葡萄酒挥发性香气是葡萄酒风味的重要组成部分,是诸多评定指标中突出葡萄酒差异、决定干红葡萄酒感官特性和内在质量的重要参数,很大程度上决定了葡萄酒的风格与典型性,是影响食品质量和顾客可接受度的关键因素之一。通过对葡萄酒的香气成分进行研究,可以对葡萄酒品种特色认定、酿造工艺、酒龄及品质等方面信息的判断提供帮助[1-2]。葡萄酒香气主要包括品种香气、发酵香气和陈酿香气[3],从香气来源方面来说,品种香是葡萄酒差异特征的主要来源。葡萄香气自身具有一定的本质特性,品种间香气各异,目前在葡萄酒中已经鉴定出上千种挥发性化合物,其浓度从纳克级到毫克级不等。这些挥发性物质之间相互作用、相互影响,表现出协同或是拮抗作用,这些相互作用决定了葡萄酒最终香气[4],同时酿酒葡萄品质也还受外界气象因子(温度、光照、水分等)的影响,气象因子每年都会有不规律的变化,导致每年的葡萄品质不同,从而造成每年酿造的葡萄酒质量不同,进而影响葡萄酒的风味。陈酿作为葡萄酒生产的重要手段,也从根本上影响着葡萄酒质量风格特征。这种年份间品质变化赋予了葡萄酒独特的年份特性。研究葡萄酒挥发性香气成分,对于葡萄酒的质量控制、产品风格鉴别、真伪辨别和葡萄酒品牌塑造具有重要实际应用价值,对于地区优质管控和生产有重要意义。
天山北麓玛纳斯小产区是我国优质葡萄酒产区,作为中国首个获得酿酒葡萄小产区认证的产区备受国内外关注,发展潜力巨大,但是也面临着葡萄酒风格同质化现象较为严重的问题,因此本试验选取天山北麓玛纳斯小产区同一酿造技术生产的3个垂直年份‘赤霞珠’、‘梅洛’、‘烟73’和‘马瑟兰’葡萄酒为试样进行研究,通过测定挥发性香气成分并进行对比分析,识别小产区主栽葡萄品种葡萄酒特征香气,解析不同品种葡萄酒风味差异特征,对于优质酿酒葡萄品种选育以及提升葡萄与葡萄酒品质具有重要意义。为发掘自身独有优势,建立产区自信、风土自信、弘扬民族情怀、全方位提升产区品牌影响力提供理论基础和数据支持。
本研究共选用12款单酿型干红葡萄酒,品种分别为赤霞珠、烟73、梅洛和马瑟兰,年份囊括2020年至2022年,均为当年酿制后置于不锈钢制发酵罐中陈酿,葡萄酒样品由新疆尼雅葡萄酒有限公司提供,基本理化指标见附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038662,附表2、附表3同)。
试剂及标准品:氯化钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;C8~C20正构烷烃、香气标准品(均为色谱级),美国Sigma-Aldrich公司;4-甲基-2-戊醇,日本TCI公司。
固相微萃取装置(配SPME自动进样器)、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头,美国Supelco公司;DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱、6890 GC气相色谱、5975 MS质谱,美国Agilent公司。
1.3.1 挥发性香气成分的测定
1.3.1.1 顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)提取香气
葡萄酒中香气物质的萃取采用HS-SPME法,HS-SPME条件:准确称取1.0 g NaCl放入20 mL进样小瓶,加入10 mL酒样和10 μL作为内标的4-甲基-2-戊醇(1.038 8 g/L),迅速加盖密封。样品瓶在40 ℃、500 r/min加热搅拌30 min,然后将SPME萃取头插入样品瓶顶空部分,继续40 ℃加热搅拌30 min。SPME萃取头在GC进样口(250 ℃)解吸8 min完成进样,进行GC-MS分析。
1.3.1.2 GC-MS条件
参照文献[5]的分析条件和方法,对香气成分进行测定。色谱条件:载气(高纯氦气):纯度≥99.999%,流速1 mL/min,不分流进样,0.5 min前不分流,1 min后分流10∶1;柱温:起始温度40 ℃,恒温3 min,以3 ℃/min升温至230 ℃,保持8 min;进样口温度:230 ℃。
质谱条件:离子源温度:230 ℃;传输线温度:230 ℃;电子轰击源;70 eV;扫描范围:29~300 amu。
1.3.1.3 定性与定量分析
香气化合物定性采用自动解卷积技术对GC-MS全扫描数据文件进行解卷积分析,根据各物质保留时间以及C7~C24正构烷烃在相同色谱条件下的保留时间(retention time, RT)对比计算其相应的保留指数(retention index, RI),与标样保留指数、质谱图以及NIST Chemical WebBook文献中收录的极性柱条件下测得的保留指数比较,差值绝对值小于50的组分可定性为该化合物。
定量方法通过内标-标准曲线法进行定量,利用化学结构、官能团相似、碳原子数相近的标样香气物质对没有标样的物质的标准曲线进行半定量,样品及标准曲线均通过相同浓度的4-甲基-2-戊醇作为内标对仪器的响应状态进行矫正。
1.3.2 气味活度值(odor activity value, OAV)的计算
OAV是评价香气物质对葡萄酒整体香气贡献程度的指标[6],是由单一香气物质浓度除以该物质阈值得到。一般以OAV≥1的香气物质用于评价香气对风味的贡献程度[7],OAV的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:C为计算出的该化合物的质量浓度,μg/L;OT为指香气化合物在文献中查阅到的气味阈值。
所有样品均分别测定3次,取平均值。采用Microsoft Office Excel 2016统计数据,利用SPSS 27.0软件中的单因素ANOVA和Duncan分析进行方差分析,当P<0.05时差异显著。利用Origin 2021软件绘制堆积柱状图,利用Chiplot网站(https://www.chiplot.online)绘制花瓣图、差异性环状热图,Hiplot pro平台(www.hiplot.com.cn)绘制聚类热图、雷达图,SIMCA 14.0进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)。
利用SPME-GC-MS对不同品种及不同年份葡萄酒进行分析,依据每个物质的保留时间、保留指数及质谱信息与NIST 2014标准谱库的信息进行对比定性。如图1-a和图1-b所示,12款葡萄酒中共检测到69种香气物质,且各香气物质种类存在异同;根据其化学结构不同可分为酸类(3种)、高级醇类(18种)、醛酮类(2种)、C6/C9醇类(6种)、酯类(11种)、乙酯类(17种)、乙酸酯类(8种)、降异戊二烯类(1种)、萜烯类(2种)以及其他化合物(1种)。这些香气物质主要来源于葡萄果实以及发酵过程。香气个数最多的是YAN-21为56个,最少的为MSL-22为48个。由附表2、图1-c可知,乙酯类、乙酸酯类、其他酯类、高级醇类为含量较多的四类物质,它们为葡萄酒挥发性香气的组成做绝大部分的贡献,这与前人的研究结果一致[8]。通过计算各类化合物总质量浓度,乙酸酯、其他酯类、乙酯和高级醇均超过10 mg/L,属于发酵衍生化合物。萜类和降异戊二烯类含量较低,属于葡萄衍生化合物。葡萄酒中香气物质总体含量为429 004.87~909 372.82 μg/L,香气物质总含量最高的是MSL-20,含量最低的是YAN-22,不同品种及不同年份干红葡萄酒香气物质种类及含量差异显著。同品种陈酿时间较短,葡萄酒香气成分总含量普遍低于陈酿时间较长的葡萄酒,与前人的研究结论一致[9]。
a-香气物质个数;b-韦恩图;c-香气物质含量;d-香气物质含量占比
图1 不同单品种葡萄酒挥发性香气物质组成
Fig.1 Composition of volatile aroma substances in various wines
注:大写字母代表相同年份不同品种葡萄酒差异达到显著水平(Duncan,P<0.05),小写字母代表相同品种不同年份葡萄酒差异达到显著水平(Duncan,P<0.05)。
酯类产生于发酵或陈酿期间,来源于氨基酸和脂肪酸等物质的代谢,由醇和酸的酯化作用形成,具有愉悦的花香和果香味,适量时能烘托主体香使酒体完美[10]。总体呈现出,陈酿时间越长的葡萄酒酯类物质含量越高的趋势,其中乙酯类中的乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、癸酸乙酯,乙酸酯类中的乙酸乙酯、乙酸异丁酯,其他酯类中的γ-丁内酯、乳酸异戊酯为主要贡献物质;醇类物质是酒体醇甜和助香物质,主要来源于葡萄果实和乙醇发酵产生,为糖苷类水解、氨基酸和脂肪酸的代谢产物[11],12款酒样中CS-20高级醇含量最高(325 572.04 μg/L),其余酒样高级醇含量为288 934.59~115 065.06 μg/L,虽然高级醇通常被认为具有令人不快的香气,但有文献表明高级醇质量浓度小于300 mg/L时能够增加葡萄酒香气复杂度[12]。赤霞珠的高级醇含量高于同年份其他品种。由图1-d可知,随陈酿时间延长,酯类物质在酒样香气总量中的占比越来越高,而高级醇类的占比越来越低,通过陈酿可以更好地改善和协调葡萄酒风味。葡萄酒中的C6/C9醇类物质具有植物草本味,对葡萄酒的香气非常重要,在检测出的C6/C9醇中1-己醇(占总C6/C9醇类物质41.79%~97.12%)和2-己醇(占总C6/C9醇类物质2.88%~58.21%)含量较高,但是在整体含量中浓度较低。萜烯类化合物是以异戊二烯为基本结构单元构成的烃类化合物[13],主要来源于葡萄果实,在影响葡萄酒的花香和果香味中起着至关重要的作用,且它们的嗅觉阈值很低。萜类和降异戊二烯类作为葡萄衍生的挥发物,在发酵过程中变化不大,能保持葡萄的品种特征[14]。所测得萜烯类化合物有松油醇(9.70~18.50 μg/L)、香茅醇(8.92~14.73 μg/L)以及降异戊二烯β-大马士酮(3.75~5.86 μg/L),所测萜烯类物质占香气成分总量比例低。醛酮类与酸类物质是微生物在发酵阶段共同作用的产物,所测醛酮类及酸类物质占香气成分总量比例低,主要以糠醛(60.64~201.65 μg/L)、己酸(1 303.43~2 266.54 μg/L)、辛酸(662.44~1 222.76 μg/L)、正癸酸(374.50~532.24 μg/L)等物质为主。
差异性热图将GC-MS分析得到的香气物质进行数据可视化,如图2所示。颜色越深代表该物质在某一样品中的含量越高(空白区域为该物质未检出)。从热图中来看,乳酸乙酯、乙酸乙酯、异戊醇、苯乙醇、γ-丁内酯、异丁醇、丁二酸二乙酯等在样品间差异显著且占主导地位,通过聚类分成五类,YAN-21、ML-21、MSL-21聚成一类,ML-20和YAN-20聚成一类,CS-22、YAN-22、MSL-22、ML-22聚为一类,CS-21和CS-20聚成一类,MSL-20由于挥发性物质含量较高单独聚为一类。可以通过挥发性物质含量初步区分12款样品。
图2 不同品种葡萄酒中挥发性香味物质变化的热图
Fig.2 Thermogram of the variability of volatile aroma substances in different single-variety wines
葡萄酒整体风味属性呈现一般与酒体中的关键香气物质紧密联系。葡萄酒呈香形式较为复杂,香气物质含量高、种类多并不代表该品种酒香气突出,靠物质含量判定其关键香气成分具有局限性,还需借助OAV等因素进行进一步探讨研究[15-16]。通常认为葡萄酒中OAV>1的挥发性化合物,对葡萄酒特征香味是有贡献的[17],风味物质的OAV越高,则对物体风味物质贡献度越大。为确定众多风味化合物对葡萄酒香气的影响,对12款葡萄酒挥发性风味物质进行OAV计算[18-20]。以样品中69种挥发性香气物质浓度除以该物质的阈值,计算得到该物质的OAV并选择OAV>1的挥发性香气物质归纳其关键香气,分析酒样间风格特点差异性。
由附表3可知,所有酒样中有23种挥发性物质OAV>1,涵盖了10种结构的挥发性物质,其中降异戊二烯、乙酯类、乙酸酯类、其他酯类OAV较高。在所有样品中,具有OAV>1的挥发性香气物质最多的是YAN-21、MSL-21、CS-21、CS-20分别为21、20、19、19个。而MSL-22和CS-22较少,分别为14个和15个。从OAV>1的香气物质含量来看,ML-21(254.73)、CS-21(238.47)、YAN-21(236.23)均较高。认为这些差异性挥发性香气物质可能对判别12款不同葡萄酒的香气特征具有重要作用。12款酒样共有的关键挥发性香气物质(OAV>1)13种,为己醇、β-大马士酮、异戊醇、苯乙醇、乳酸异戊酯、己酸、辛酸、乙酸异戊醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯。β-大马士酮在所有品种葡萄酒中OAV均具有较高的表现(75.00~117.26),在高OAV的挥发性化合物中,β-大马士酮具有蜂蜜、热带水果、榅桲和苹果味,并可能通过增强乙酯的水果味间接影响葡萄酒的香气[21],使酒体呈现出浓郁的花香和果香。OAV>10的挥发性香气物质为乳酸异戊酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯,当OAV>10时认为该挥发性香气物质对葡萄酒整体香气贡献极大[22],乳酸异戊酯没有文献表明有明显的香气表现,而乙酯类物质为酒体贡献了较强的果香风味。乳酸乙酯是2020、2021年份酒样共有关键挥发性香气物质,为酒体带来果香味、奶油味和焦糖味;3-甲基丁酸乙酯、水杨酸甲酯为梅洛、马瑟兰、烟73共有关键挥发性香气物质,赋予酒体冬青、桑葚等果香味;糠醛为2020、2021年份赤霞珠和马瑟兰共有的关键挥发性香气物质,为酒体赋予花香;有文献表明β-大马士酮主要来源于品种香,其余香气物质主要来源于发酵香[23]。
着重分析OAV>1的香气物质,将相同香韵的OAV进行分类加和求平均值绘制香气特征雷达图。将香气归类为花香、果香、化学味、脂肪味、植物味五类,由于物质的复杂性,部分物质分属于2种类别。如图3所示,12款酒样表现出不同的风格特点,赤霞珠品种表现出较强的化学味和花香以外各方面表现较为均衡、烟73品种表现出脂肪味和果香味较重的风格特点,梅洛品种则在果香和花香表现更佳,马瑟兰品种相较于其他品种表现出更强的植物味特征。
图3 香气特征雷达图
Fig.3 Radar map of aroma characteristics
以69个香气组分作为因变量,不同酒样作为自变量,进行OPLS-DA分析,可以实现对于12款葡萄酒的区分,本次分析中的自变量拟合指数(R2X)为0.951,因变量拟合指数(R2Y)为0.980,模型预测指数(Q2)为0.960,说明模型可以反映样品间香气成分的总体情况。如图4所示,不同品种及不同年份12款葡萄酒被明显区分,YAN-20、ML-20、MSL-20位于第一象限;YAN-21、YAN-22位于第二象限;CS-22、ML-22、MSL-22位于第三象限;ML-21、MSL-21、CS-21、CS-20位于第四象限。除烟73以外,主要以年份因素进行聚类,年份因素较品种因素对葡萄酒香气风格影响更大,烟73的品种香更为突出,组内较为聚集,组间存在较好的分离度,不同品种及不同年份葡萄酒香气风格特征各异。
图4 OPLS-DA结果
Fig.4 OPLS-DA results
利用置换检验对OPLS-DA模型的可靠性进行验证(n=200),如图5所示,左边随机排列产生的实验值均低于最右边的R2和Q2试验值,Q2回归线与纵轴的相交点<0,说明OPLS-DA判别模型不存在过拟合现象且稳定可靠,模型验证有效,认为该结果可用于葡萄酒的鉴别分析。
图5 模型交叉验证结果
Fig.5 Model cross-validation results
通常用变量投影重要性因子(variable importance projection, VIP)来选择OPLS-DA模型中的要素。如图6所示,本模型中33种VIP>1的关键化合物可以用于区分不同样品的差异值,分别为:己酸甲酯、苯甲醇、水杨酸甲酯、仲丁基甲醇、1-庚醇、反式-3-己烯-1-醇、2-乙基-1-己醇、己酸异戊酯、2,3-戊二酮、顺式-3-己烯-1-醇、2-糠酸乙酯、乳酸异戊酯、癸酸,2-甲基丁酯、苯乙醇、1,3-丙烯二乙酸酯、3-甲基-1-戊醇、3-羟基丁酸乙酯、β-大马士酮、己酸己酯、2,3-丁二醇、香茅醇、1-壬醇、水杨酸乙酯、反式-2-己烯-1-醇、乙酸异丁酯、己酸、顺式-2-己烯-1-醇、异戊醇、糠醛、1-己醇、正癸醇、壬酸乙酯、乙酸己酯。VIP筛选与OAV筛选在方法论上存在差异。VIP筛选是在OPLS-DA模型框架内,评估各变量对模型建立的贡献度。而OAV筛选则依据各化合物的浓度与感知阈值,来评定其对香气的潜在贡献。尽管2种筛选方法所得结果存在一定程度的交集,但是基于VIP结合单向多变量分析能够更为高效地识别出具有显著差异的特征风味化合物[24]。筛选出的香气物质对葡萄酒香气具有重要贡献,是区分葡萄酒香气特征的重要参考指标,决定着不同品种及不同年份葡萄酒香气风格走向。
图6 VIP值
Fig.6 VIP values
为更深入地探究12款干红葡萄酒特征挥发性风味物质差异,依据33种VIP>1的特征挥发性香气化合物的浓度绘制热图,进行热力图聚类分析,结果如图7所示。颜色深浅表示物质浓度大小,含量越大颜色越深(红色为上调,蓝色为下调)。
图7 差异聚类热图
Fig.7 Differential clustering heatmap
图上部的分层树状图由不同品种及不同年份共12款葡萄酒组成,聚成四类:第Ⅰ类由YAN-22、YAN-20、YAN-21组成,说明烟73的品种香气特征最为明显,能明显区别于其他酒样;第Ⅱ类由MSL-20、CS-22、MSL-22组成,说明年份越近的马瑟兰和赤霞珠的香气风格比较相似,受3-羟基丁酸乙酯、β-大马士酮影响;第Ⅲ类为CS-21、ML-21、MSL-21组成,可能是由于当年的气候因素,以年份特征为主进行聚类,主要受2-糠酸乙酯、糠醛、2-乙基-1-己醇、1-己醇浓度的影响;第Ⅳ类由ML-20、CS-20、ML-22组成,说明年份越长的梅洛和赤霞珠的香气风格相似,受苯乙醇、异戊醇浓度的影响较大。说明在一定程度上,可以利用这些指标对葡萄酒的品种及陈酿年份进行划分。
传统香气品质评价采用感官方式进行,但葡萄酒香气取决于许多因素,如气候、地区、葡萄栽培方式、葡萄品种、酵母和酿酒技术[25]。葡萄酒中已鉴定的挥发性香气成分有1 000多种,主要以醇、醛、酸、酯等类型为代表,所有芳香化合物可以在每个类型葡萄酒特征风味中发挥作用[26],反映葡萄酒风格和特色[27]。且由于受品鉴员主观因素以及客观(品尝条件)影响,其无法准确量化葡萄酒品质及风格特色,难以展现葡萄酒真正的风味。因此品质评价需要向快速便捷方向发展,提高效率和减少成本是重中之重。基于挥发性化合物分析的多种方法已经被应用于葡萄酒差异性和分类研究[28],通过数据分析和模式识别挖掘葡萄酒典型地域风格特色、筛选特征香气从而展现产区特色和风格。本研究通过对天山北麓玛纳斯产区不同品种及不同年份12款干红葡萄酒的香气成分组成及含量进行对比分析,揭示两者间的差异性,并筛选出一些具有显著贡献度的关键特征物质。结果表明,12款葡萄酒中香气物质的组成和含量存在一定差异,同年份不同品种香气物质含量呈现:马瑟兰>赤霞珠>梅洛>烟73的趋势,这与张燕[29]的研究结果一致。赤霞珠品种中醇类物质含量最高,其次为酯类物质,决定了赤霞珠品种葡萄酒的香气轮廓,与陈璐等[30]的研究一致。
对葡萄酒香气的质量和特性而言,相较于葡萄酒中其他香气物质,品种香起着更为重要的作用。葡萄品种决定酿酒的特性,在发酵过程中,芳香前体物质与酵母产生一系列生物化学反应,最终酿造出独具风格的葡萄酒。从化学角度看,造成葡萄酒不同风味的原因在于其香气物质组成、含量占比以及OAV的差异[31]。本研究结合OAV对12款葡萄酒进行分析,筛选出23种对葡萄酒香气贡献明显的物质,根据香气类型评价葡萄酒风味轮廓,可分为花香、果香、化学味、脂肪味、植物味五类。戊醇是赤霞珠品种独有的香气物质,且含有异戊醇OAV最高,这是造成赤霞珠品种独有化学味风格的原因,β-大马士酮是葡萄酒中最典型的萜烯类化合物之一,具有强烈的花香,赤霞珠和梅洛的β-大马士酮OAV平均值分别达100.65和103.07,显著高于马瑟兰(84.90)和烟73(92.05)。何少华等[32]对贺兰山东麓产区梅洛和赤霞珠的香气特征进行了分析,结果表明,梅洛葡萄酒的花香味和梨类香气较为突出,而赤霞珠葡萄酒的化学味和蘑菇/橡胶等香气类型较为突出,与本研究结果一致。在不同产区,葡萄品种依然是主导葡萄酒香气轮廓的主要因素。4个不同葡萄品种所酿葡萄酒的风格各异,香气表现良好,在该产区具有酿造优质葡萄酒的潜力。
目前大部分葡萄酒企业将使用颜色表现好的葡萄酒对基酒进行调配视为解决葡萄酒颜色稳定性差的有效措施[33]。烟73和马瑟兰品种作为国内企业常作调配使用的染色葡萄品种[34]。关于颜色以及酚类物质组成的研究较多,鉴于在调配过程也会对葡萄酒风味产生很大程度的影响,故本研究对烟73和马瑟兰品种的香气成分进行分析,发现2个品种葡萄酒的香气种类和组成比例随着陈酿时间的延长,变化趋势基本一致。烟73品种表现出脂肪味和果香味较重的风格特点,主要的呈香物质是3-甲硫基丙醇、己酸、辛酸、癸酸乙酯和乙酸异戊酯,且与同年份其他品种对比中,香气成分总含量最低;而马瑟兰品种相较于其他品种表现出更强的植物味特征,顺式-3-己烯酸乙酯和己酸乙酯是其主要的呈香物质。应用不同品种葡萄酒进行调配,是葡萄酒企业开发新风格葡萄酒产品的重要手段[35],而在调配过程中如何达到颜色、香气和口感的协调,需要更多此类型的研究提供数据参考。
本研究基于玛纳斯小产区同一酿造技术生产的3个年份、4个品种共12款干红葡萄酒的挥发性香气物质建立了OPLS-DA模型,以期实现不同品种及不同年份酒样的有效区分。12款酒样共鉴定出69种挥发性香气化合物,其中酸类3种、高级醇类18种、醛酮类2种、C6/C9醇类6种、酯类11种、乙酯类17种、乙酸酯类8种、降异戊二烯类1种、萜烯类2种以及其他化合物1种,OAV>1的有23种。12款酒样在挥发性香气物质数量、含量以及特征香气贡献上均有不同,不同年份及不同品种葡萄酒香气风格特征各异。采用OPLS-DA分析方法进行判别模型的建立能够有效区分12款葡萄酒,主要以年份因素进行区分,年份因素较品种因素对葡萄酒香气风格影响更大。筛选出VIP关键化合物33种,为解析不同品种葡萄酒风味差异特征以及挖掘玛纳斯小产区葡萄酒的质量风格特征提供参考依据。由于香气成分可能受到其他因素的影响,还需进一步控制变量并增加实验样本,同时本课题组在后续的研究中,将进一步结合酚类物质、矿物质元素等数据,为探寻玛纳斯小产区葡萄酒的质量风格特征提供参考依据。
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