发酵香肠是一种通过接种发酵剂制成的传统肉制品,因其独特的风味受到消费者的喜爱[1]。这种独特的风味主要与发酵香肠制作过程中使用的发酵剂、配料以及环境温度有关[2]。传统的发酵香肠主要采用自然发酵的方式进行发酵,但自然发酵对发酵香肠风味形成的影响是不确定的,因此接种发酵剂成为一种可控的风味形成手段[3]。添加马克斯克鲁维酵母B3可以改善发酵香肠的品质[4],但马克斯克鲁维酵母B3发酵香肠风味变化规律尚需进一步探究。
气相-离子迁移色谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)作为一种新兴的挥发性风味物质检测技术,与传统GC-MS检测手段相比,具有灵敏度高、可视化、成本低以及能有效区分不同样品等优点[5],目前已应用于食品风味评价和挥发性有机化合物的测定。张香美等[6]初步利用GC-IMS探究了发酵香肠制作过程中挥发性风味物质的变化规律;NIE等[7]利用GC-MS结合GC-IMS通过主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriiminate analysis,PLS-DA)更全面、可靠地获得了发酵过程中挥发性有机化合物的全面信息。LI等[8]测定了普洱茶发酵过程中的差异化合物,并使用热图对其进行了可视化处理。CHEN等[9]通过对切碎辣椒的菌群与挥发性风味成分进行可视化处理,揭示发酵过程中微生物群落与风味化合物之间的潜在关系。目前对发酵过程中风味的监测尚无一种直观、简便的手段,因此将发酵过程中的关键特征挥发性有机化合物进行可视化处理对相关发酵产品风味特征的监测至关重要。
因此,本研究通过确定马克斯克鲁维酵母B3发酵过程中的特征挥发性有机化合物,探究发酵过程中特征挥发性有机化合物的动态变化规律,为马克斯克鲁维酵母发酵过程中的风味特征动力学研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜猪肉,石家庄市北国超市;恒康精制天然猪肠衣,北京京东世纪贸易有限公司;YPD液体培养基,青岛海博生物技术有限公司;MRS培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司。
植物乳植杆菌Z43、马克斯克鲁维酵母B3均由河北经贸大学生物科学与工程学院益生菌研究室分离并保存。
1.2 仪器与设备
3K15离心机,德国Sigma公司;FlavourSpec®风味分析仪,德国G.A.S公司;WAX色谱柱,美国RESTEK公司。
1.3 实验方法
1.3.1 低盐发酵香肠的制作
低盐发酵香肠的制作参照康晶等[10]的实验方法稍作修改,食盐添加量为1%(质量分数):将植物乳植杆菌Z43以1%的接种量接种于MRS液体培养基中37 ℃静置培养14 h;马克斯克鲁维酵母B3以1%的接种量接种于YPD液体培养基中37 ℃、150 r/min培养14 h,4 ℃、6 000 r/min离心10 min,弃上清液,用无菌生理盐水洗涤2～3次后重悬[4]。实验分为4组,其中0、1、2、3 d组分别为发酵0、1、2和3 d的发酵香肠。其中植物乳植杆菌Z43与马克斯克鲁维酵母B3的接种量均为1×107 CFU/g,将接种完成的发酵香肠置于37 ℃恒温培养箱中进行发酵。
1.3.2 挥发性有机化合物的测定
挥发性有机化合物的测定方法参考之前的研究[11]。使用FlavourSpec®风味分析仪进行挥发性风味物质测定。取3.0 g样品置于20 mL顶空瓶中,在60 ℃条件下,以500 r/min的转速孵育20 min后进样。顶空进样单元的设定条件为:进样体积500 μL、进样针温度85 ℃。每组发酵香肠平行测定3 次。
气相色谱相关参数为:WAX色谱柱,柱长30 m,内径0.53 mm,膜厚1 μm。色谱柱温度为60 ℃、IMS温度为45 ℃、载气为N2、分析时间30 min。载气起始流速为2 mL/min、10 min增为10 mL/min、20 min增为100 mL/min,直至分析结束。
本实验采用C4～C9正构酮为标准品进行定性,建立标准曲线。
1.3.3 感官评价
感官评价在20～24 ℃的温度下进行。感官评定由10名食品专业人员(5男5女)组成的小组完成,他们均按照GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范》进行了统一培训。感官评价标准参考曹辰辰等[12]并稍作修改,具体评分标准见表1。
表1 发酵香肠感官评分
Table 1 Criteria of sensory evaluation for fermented sausage
评分/分颜色气味组织状态滋味7～10表面鲜亮,肉馅呈鲜艳的玫红色具有发酵香肠特有的气味切面致密,肉馅结合紧密、界面清晰味道纯正,有醇香味,后味饱满,无刺激,咸淡适中5～7表面有轻微光泽、肉馅呈现粉红色发酵香味较淡切面较致密,肉馅较为松散、界面不清晰味道平淡,后味欠饱满,略有香味,咸淡适中,有酸味3～5肉馅呈现褐色、几乎无光泽没有发酵香味肉馅松散发酵味不纯、无香味、有苦味或其他刺激味道0～3产品无光泽无发酵香味、有异味切面松散、中心软化酸味过浓、有其他刺激味道
1.4 数据处理
本文所有实验均重复3次,数据均采用SPSS Statistics 26软件进行显著性分析,并以平均值±标准差的形式呈现;使用Excel、Chiplot、SIMCA 14.1进行数据处理及绘图。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中挥发性有机化合物差异分析
2.1.1 发酵过程中挥发性有机化合物分析
本研究采用GC-IMS测定了发酵过程中发酵香肠的挥发性有机化合物,并利用FlavourSpec®自带插件 Reporter 绘制了挥发性风味物质的二维光谱图。如图1所示,整个光谱代表了低盐发酵香肠在发酵过程中的所有挥发性有机化合物。反应离子峰两侧存在所有光点均代表挥发性有机化合物,其中红色代表化合物的含量较高,且颜色深度与挥发性有机化合物的含量呈正相关[13]。
图1 不同发酵时间发酵香肠的GC-IMS二维谱图
Fig.1 Two dimensional GC-IMS maps of fermented sausages at different fermentation periods
为直观感受不同发酵时间低盐发酵香肠挥发性有机化合物的差异,利用Reporter插件对不同发酵时间发酵香肠的二维谱图进行差异化分析。以0 d发酵香肠的挥发性有机化合物作为对照组,扣除其峰体积,计算不同发酵时间低盐发酵香肠的挥发性有机化合物的差异。其中,在差异谱图中红色代表挥发性有机化合物的含量高于0 d发酵香肠,蓝色代表含量低于0 d发酵香肠[14]。由图2可知,在发酵过程中,大多数挥发性有机化合物的含量逐渐增加,3 d发酵香肠挥发性有机化合物的含量较为丰富。由图1和图2可知,通过GC-IMS可以将不同发酵阶段发酵香肠的挥发性有机化合物很好地分离,且不同发酵时间的挥发性有机化合物的含量具有明显差异。
图2 不同发酵时间发酵香肠的GC-IMS二维谱图差异比较
Fig.2 Two differences dimensional GC-IMS maps of fermented sausages at different fermentation periods
为将不同发酵时间低盐发酵香肠的挥发性有机化合物的差异可视化,利用Gallery插件选取3次平行的所有峰进行指纹图谱对比。由图3可知,本研究检测并识别出31种挥发性有机化合物,其中酸类2种、吡嗪类2种、酮类6种、醇类9种、酯类8种、醛类1种、呋喃类1种、烯类1种、其他类1种。
图3 不同发酵时间发酵香肠挥发性有机化合物指纹图谱
Fig.3 Gallery fingerprint of volatile flavor compounds in sausages at different fermentation periods
注:M代表单体,D代表二聚体(下同)。
发酵过程中,各挥发性有机化合物的峰体积数值见表2。峰体积无单位,但其数值大小代表挥发性有机化合物的含量。其中各挥发性有机化合物的气味特征在气味空间(http://www.flavornet.org/flavornet.html)进行查询。
表2 不同发酵时间发酵香肠挥发性风味物质定性分析结果
Table 2 Qualitative analysis results of volatile compounds in sausages at different fermentation periods
注:同行小写字母不同,表示组间差异显著(P<0.05);M代表单体,D代表二聚体。
种类挥发性化合物保留指数保留时间/s迁移时间/ms峰体积0 d1 d2 d3 d气味特征酸类醋酸(M)1 399.9921.1361.054 045 329.95±657.91cd7 121.60±1138.44b9 477.90±601.14a10 847.00±368.32a酸味醋酸(D)1 398.4917.8351.155 49884.79±568.54c1 374.12±681.89c3 365.24±659.66b5 779.05±758.17a酸味吡嗪类2,6-二甲基吡嗪(M)1 295.8714.2691.146 59408.79±269.54d2 400.77±126.54c3 313.54±63.14b3 762.76±11.34a黄油味2,6-二甲基吡嗪(D)1 295.8714.2691.539 97424.97±0.61d1 496.51±131.04c3 456.72±64.82b6 091.98±269.57a黄油味3-羟基-2-丁酮(D)1 239.2619.6391.329 93841.133±89.04b2 116.83±293.92a803.16±34.18b545.59±98.18b黄油味、奶油味3-羟基-2-丁酮(M)1 240.1621.841.064 722 314.77±91.95b2 815.99±122.65a1 831.92±50.24c1 647.87±27.19d黄油味、奶油味酮类二异丁基酮(D)1 194.2515.461.796 8385.15±3.20d190.69±13.77c268.90±8.03b470.78±27.64a二异丁基酮(M)1 194.2515.461.337 4162.38±10.20c607.65±24.80b634.07±4.35b764.53±20.01a2-丁酮940.4208.8861.268 433.26±3.25d389.63±22.72c542.58±45.53b641.16±5.14a醚味丙酮795.1148.9371.116 734 571.89±70.11b5 459.25±222.77a5 195.26±184.72a5 273.05±75.06a酒精味异戊醇(D)1 174474.6451.498 82908.45±105.41c7 277.64±226.59b7 782.34±96.75a7 800.02±102.80a威士忌异戊醇(M)1 174.3475.3481.243 381 984.56±256.18c4 278.92±109.88a3 503.97±17.15b3 310.57±72.80b威士忌异丁醇(D)1 074.4320.5631.364 82507.23±3.74d5 891.94±69.10c6 602.96±73.10a6 293.19±78.97b乙醇味异丁醇(M)1 072317.6361.172 02370.94±40.91c1 912.41±95.18a1 514.50±113.30b1 510.39±83.23b乙醇味醇类正丙醇(M)1 035.3278.131.249 21127.38±15.17d758.60±4.57a563.66±25.82b522.84±10.93c酒精味正丙醇(D)1 031.6274.3941.109 3624.15±0.90d348.70±20.94c439.90±4.90b534.41±10.09a酒精味乙醇(D)920.3199.3451.136 332 425.10±35.39a1 310.63±41.11b1 199.61±36.20c1 036.47±12.00d甜味、烤面包味乙醇(M)905192.3471.041 65389.15±87.92a30.36±2.60b19.75±0.62b18.78±1.31b甜味、烤面包味异丙醇895.4188.1041.210 17109.61±6.42b124.77±2.33b237.83±9.23a240.21±13.45a乙酸戊酯1 168.8464.7391.312 87265.11±35.92d902.59±43.74c1 130.67±45.88b1 260.28±44.95a丁酸乙酯(D)1 023.3266.3641.562 3766.76±6.28c718.97±48.41a734.72±30.90a642.23±28.31b苹果味丁酸乙酯(M)1 029.8272.6891.193 94164.29±2.27d2 673.88±196.24c3 689.85±85.66b4 603.20±59.73a苹果味酯类丙烯酸乙酯1 013.5257.1031.135 4191.67±14.94c3 393.01±20.64a3 392.62±38.02a3 276.65±32.73b丁酸甲酯987.9234.4931.134 261 504.14±237.57b8 901.27±108.57a8 738.04±223.38a8 631.57±145.37a果香、甜香醋酸异丙酯915.5197.0891.165 196 623.91±276.71c10 427.32±236.16a8 565.50±811.62b8 536.74±1 524.74b水果香乙酸乙酯(D)862.5174.241.341 16345.33±112.75c10 873.16±257.27b12648.07±92.63a12 919.67±204.25a果香、甜味乙酸乙酯(M)882.4182.4781.102 45323.14±55.44c601.10±55.21a533.96±78.02ab448.57±68.51b果香、甜味醛类正己醛1 078.1325.1961.250 840.23±6.12c808.19±87.83b978.73±13.68a1 017.45±6.53a青草味呋喃类2-乙基呋喃949.0213.071.043 282 684.95±282.17a264.48±18.09b177.63±11.95b177.43±4.60b烯类γ-松油烯1 238.4617.6011.208 0571.74±5.94b251.67±12.54a256.17±9.06a272.86±15.02a
由图3和表2可知,在低盐香肠发酵过程中,醋酸二聚体的峰体积随发酵时间的增加逐渐上升,由发酵0 d的884.79上升到发酵3 d的5 779.05。酸类物质主要来源于发酵香肠中酯类物质的水解与氧化,赋予了发酵香肠独特的风味[15]。
2,6-二甲基吡嗪二聚体的含量在发酵过程中呈显著上升趋势(P<0.05),峰体积由发酵0 d的424.97上升到发酵3 d的6 091.98,赋予了发酵香肠黄油味[16]。
酮类物质主要由不饱和脂肪酸和氨基酸降解产生[17]。其中3-羟基-2-丁酮作为发酵香肠中常见的挥发性有机化合物之一,可以赋予发酵香肠黄油香。在香肠发酵过程中,3-羟基-2-丁酮二聚体的含量先上升后下降,发酵1 d时3-羟基-2-丁酮的含量到达最大值。
正丙醇二聚体、异丙醇二聚体与异戊醇二聚体的峰体积随发酵时间的增加逐渐增大,且发酵3 d的峰体积显著高于发酵0 d的峰体积(P<0.05),赋予了发酵香肠醇香风味。异戊醇单体、异丁醇单体、正丙醇单体的峰体积在发酵1 d时显著最高(P<0.05),当发酵时间大于1 d时,峰体积随发酵时间的增加逐渐降低,但3 d发酵香肠的峰体积均显著高于0 d发酵香肠(P<0.05),赋予了3 d发酵香肠醇香与威士忌香。同时,1、2和3 d发酵香肠中多种醇类挥发性有机化合物的峰体积显著高于0 d发酵香肠(P<0.05),这可能与微生物菌群的生理活动以及脂质氧化、氨基酸代谢等生物化学作用产生大量醇类挥发性有机化合物有关[18]。
发酵1 d时酯类挥发性有机化合物的峰体积均显著高于0 d发酵香肠(P<0.05)。乙酸戊酯、丁酸乙酯单体、乙酸乙酯二聚体的含量随发酵时间的增加峰体积逐渐上升,发酵3 d时峰体积达到最大值,赋予了发酵香肠苹果味与甜香等水果香气。
己醛的峰体积随发酵时间的增加逐渐上升,1 d发酵香肠己醛峰体积显著高于0 d发酵香肠(P<0.05),脂肪氧化与美拉德反应为发酵香肠提供了大量己醛挥发性有机化合物[19],赋予了发酵香肠迷人的青草香。
3-羟基-2-丁酮、丙酮及异戊醇单体、异丁醇单体等挥发性有机化合物在发酵前期产生,发酵1 d时达到最大;乙酸戊酯、丁酸乙酯单体、乙酸乙酯二聚体、2,6-二甲基吡嗪、醋酸、二异丁基酮、2-丁酮、正丙醇二聚体、正己醛、γ-松油烯与1,4-桉叶素的峰体积在发酵过程中逐渐上升,发酵后期达到最大值。
2.1.2 发酵过程中挥发性风味物质PCA
PCA 是一种被广泛使用的多元统计技术,用于从数据中提取重要信息,并将其表示为新的正交变量,称为主成分。PCA图直观地显示了低盐发酵香肠在发酵过程中挥发性有机化合物的差异。由图4-a可知,挥发性有机化合物的PC1贡献率为78.3%,PC2贡献率为18.1%,总贡献率为96.4%,说明结果较好,基本涵盖大多数挥发性有机化合物。其中相同发酵时间的挥发性有机化合物较为集中,2、3 d发酵香肠的挥发性有机化合物的含量差异较小,且与1、0 d发酵香肠的挥发性有机化合物的距离较远,存在较大差异。这可能与发酵前期和中期微生物代谢活跃有关[20];发酵后期挥发性有机化合物的合成主要通过生物化学作用。载荷图(图4-b)可以较为直观地反应不同挥发性有机化合物在PCA图中的贡献。如3-羟基-2-丁酮对1 d发酵香肠的贡献较大;2,6-二甲基吡嗪、乙酸乙酯二聚体和己醛等挥发性有机化合物对发酵2、3 d发酵香肠的贡献较大。
a-PCA图;b-载荷图
图4 发酵过程中挥发性有机化合物得分图
Fig.4 Score plot of volatile organic compounds in fermentation process
2.1.3 发酵过程中挥发性风味物质OPLS-DA
正交偏最小二乘判别分析(orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)是多元数据分析中的一种分类方法,是对PLS-DA 的改进[21]。在OPLS-DA模型中
为X矩阵的解释率,
为 Y矩阵的解释率,Q2表示模型的预测能力[22]。本研究中
表明本次OPLS-DA模型预测能力较好。由图5-a可知在OPLS-DA模型中不同发酵时间发酵香肠的挥发性有机化合物可以被很好地区分。证明OPLS-DA模型能够较好地获取组间差异信息,可以对不同发酵时间的低盐发酵香肠进行很好地区分。同时为防止OPLS-DA过拟合,对OPLS-DA进行200次交叉验证,见图5-b,在本次交叉置换检验中,置换模型的R2值和Q2值低于原始R2值和Q2值,且 Q2交叉值<0,证明OPLS-DA不存在过拟合现象,此模型有效。
a-OPLS-DA得分图;b-模型置换检验图;c-VIP得分图;d-特征挥发性有机化合物分布图
图5 不同发酵时间发酵香肠挥发性有机化合物种类与得分图
Fig.5 OPLS-DA analysis of volatile organic compounds in fermented sausages with different fermentation time.
为进一步体现不同发酵时间低盐发酵香肠挥发性有机化合物的差异,对OPLS-DA模型的结合变量投影重要性(variable importance projection,VIP)值进行计算,其中VIP 值>1的物质被认为是造成不同样品之间差异的主要原因[23]。由图5-c可知,本次研究中共筛选出11种VIP值>1的特征挥发性有机化合物,分别为乙酸乙酯二聚体、2,6-二甲基吡嗪二聚体、醋酸二聚体,醋酸异丙酯、丁酸甲酯、异戊醇二聚体、异丁醇二聚体、醋酸单体、3-羟基-2-丁酮二聚体、丁酸乙酯单体和3-羟基-2-丁酮单体,其中乙酸乙酯二聚体的VIP值最大,为1.917 14。
将11种特征挥发性有机化合物进行PCA分析,确定不同发酵阶段低盐发酵香肠的特征挥发性有机化合物。如图5-d所示,发酵香肠不同发酵阶段的特征挥发性有机化合物存在明显差异,如3-羟基-2-丁酮单体、3-羟基-2-丁酮二聚体是1 d发酵香肠的特征挥发性有机化合物;异丁醇二聚体为2 d发酵香肠特征挥发性有机化合物;2,6-二甲基吡嗪二聚体、丁酸乙酯单体、醋酸等是3 d发酵香肠的特征挥发性有机化合物。
2.2 发酵香肠感官评价与特征挥发性有机化合物聚类热图分析
由图6-a可知,不同组别低盐发酵香肠存在明显差异,发酵香肠的颜色、组织状态评分随发酵时间的增加逐渐上升,当发酵时间到达3 d时发酵香肠的颜色、组织状态、气味达到最大值。在发酵过程中,发酵香肠的颜色评分随发酵时间的增加而增加,当发酵时间为3 d时到达最大值(8.71);0 d发酵香肠因发酵时间较短,暂无发酵香肠独特味道,而2 d的发酵香肠发酵味道过重导致其接受度较低;当发酵时间为3 d时发酵香肠滋味评分达到最大(8.35)。结合OPLS-DA分析数据可知,特征挥发性有机化合物中2,6-二甲基吡嗪二聚体、丁酸乙酯单体、乙酸乙酯二聚体与异戊醇二聚体的含量在3 d发酵香肠种含量最高,推测上述特征挥发性有机化合物的黄油香、果香与醇香,降低了低盐发酵香肠自身的发酵味,改善了低盐发酵香肠的滋味和香气。
a-感官评价雷达图;b-聚类热图
图6 感官评价图和特征挥发性有机化合物聚类热图分析
Fig.6 Sensory evaluation map and clustering heat map analysis of characteristic volatile organic compounds
利用聚类热图可视化直观分析不同发酵时间特征挥发性有机化合物的差异性,其中红色代表特征挥发性风味物质含量较高,蓝色代表挥发性有机化合物的含量较低。由图6-b可知,在发酵过程中,丁酸乙酯单体、2,6-二甲基吡嗪二聚体、醋酸单体、醋酸二聚体、乙酸乙酯二聚体、异戊醇二聚体随发酵时间的延长含量逐渐上升,发酵3 d达到峰值;醋酸异丙酯和3-羟基-2-丁酮的含量在发酵1 d时达到最大。
综上所述,将多元统计分析结果进行可视化,可以准确、全面地展示低盐发酵香肠发酵过程中挥发性风味物质变化规律。因此利用多元可视化模型可以直观、全面了解发酵香肠发酵过程中风味成分的变化规律。
3 结论与讨论
本研究采用GC-IMS对低盐发酵香肠发酵过程中挥发性有机化合物动态变化进行的监测,通过多元可视化模型分析,快速、全面确定发酵香肠发酵过程中的特征挥发性有机化合物。
发酵过程中共检测出31种挥发性有机化合物,其中筛选出11种特征挥发性有机化合物,可以有效区分发酵香肠的不同发酵阶段。聚类热图表明丁酸乙酯单体、2,6-二甲基吡嗪二聚体、醋酸单体、醋酸二聚体、乙酸乙酯二聚体、异戊醇二聚体随发酵时间的延长含量逐渐上升。本研究通过多元可视化模型对发酵香肠发酵过程挥发性有机化合物变化规律进行了探究,证实了多元可视化模型在研究挥发性有机化合物变化规律方面的重要作用,为可视化模型在发酵过程中相关规律的研究提供了参考。
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