样品中17种差异挥发性成分热图
Fig.8 Heatmap of the 17 differential aroma compounds in Rhus chinensis honey from different regions
2.3 五倍子蜂蜜香气活性物质鉴定
在五倍子蜂蜜中共检测到28种挥发性物质有香气阈值(表1),通过计算得到对应的OAV,其中OAV>1的化合物共有20种,如表2所示。整体来看,除万州和云阳五倍子蜂蜜外,其余4个产区样品中均检测出大马士酮,虽然其含量并不高,仅为0.05～0.18 μg/g,但低阈值(0.002 μg/kg)使得大马士酮成为了五倍子蜂蜜的重要香气活性成分,其OAV和OCR值分别为25 622.99～89 682.21和92.49%～97.45%,赋予蜂蜜浓郁的苹果味、玫瑰味、甜味。而万州五倍子蜂蜜香气构成较为复杂,主要呈香物质为壬醛(OAV:394.13;OCR:33.79%)、苯乙醛(OAV:328.13;OCR:28.13%)和柏木脑(OAV:235.67;OCR:20.20%),赋予蜂蜜花香、柑橘味、甜味和轻微的雪松木味。云阳五倍子蜂蜜与万州五倍子相似,对其整体香气贡献较大的物质为壬醛(OAV:1 502.16;OCR:57.55%)和苯乙醛(OAV:713.36;OCR: 27.33%),赋予蜂蜜花香、柑橘味和脂蜡味。
表1 不同地区五倍子蜂蜜挥发性化合物含量
Table 1 Contents of volatile compounds in Rhus chinensis honey from different regions
序号CAS化合物RI阈值/含量/(μg/g)参考值计算值(μg/kg)NCPSSZWZWLYY160-12-8苯乙醇1 1161 1091 000 d0.09±0.02 a0.07±0.03a0.30±0.08 b0.23±0.04 b0.10±0.03a0.12±0.03a2104-76-72-乙基-1-己醇1 0301 030—0.04±0.02a—————3111-70-6庚醇9709745.4 c0.22±0.14a b0.79±0.25c1.80±0.61d0.59±0.15bc0.52±0.12a bc0.13±0.08a41197-01-9对甲基苯异丙醇1 1831 184———0.06±0.03a———5137-32-62-甲基丁醇7397455 500 b—0.17±0.04a0.18±0.08a0.17±0.07a——6143-08-81-壬醇1 1731 17150 d0.22±0.13ab0.44±0.06bc1.37±0.30d0.67±0.12c—0.17±0.07a71686-20-02-(4-甲基-2,4-环己二烯基)-2-丙醇1 1671 148————0.03±0.01a——82051-33-4四氢熏衣草醇1 0661 082————0.01±0.00a——929957-43-5二氢芳樟醇1 1071 102110 d4.41±0.62b—5.20±2.58b—1.30±0.31a—10544-12-73-己烯-1-醇856862———0.27±0.17a———1158175-57-82-丙基-1-戊醇1 0531 029———0.08±0.01a———1256298-90-94-甲基-2-庚醇915901—0.69±0.28a—————1354630-50-15-甲基-2-庚醇915902——1.21±0.34a1.42±0.77a———1477-53-2柏木脑1 5981 6200.5 c0.04±0.02a0.11±0.05ab0.11±0.02ab0.12±0.03b0.19±0.10c—157785-53-7(+)-α-松油醇1 1431 131—0.04±0.02a0.05±0.02a0.23±0.12b0.01±0.00a0.25±0.09b—1678-70-6芳樟醇1 0991 0970.2 c0.13±0.03a0.04±0.01a0.53±0.32b—0.08±0.03a—175715-23-13,4-二甲基环己醇1 1261 147——————0.01±0.00a醇类物质总含量4.80±2.13b2.20±0.73a9.79±2.98c1.52±0.49c1.77±0.69a0.42±0.17a酯类18101-97-3苯乙酸乙酯1 2461 241400 c——0.09±0.04b0.07±0.02ab0.03±0.01a—19103-45-7乙酸苯乙酯1 2581 252480 c0.04±0.02a0.6±0.06a1.66±0.64b0.21±0.07a0.24±0.10a—20103-48-0异丁酸苯乙酯1 3961 389———0.01±0.00a———21106-30-9庚酸乙酯1 0971 096170 b———0.02±0.01a——22106-32-1辛酸乙酯1 1961 192720 b——0.09±0.06a———23123-29-5壬酸乙酯1 2961 293——0.01±0.01a0.03±0.01a0.03±0.01a——24142-92-7乙酸己酯1 0111 01240 b——0.03±0.02a———25629-33-4甲酸己酯91487798 c—0.15±0.04a1.29±0.60b———2684-69-5邻苯二甲酸二异丁酯1 8701 858——0.01±0.01a—0.02±0.01a——276846-50-02,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯1 5881 582——————0.30±0.18a酯类物质总含量0.04±0.02a0.65±0.32a2.94±0.75b0.28±0.08c0.26±0.10a0.30±0.18a醛类28100-52-7苯甲醛96296224 c0.21±0.06a0.22±0.10a0.31±0.17a0.76±0.24b0.73±0.24b1.40±0.45c29111-71-7庚醛9019012.8 b————1.16±0.36b0.63±0.15a30112-31-2癸醛1 2061 2033.6 c0.06±0.02a0.08±0.03a0.24±0.11b0.06±0.02a0.07±0.02a0.08±0.03a31112-44-7十一醛1 3071 30410b———0.02±0.01a0.03±0.01a0.04±0.01a32122-78-1苯乙醛1 0451 0456.3 b2.09±0.90a1.12±0.15a1.3±0.65a2.07±0.36a5.35±0.88b4.49±0.98b33124-19-6壬醛1 1041 1021.1b—0.83±0.18a—0.43±0.07a2.02±0.67b1.65±0.44b3415764-16-62,4-二甲基苯甲醛1 1811 212——0.04±0.01a————3553447-45-3丁香醛B1 1541 1482 c0.03±0.01a———0.12±0.03b—3653447-47-5丁香醛D1 1691 162—0.03±0.02a0.04±0.02a0.08±0.06a—0.03±0.01a—3753447-46-4丁香醛A1 1451 140—0.09±0.04a—————385392-40-5柠檬醛1 1741 176—0.06±0.02a0.09±0.03a0.45±0.23b—0.05±0.03a—394432-63-7阿托醛1 1501 155——————0.05±0.02a40124-13-0正辛醛1 0031 0020.7 b—————0.02±0.01a醛类物质总含量2.12±1.13a1.75±0.30a2.39±1.01a2.73±1.23c6.34±4.76b8.35±1.81b酮类411125-21-94-氧代异佛尔酮1 1441 14425d1.40±0.40b1.07±0.34a b2.28±1.12c0.81±0.14a b1.48±0.41b0.47±0.13a4223696-85-7大马酮1 3621 353—0.05±0.01b——0.04±0.01a0.02±0.00a0.03±0.02a4323726-93-4大马士酮1 3861 3740.002d0.10±0.01ab0.05±0.02a0.11±0.04b—0.18±0.07c—4464149-32-25-甲基-3-(1-甲基亚乙基)-4-己烯-2-酮1 0991 148——0.09±0.04a————45689-67-86,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮1 4561 425——0.01±0.00a————4678-59-1异佛尔酮1 1241 118200 d0.05±0.02a0.06±0.01a0.15±0.06b0.06±0.02a0.21±0.05c0.23±0.07c4750464-95-46-甲基-6-(5-甲基呋喃-2-基)庚烷-2-酮1 4331 432———0.17±0.10a———48821-55-62-壬酮1 0921 090483 a0.08±0.05a—————49693-54-92-癸酮1 1931 0919 b—————0.02±0.01a5098-86-2苯乙酮1 0651 067——————0.03±0.02a51103-79-7苯基丙酮1 1101 119——————0.07±0.02a酮类物质总含量1.59±0.48a1.25±0.32a2.63±1.13b0.73±0.40c1.54±0.86a0.83±0.24a萜烯类521195-32-02,4-二甲基苯乙烯1 0901 088————0.02±0.01a——
续表1
注:阈值a b c d分别参考文献[18, 20-22];“—”,未检出;化合物含量后的不同字母代表具有显著性差异(P< 0.05)。
序号CAS化合物RI阈值/含量/(μg/g)参考值计算值(μg/kg)NCPSSZWZWLYY533382-59-01,7-二亚甲基-3,6-辛二烯930910—0.02±0.01a—0.06±0.04b———5443219-68-74-乙酰基-1-环己烯1 1491 136———0.51±0.34a———5550894-66-1(+)-α-柏木萜烯1 4001 405—0.02±0.00a0.03±0.00a0.03±0.01a0.02±0.02a0.06±0.03b—56546-28-1β-柏木烯1 4211 409—0.01±0.01a0.02±0.00a0.01±0.00a0.02±0.00a0.04±0.01a—5732543-51-4顺式-(-)-氧化柠檬烯1 1361 137——————0.04±0.02a萜烯类物质总含量0.06±0.03a0.04±0.01a0.57±0.38b0.04±0.03c0.09±0.05a0.04±0.02a烷烃类58111-65-9辛烷800803—0.15±0.01a0.30±0.03ab0.41±0.16b0.29±0.08a b0.28±0.08a b0.34±0.08b59112-40-3十二烷1 2001 214———0.11±0.09a0.1±0.04a0.04±0.03a0.02±0.00a60112-95-8二十烷2 0001 982————0.24±0.03b—0.16±0.076117301-23-42,6-二甲基十一烷1 2101 210—0.26±0.19b—0.05±0.04a0.01±0.00a——62504-44-92,6,11,15-四甲基十六烷1 7921 774—0.22±0.07b0.03±0.01a0.01±0.00a0.03±0.01—0.04±0.01a6317301-27-82,10-二甲基十一烷1 2271 228————0.01±0.00a——6417301-30-33,8-二甲基十一烷1 2281 232——0.01±0.01a0.03±0.01a0.01±0.00a0.02±0.01a—6517302-32-83,7-二甲基-壬烷1 0381 021—0.01±0.00a0.02±0.00a0.04±0.03a0.00±0.00a——6617312-55-93,8-二甲基癸烷1 1381 116————0.01±0.00a——671921-70-6姥鲛烷1 6871 662————0.02±0.01a——68192823-15-72,3,5,8-四甲基癸烷1 3181 339—————0.01±0.00a—693892-00-02,6,10-三甲基十五烷1 6331 618——0.01±0.01a———0.03±0.01a70544-76-3十六烷1 6001 612—0.16±0.08a——0.13±0.03a——7161141-72-84,6-二甲基十二烷1 3251 325———0.05±0.03a0.02±0.01a——72629-92-5十九烷1 9001 893————0.15±0.03a——7313287-21-36-甲基十三烷1 3441 328——————0.04±0.00a烷烃类物质总含量0.37±0.32ab0.28±0.12a0.52±0.25ab0.75±0.33d0.26±0.19a0.55±0.12ab其他74106-31-0丁酸酐1 1201 151——0.01±0.00a————7513679-41-93-苯基呋喃1 2261 219—————0.10±0.03a0.21±0.10b7614009-71-3顺式芳樟醇氧化物(吡喃类)1 1741 151—————0.44±0.12a—771786-08-9橙花醚1 1531 1503 000 d0.17±0.08b0.02±0.01a0.17±0.08b—0.04±0.02a—7834995-77-2反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇1 0741 070320 c1.63±0.63b0.82±0.25a b4.08±1.78c0.22±0.09a1.57±0.30b0.15±0.05a793602-55-9叔丁基对苯醌1 3301 351————0.05±0.00a0.06±0.02a0.03±0.02a8062690-65-71,2,3,5,8,8a-六氢萘1 0941 071—0.03±0.02a—————81527-84-4邻异丙基甲苯1 0221 023———0.07±0.03b0.02±0.00a——827399-49-7异丙烯基甲苯1 1171 087—0.02±0.00a0.3±0.11a———8396-76-42,4-二叔丁基苯酚1 5191 500—0.72±0.17ab0.75±0.08ab1.26±0.24b0.76±0.08ab0.74±0.14ab0.53±0.12a其他类物质总含量2.49±0.81b1.60±0.26ab4.94±2.28c0.99±0.14cd2.42±0.89ab0.87±0.28a挥发性物质总含量11.4±2.04ab7.77±1.03ab23.77±6.23c7.05±2.11c12.53±5.84b11.29±2.35ab
表2 五倍子蜂蜜主要呈香化合物
Table 2 The main aroma compounds of Rhus chinensis honey
化合物香气描述NCPSSZWZWLYYOAV∗OCR/%∗∗OAVOCR/%OAVOCR/%OAVOCR/%OAVOCR/%OAVOCR/%1苯乙醇玫瑰味、甜味b<10.00<10.00<10.00<10.02<10.00<10.002庚醇青草味e40.730.08146.900.54332.670.56109.379.3896.920.1023.520.9032-甲基丁醇辣味d——<10.00<10.00<10.00————41-壬醇玫瑰味、柑橘味a4.340.018.750.0327.320.0513.391.15——3.430.135二氢芳樟醇花香、甜味a40.130.08——47.310.08——11.800.01——6柏木脑轻微的雪松木味e85.160.17215.020.79215.430.36235.6720.20387.270.41——7芳樟醇花香、甜味c667.121.34213.630.782 660.434.46——378.770.40——8苯乙酸乙酯花香、果香e————<10.00<10.01<10.00——9乙酸苯乙酯果香、花香、蜂蜜味e<10.001.260.003.460.01<10.04<10.00——10庚酸乙酯果香、菠萝味、甜味d——————<10.01————11辛酸乙酯果香、脂蜡味a————<10.00——————12乙酸己酯果香a————<10.00——————13甲酸己酯甜味、果香a——1.480.0113.200.02——————14苯甲醛苦杏仁味、樱桃味c8.940.028.970.0312.910.0231.852.7330.250.0358.302.2315庚醛奶酪味、焦糖味b————————413.570.44226.368.6716癸醛柑橘味、果味b16.310.0322.540.0867.540.1117.261.4818.800.0222.620.8717十一醛蜡味、甜味b——————2.350.202.780.003.540.1418苯乙醛花香、玫瑰味、甜味b331.480.67177.690.65206.900.35328.1328.13848.640.90713.3627.3319壬醛花香、柑橘味、脂肪味b——755.042.77——394.1333.791 836.851.961 502.1657.55
续表2
注:香气描述a参考在线风味数据库(http://www.flavornet.org/index.html),b c d e分别参考文献[13, 21- 22, 28];“—”未检测到;*表示OAV=挥发性化合物含量/阈值;**表示OCR =化合物OAV/样品总OAV,以百分比的形式表示。
化合物香气描述NCPSSZWZWLYYOAV∗OCR/%∗∗OAVOCR/%OAVOCR/%OAVOCR/%OAVOCR/%OAVOCR/%20丁香醛B甜味、花香e13.510.03——————57.700.06——21正辛醛青草味、柑橘味a——————————34.321.31224-氧代异佛尔酮木质香味、甜味a56.160.1142.810.1691.390.1532.262.7759.300.0618.830.7223大马士酮苹果味、玫瑰味、甜味a48 545.1297.4525 622.9994.1355 912.6393.80——89 682.2195.58——24异佛尔酮薄荷味a<10.00<10.00<10.00<10.031.050.001.150.04252-壬酮热牛奶味、肥皂味、青草味a<10.00——————————262-癸酮柑橘味a——————————2.160.0827橙花醚油脂味、花香a<10.00<10.00<10.00——<10.00——28反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇甜味e5.090.012.560.0112.740.02<10.064.900.01<10.02
作为五倍子蜂蜜主要香气活性成分,大马士酮、壬醛、苯乙醛、柏木脑等也在其他蜂蜜中存在。如大马士酮被认为是土耳其松树蜂蜜的一种特征标记物[12],也在覆盆子、油菜、石南花和桤木沙棘蜂蜜中发现。苯乙醛和大马士酮是蜜露蜜中OAV最高的化合物[25]。大马士酮、癸醛、壬醛是古巴黑红树蜂蜜的主要香气化合物[26]。油菜花蜂蜜中大马士酮、3-苯基丙酸、苯乙酸、三硫二甲酯和苯乙醛的OAV最高[27]。
根据化合物的香气描述,将香气归类为花香味、果香味、甜香味、化学味、脂蜡味和清香味六类,由于香气成分的复杂性,部分物质属于多个类别。如图9所示,不同产地的五倍子蜂蜜呈现的香气特征存在差异,由于大马士酮的存在,南川、彭水、石柱和武隆4个地区样本表现出较强的果香味、花香味和甜香味,苯乙醛和壬醛使得万州和云阳地区五倍子蜂蜜也具备花香味和果香味,同时万州五倍子蜂蜜表现出清香味特征,云阳五倍子蜂蜜表现出脂蜡味的风格特点。
图9 香气特征雷达图
Fig.9 Aroma characteristic radar chart
3 结论与讨论
本研究以重庆市6个地区五倍子蜂蜜的挥发性成分为研究对象,通过HS-SPME-GC-MS方法分析其挥发性成分。在本实验条件下,不同地区的五倍子蜂蜜共鉴定出酮类、醛类、醇类、酯类、烷烃类、萜烯类等83种化合物,其中6个地区的共有挥发性成分有10种。利用化学计量学分析筛选对五倍子蜜地理来源判别模型有贡献的挥发成分作为特征性挥发成分,主要包括:彭水地区五倍子蜜的2,4-二甲基苯甲醛、6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮;南川地区样本中大马酮、2,6-二甲基十一烷和2,6,11,15-四甲基十六烷;云阳武隆地区五倍子蜜的苯乙醛、壬醛、庚醛、叔丁基对苯醌和十一醛;石柱地区样本中反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇和橙花醚。此外,对挥发性成分进行气味活性值和气味贡献值分析结果表明,28种风味活性化合物共同作用形成了本研究中重庆市6个产地五倍子蜂蜜的特征风味,其中苯乙醇、庚醇、乙酸苯乙酯、苯甲醛、癸醛、苯乙醛、异佛尔酮、4-氧代异佛尔酮和反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇是所有样本共有的甜香、花香和果香的主要呈香化合物,壬醛和柏木脑分别赋予云阳和石柱地区五倍子蜂蜜独特的脂蜡味和清香味,大马士酮则赋予其余4个产地五倍子蜂蜜苹果味、玫瑰味和甜味。
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