二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)属于ω-3系列长链中的多不饱和脂肪酸,约占所有脂肪酸的10%,对身体健康和神经发育至关重要[1-3]。DHA可以从其必需的前体α-亚麻酸中重新合成,也可以通过食物摄入。DHA摄入的形式一般有2种,一是直接食用深海鱼、海藻或从中提取的DHA;二是通过从含有α-亚麻酸的各种食物中摄取,其可在体内合成DHA[4]。DHA是一种性质活泼、稳定性差的不饱和脂肪酸。因其含有5个活泼的亚氧基导致DHA极易受环境影响,对氧气、光和热极为敏感[5-6]。氧化后的DHA不仅降低原有的生理功能、货架期缩短,而且产生对人体有害的氧化物质[7]。正是因为DHA不稳定,容易被氧化以及存在特殊的气味等因素,使其在应用上受限。为了克服这些外在因素的影响,并实现DHA在食品工业的广泛应用,通常采用稳态化技术,运载体包埋使其加强稳定性并掩盖其不良风味,减缓DHA氧化降解过程,降低其氧化程度,提高DHA稳定性和其产品品质[8]。
生物聚合物微粒具有封装、保护和递送生物活性成分的潜力,其内部由生物聚合物分子的三维空间网络结构组成,可捕获大量溶剂[9-10],蛋白质和多糖是最常见的生物聚合物[11-12]。大多两亲性蛋白可以作为乳化剂,酪蛋白酸钠(NaCas)源自酪蛋白,通过向酸性酪蛋白中添加氢氧化钠制得,是使用最广泛的蛋白质之一。多糖由于具有亲水性可以用作增稠剂和稳定剂,海藻酸钠(sodiumalginate,ALG)是一种线性阴离子多糖,具有良好的增稠、乳化和胶凝效果[13]。通过静电络合形成的NaCas-ALG微粒已成功负载姜黄素、β-胡萝卜素等功能因子,以提高这些亲脂性生物活性物质的理化稳定性、生物可及性并控制释放[1-16]。
针对易氧化的DHA,在弱酸性条件下通过静电络合构建具有良好理化稳定性、流变特性的DHA递送载体,本研究以添加了DHA乳状液微粒的牛奶为研究对象,研究乳状液微粒的pH对牛奶的物理稳定性、带电性质、颗粒大小、微观结构及流变性的影响。确定最优pH值后,研究DHA乳状液微粒添加量对牛奶的物理稳定性、带电性质、颗粒大小、微观结构及流变性的影响,确定最佳的DHA乳状液微粒添加量,探究了市售DHA牛奶与实验组DHA强化牛奶的氧化稳定性及感官评价差异,为DHA强化牛奶奠定了良好的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
市售产品(DHA含量2 mg/100 mL)、纯牛奶,内蒙古伊利股份有限公司;藻油DHA,嘉必优生物技术(武汉)股份有限公司;酪蛋白酸钠(纯度≥99%),上海麦克林生化科技有限公司;盐酸、硫酸亚铁、硫氰酸钾、甲醇均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;尼罗蓝A、尼罗红均为分析纯,上海源叶生物科技有限公司;海藻酸钠、氯化钡、异辛烷、正丁醇均为分析纯,美国Sigma公司;异丙醇(分析纯),美国Thermo Fisher公司。
1.2 仪器与设备
T-25 digital高速分散机,德国IKA集团;AH-NANO超高压纳米均质机,ATS工业系统有限公司;LUMiSizer稳定分析仪,德国LUM公司;Nano-ZS90纳米激光粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;HaakeRheoStress流变仪,美国Thermo Scientific公司;FV3000激光共聚焦显微镜,日本奥林巴斯株式会社。
1.3 实验方法
1.3.1 构建DHA乳状液微粒
称取一定量的酪蛋白酸钠和海藻酸钠,分别溶于去离子水中,在50 ℃水浴连续搅拌2 h,冷却后,于4 ℃贮存过夜以确保充分溶解,制得2%(质量分数)酪蛋白酸钠溶液和2%(质量分数)海藻酸钠溶液备用。
称取一定量的藻油DHA(油相,10%,质量分数)和酪蛋白酸钠溶液(水相,90%,质量分数),用高速分散机以15 000 r/min的转速剪切酪蛋白酸钠溶液3 min,同时将DHA缓慢倒入其中,制得粗乳液,再将粗乳液在50 MPa的均质压力下通过超高压纳米均质机3次,进一步减小液滴尺寸,制成酪蛋白酸钠稳定的DHA乳状液。然后将DHA乳状液与酪蛋白酸钠溶液以质量比1∶1混匀后再与海藻酸钠溶液以质量比1∶2混合,用2 mol/L盐酸将最终样品混合物调至不同pH值(3.5、4.5、5.5、6.5)。
1.3.2 DHA强化牛奶制备
1.3.2.1 不同pH值DHA乳状液微粒强化牛奶的制备
称取5 g制备好的不同pH值(3.5、4.5、5.5、6.5)的DHA乳状液微粒(5%,质量分数)分别加入牛奶(95%,质量分数),用高速分散机以7 000 r/min转速剪切3 min,再将DHA乳状液微粒牛奶混合物以18 MPa的均质压力下通过超高压纳米均质机3次,制得4种添加不同pH值的DHA乳状液微粒的DHA牛奶(图1)。
图1 DHA乳状液微粒强化牛奶的制备
Fig.1 Preparation of milk fortified with DHA emulsion-based microparticles
1.3.2.2 不同添加量的DHA乳状液微粒强化牛奶的制备
称取制备好的pH 4.5的DHA乳状液微粒(1%、5%、10%、15%,质量分数)分别加入牛奶(99%,95%,90%,85%,质量分数),用高速分散机以7 000 r/min转速剪切3 min,再将混合均匀的DHA乳状液微粒强化牛奶混合物以18 MPa的均质压力下通过超高压纳米均质机3次,制得4种不同添加量的DHA乳状液微粒DHA牛奶,制备过程如图1所示。
1.3.3 物理稳定性
采用LUMiSizer稳定性分析仪测定DHA牛奶的物理稳定性。LUMiSizer是一种分析型离心机,可加速诸如沉淀、絮凝或乳析之类的不稳定性现象的发生[17]。LUMiSizer稳定性分析仪记录样品离心过程中样品试管不同位置的透射率分布变化,确定样品中颗粒的迁移过程。测试参数:进样量0.4 mL,光源波长865 nm,谱线255条,时间间隔60 s,转速2 500 r/min,测试温度25 ℃,样品管PC 2 mm进行测试[18]。
1.3.4 Zeta-电位测定
采用纳米激光粒度仪测定DHA牛奶的Zeta-电位。测定样品前需要用和样品相同pH值的缓冲溶液将其稀释400倍。测试参数:折射率比1.45,平衡时间120 s,温度25 ℃,重复测定3次。
1.3.5 粒径测定
采用纳米激光粒度仪测定DHA牛奶的粒径大小。测定前用和样品相同pH值的缓冲溶液将其稀释400倍,以避免多重光散射效应。测试参数:在25 ℃条件下,折射率比1.45,平衡时间120 s,重复3次。
1.3.6 微观结构
通过激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)观察DHA牛奶的微观结构。根据LI等[19]的方法用尼罗红和尼罗蓝染料对样品进行染色。将DHA油用尼罗红(120 mg/g油)染色;尼罗蓝染料用于蛋白染色。然后在4 ℃避光贮存过夜。采用60倍物镜(油镜)观察尼罗红(激发波长488 nm)和尼罗蓝(激发波长635 nm)染料的荧光信号,获取共聚焦显微图像。
1.3.7 剪切流变特性
采用HaakeRheoStress流变仪对DHA牛奶进行连续剪切和震荡频率扫描试验测定其表观黏度与黏弹模量。剪切黏度参数如下:转子型号CC27 DG/Ti,剪切速率0.1～100 s-1,时间60 s,数据点80,测试温度25 ℃,重复测定3次。频率扫描参数:转子型号CC27 DG/Ti,剪切应力1 Pa,频率-扫描参数1～10 Hz,数据点60,测试温度25 ℃,重复测定3次。
1.3.8 氢过氧化物产物测定
通过测定氢过氧化物浓度分析DHA牛奶中DHA氧化程度。将DHA牛奶高温灭菌转入棕色小瓶中于50 ℃避光贮存14 d,每隔1 d测定1次,重复测定3次。具体操作:将0.9 mL样品与4.5 mL异辛烷/异丙醇(3∶1,体积比)混合,振荡3次,离心2 min,然后取0.6 mL上清液与8.4 mL甲醇/正丁醇(2∶1,体积比)以及90 μL硫氰酸/Fe2+溶液混合。硫氰酸/Fe2+溶液需现用现配,通过将等体积的3.94 mol/L硫氰酸盐溶液和Fe2+溶液混合制备而成。样品室温静置19 min后用紫外可见分光光度计在510 nm处测其吸光度。根据异丙苯氢过氧化物校准曲线确定氢过氧化物浓度。
1.3.9 感官评价
采取感官评定的方法对DHA牛奶的品质进行评定,感官评定样品如图2所示,感官评价人员由7名品评人组成。评价人员熟悉和掌握DHA牛奶的风味属性特征,包括腥味、奶香味、甜味、饱满度和整体喜好度,评价2次,中场休息10 min。
图2 DHA强化牛奶感官实验样品
Fig.2 Samples of DHA-fortified milk for sensory testing
收集7名感官评价人员的2次评价结果,统计并绘制感官评价雷达图。评价标准选择5个感官属性对DHA牛奶样品进行感官评价,采用9分制规则对各个感官属性进行评分;0表示无此感官属性特征,9表示感官属性特征最强;0～9代表感官属性特征强度由低到高[20],评分细则如表1所示。
表1 DHA牛奶感官评价
Table 1 DHA-fortified milk sensory evaluation
评分0～1分1～3分3～5分5～7分7～9分腥味强烈刺激的腥味腥味较强一般腥味较淡无任何腥味奶香味无奶香味奶香味较淡一般较好具有很浓郁的奶香味甜味无甜味稍甜一般较强具有强烈的甜味饱满度观感粗糙较低一般较强观感润滑、无颗粒感整体喜好度很差较差一般较好非常好
1.4 数据统计分析
以上结果表示为“平均值±标准偏差”,采用Excel软件和Origin 2019b软件进行数据处理并绘图。
2 结果与分析
2.1 不同pH值的DHA乳状液微粒对DHA牛奶理化特性、微观结构及流变性的影响
2.1.1 粒径和Zeta-电位
图3为DHA乳状液微粒在不同pH值下对DHA牛奶平均粒径和Zeta-电位的影响。当DHA乳状液微粒的pH值从3.5升至6.5时,DHA牛奶的粒径从306.42 nm逐渐下降为278.50 nm,Zeta-电位从-38.90 mV逐渐变为-40.87 mV。这是因为随着pH值增高,酪蛋白酸钠带净负电荷增多,Zeta-电位随之下降[21]。与市售产品相比,pH值为3.5和4.5时DHA牛奶的平均粒径偏大,这可能是因为DHA乳状液微粒中的酪蛋白酸钠带有正电荷,带有阴离子的海藻酸钠分子能够与酪蛋白酸钠分子以及酪蛋白酸钠乳化的DHA相互作用,形成一个带电层,进而通过静电排斥和空间位阻效应产生絮凝[22]。当DHA乳状液微粒的pH值为5.5和6.5时,DHA牛奶的平均粒径由于静电排斥力的存在而相对较小。
a-平均粒径;b-Zeta-电位
图3 DHA乳状液微粒pH值对DHA强化牛奶平均粒径和Zeta-电位的影响
Fig.3 Effect of DHA emulsion-based microparticles pH on the mean particle size and Zeta-potential of DHA-fortified milk
2.1.2 物理稳定性
基于空间-时间消光图谱技术,使用LUMiSizer稳定性分析仪测定DHA乳状液微粒pH对牛奶物理稳定性的影响。如图4所示,DHA乳状液微粒pH对牛奶物理稳定性无显著影响。牛奶的原始透射曲线在DHA乳状液微粒pH 4.5、5.5和6.5时几乎没有变化,最终透射率小于20%。这是因为海藻酸钠分子能够在酪蛋白酸钠分子和酪蛋白酸钠乳化的DHA液滴周围形成高负电荷层,通过静电排斥和空间位阻效应共同提高其对等电絮凝的稳定性。牛奶的原始透射曲线在DHA乳状液微粒pH 3.5时有轻微变化,但最终透射率还是小于20%,这是因为DHA乳状液微粒在pH 3.5时倾向于形成乳析,其原因可能是pH值过低,在离心过程中,涂覆酪蛋白酸钠的DHA液滴快速移动,在短时间内产生乳析。
a-市售产品对照;b-pH 3.5;c-pH 4.5;d-pH 5.5;e-pH 6.5
图4 DHA乳状液微粒pH值对DHA强化牛奶原始透射曲线的影响
Fig.4 Effect of DHA emulsion-based microparticles pH on the original transmission curve of DHA-fortified milk
2.1.3 微观结构
通过CLSM显微镜,研究不同DHA乳状液微粒pH值对DHA牛奶微观结构的影响。在CLSM微观结构中,DHA油滴呈绿色,蛋白质分子呈红色。由图5可知,牛奶中添加的DHA乳状液微粒在pH 3.5和pH 4.5时,DHA牛奶微观结构分布与市售产品相似,液滴分布较为均匀,油滴(DHA,绿色)均被捕获在由酪蛋白酸钠和海藻酸钠形成的空间网络内部。当牛奶中添加的DHA乳状液微粒在pH 5.5和6.5时,出现部分DHA油滴聚集,可能是由于随着pH升高,酪蛋白酸钠和海藻酸钠之间的静电络合作用较弱,无法将DHA全部捕获在微粒内部,部分暴露。
图5 DHA乳状液微粒pH值对DHA强化牛奶微观结构的影响
Fig.5 Effect of DHA emulsion-based microparticles pH on microstructure of DHA-fortified milk
2.1.4 剪切流变
用动态流变学测量DHA牛奶的剪切黏度变化,如图6-a所示。DHA牛奶黏度随着剪切速率的增加而降低,但降低幅度较小,略有剪切稀化的现象,反映了DHA牛奶中的DHA乳状液微粒在较高的剪切速率下导致的结构破坏,使其按照流动方向有序排列,流动阻力减小,表观黏度略有降低的现象[23]。对比4个样品的剪切黏度曲线,DHA乳状液微粒pH值对DHA牛奶的黏度影响不大,但和市售产品对比差距较大,因为样品中添加了海藻酸钠,海藻酸钠分子在DHA乳状液微粒中不仅起到增稠作用,还是构成微粒稳定结构的关键,所以在较高的剪切速率下也不易被破坏,进而使DHA乳状液微粒制备的DHA牛奶的稳定性得到提升。
a-表观黏度;b-频率扫描
图6 DHA乳状液微粒pH值对DHA强化牛奶表观黏度和频率扫描的影响
Fig.6 Effect of DHA emulsion-based microparticles pH on apparent viscosity and frequency scan of DHA-fortified milk
G′和G″分别表示凝胶系统的弹性特性与黏度,通过二者的关系可判断材料的损耗模量和阻尼损耗系数[24]。不同DHA乳状液微粒pH的DHA牛奶的频率扫描结果如图6-b所示,4种DHA牛奶样品都显示为G′>G″,表现出弹性行为,DHA乳状液微粒pH值对DHA牛奶的弹性特性影响不大,且和市售产品对比差异较小,表明DHA乳状液微粒不影响强化牛奶的流体特性与口感。
2.2 DHA乳状微粒添加量对DHA牛奶理化特性、微观结构及流变性的影响
2.2.1 Zeta-电位和粒径
如图7-a所示,当DHA乳状液微粒添加量从1%升至15%时,Zeta-电位从-38.49 mV逐渐变为-39.55 mV,且电位绝对值均大于30 mV,绝对值越大表明静电排斥力较大,分布较为均匀,稳定性好。如图7-b所示,随着DHA乳状液微粒含量的增加,DHA强化牛奶的平均粒径有所增大,这可能是因为DHA乳状液微粒添加量高导致耗散聚集。添加量为1%和5%时平均粒径和市售产品无显著差异,该结果与微观结构结果一致。
a-Zeta-电位;b-平均粒径
图7 DHA乳状液微粒添加量对DHA强化牛奶Zeta-电位和平均粒径的影响
Fig.7 Effect of DHA emulsion-based microparticles addition on Zeta-potential and mean particle size of DHA-fortified milk
2.2.2 物理稳定性
DHA乳状液微粒添加量对DHA强化牛奶物理稳定性的影响结果如图8所示。DHA乳状液微粒增加量为1%时DHA牛奶的稳定性略低。随着DHA乳状液微粒添加量增高,DHA牛奶的稳定性随之提高,且均比市售DHA强化牛奶稳定性较好。这可能是因为海藻酸钠含量增加,黏度增大,物理稳定性提高。
a-市售产品对照;b-1%;c-5%;d-10%;e-15%
图8 DHA乳状液微粒添加量对DHA强化牛奶原始透射曲线的影响
Fig.8 Effect of DHA emulsion-based microparticles addition on the original transmission curve of DHA-fortified milk
2.2.3 微观结构
由图9可知,DHA强化牛奶中的DHA乳状液微粒添加量为1%和5%时,牛奶的微观结构分布最为均匀,油滴被捕获在微粒内部。牛奶中的DHA乳状液微粒添加量为10%和15%时,牛奶中DHA乳状液微粒发生粘连,蛋白聚集,这可能是由于DHA乳状液微粒添加量过高,海藻酸钠含量增加,导致牛奶发生耗散聚集。
图9 DHA乳状液微粒添加量对DHA强化牛奶微观结构的影响
Fig.9 Effect of DHA emulsion-based microparticles addition on the microstructure of DHA-fortified milk
2.2.4 剪切流变
用动态流变学测量DHA牛奶的剪切黏度变化,如图10-a所示,随着添加量增加,DHA牛奶的表观黏度也随之增加。当DHA乳状液微粒添加量为1%和5%时,DHA强化牛奶的黏度接近市售产品的黏度。当DHA乳状液微粒添加量为10%和15%时,DHA强化牛奶的黏度明显增大,这种现象可能是因为DHA乳状液微粒添加量增高,蛋白颗粒发生聚集,增加了牛奶的黏度,与微观结构结果一致。DHA牛奶的黏弹特性变化情况如图10-b所示,DHA乳状液微粒添加量为1%、5%和10%时,DHA牛奶的黏弹模量影响不大,且接近市售产品;DHA乳状液微粒添加量为15%时DHA牛奶的黏弹特性明显增大。结合表观黏度与黏弹模量分析,当DHA乳状液微粒添加量为1%和5%时,均接近于市售产品。
a-表观黏度;b-黏弹模量
图10 DHA乳状液微粒添加量对DHA强化牛奶表观黏度和黏弹模量的影响
Fig.10 Effect of DHA emulsion-based microparticles addition on apparent viscosity and viscoelastic modulus of DHA-fortified milk
2.3 DHA强化牛奶氧化稳定性与感官评价分析
2.3.1 氢过氧化物浓度变化
市售产品(DHA含量为2 mg/100 mL)和DHA乳状液微粒添加量为1%(DHA含量为2 mg/100 mL)和5%(DHA含量为10 mg/100 mL)的强化牛奶样品在50 ℃条件下贮藏过程中氢过氧化物浓度变化如图11所示,DHA强化牛奶和市售产品的氢过氧化物浓度总体上变化趋势类似,呈现逐步上升趋势,从第0天到第7天增长缓慢,从第10天开始增长迅速。对比DHA强化牛奶和市售产品,发现第0天到第7天三者氢过氧化物浓度无显著差异,在增加DHA添加量的前提下两者氢过氧化物浓度差异不明显,说明DHA乳状液微粒具有良好的抗氧化稳定性,可能是因为阴离子多糖海藻酸钠通过静电吸引作用结合过渡金属离子,从而减少其与DHA接触的机会[25-26],其次乳状液微粒的网络结构和黏度限制了液滴的布朗运动与空间,防止DHA与氧气接触,进而抑制DHA氧化[27]。
图11 DHA强化牛奶的氢过氧化物浓度变化
Fig.11 Changes in hydroperoxide concentration of DHA-fortified milk
2.3.2 感官评价
根据7位感官评价人员对市售产品和DHA乳状液微粒添加量为1%和5%牛奶样品的评价结果绘制感官评价雷达图,如图12所示。由雷达图直观分析,在饱满度、无腥味方面,3种牛奶样品无显著差异。在奶香味、甜味方面,DHA乳状液微粒添加量为1%和5%的DHA强化牛奶样品虽然评分低于市售产品,但是差异不大。总体来说,利用DHA乳状液微粒可提高牛奶中DHA载量且整体喜好度不受影响。
图12 DHA强化牛奶感官评价雷达图
Fig.12 Radar chart for sensory evaluation of DHA-fortified milk
3 结论
本研究基于静电络合效应,通过NaCas-ALG微粒封装DHA,构建具有良好稳定性的DHA乳状液微粒。研究DHA乳状液微粒pH值和添加量对DHA强化牛奶物理稳定性、电位、Zeta-粒径、微观结构及流变特性影响,并对DHA强化牛奶氧化产物氢过氧化物与风味感官进行分析。结果表明,当DHA乳状液微粒pH 4.5且添加量为5%时,强化牛奶中DHA含量高达市售产品的5倍,与市售产品相比,粒径、电位无显著差异,DHA油滴被捕获在由酪蛋白酸钠和海藻酸钠形成的空间网络内部,液滴分布均匀,物理稳定性良好。同时,对比市售产品和DHA乳状液微粒添加量为1%和5%的DHA强化牛奶样品贮藏期间产生的氧化产物浓度差异,从第0天到第7天市售产品和添加量5%DHA强化牛奶氢过氧化物浓度无显著差异,说明DHA乳状液微粒稳态技术提高牛奶中DHA含量到市售产品5倍时,不仅具有良好的物理稳定性,还可以达到与市售产品相同的抗氧化效果且感官整体喜好度不受影响,为DHA强化牛奶奠定了良好的理论基础。
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