兰茂牛肝菌(Lanmaoa asiatica)是云南名贵的野生食用菌,因子实体菌盖及菌柄基部颜色呈砖红色,也被俗称“红葱”,该野生菌蛋白含量较高,富含氨基酸、核苷酸、可溶性糖等呈味物质[1]。此外,兰茂牛肝菌香气浓郁、口感鲜美脆嫩,是菇类调味品开发的重要基料[2]。
食用菌细胞壁主要由几丁质、葡聚糖、蛋白质、木质素和纤维素组成[3-5]。最外层的黏液层富含葡聚糖,下层富含几丁质和葡聚糖,蛋白质主要以糖蛋白的形式分布在细胞壁中[3]。多种物质相互聚合、交联形成细胞壁,以维持细胞内水分,防止子实体组织衰老与软化,同时提供支撑和保护作用。但由于食用菌细胞壁结构复杂,风味物质的溶出、有效成分的提取等均会受到限制,因此,对食用菌细胞壁进行预处理是食用菌精深加工中至关重要的环节。
在菇类调味品开发中,常使用酶制剂对菇类原料进行预处理,以破坏细胞壁,减少细胞壁以及细胞间质的阻力,进而促进目标成分的溶出。吴关威等[6]采用纤维素酶法提取香菇柄中的呈味核苷酸,解决了香菇柄纤维素含量过多导致香菇柄内多种物质释放困难的问题。沈文凤等[7]为提高香菇酶解液的酶解效率和感官品质,采用纤维素酶复合菠萝蛋白酶及风味蛋白酶进行酶解。ZHU等[8]采用纤维素酶、木瓜蛋白酶复合酶解食用菌残渣,研究发现复合酶酶解产物的性质优于单一酶酶解产物,纤维素酶与木瓜蛋白酶联用制备的酶解液还原糖含量增加了6.98倍。李泽林等[9]研究表明纤维素酶可以最大限度地释放虎掌菌中的还原糖。
智能感官技术是基于人类感官仿生技术开发的智能检测系统,包括电子舌、电子鼻、电子眼技术[10]。与仪器分析技术相比,智能感官技术能够更加直观地展示食品感官信息。同时,克服了人工感官主观性差、再现性差的难题,已成为食品风味评价领域的研究热点[11-12]。于志海等[13]采用电子舌、电子鼻对不同采收时间及不同产地的火龙果发酵酒香气和滋味特征进行研究。黄锶钘等[14]基于智能感官技术分析市售酱香型白酒的色泽和滋味。多项研究表明,智能感官技术可以表征样品的综合风味品质。
综上所述,本研究以兰茂牛肝菌粉为原料,基于酶法破壁技术,首先采用纤维素酶预处理兰茂牛肝菌粗粉,之后再采用风味蛋白酶进一步酶解。以还原糖含量为评价指标筛选纤维素酶酶解参数并通过正交试验优化酶解工艺,再结合肽及氨基酸态氮含量的变化来评价酶解效果。最后采用智能感官评价技术(电子鼻、电子舌)对兰茂牛肝菌酶解产物进行香气及滋味分析。以期通过纤维素酶预处理来提高风味蛋白酶酶解效率,增加兰茂牛肝菌风味物质的溶出量,为食用菌酶解和风味评价提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
兰茂牛肝菌,购于昆明木水花野生菌交易市场,干燥至水分含量15%以下后粉碎过165 μm筛;风味蛋白酶(50 000 U/g),沧州夏盛酶生物技术有限公司;纤维素酶(100 000 U/g),山东隆科特酶制剂有限公司;醋酸(食品级),千禾味业食品股份有限公司;食用碱,安琪酵母股份有限公司;肽含量测定试剂盒、还原糖测定试剂盒,苏州梦犀生物医药科技有限公司。
1.2 试验设备
FlexA-200酶联免疫分析仪,杭州奥盛仪器有限公司;WGLL-625BE电热鼓风恒温干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司;FE28型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-6恒温水浴锅,上海力辰仪器科技有限公司;HR/T20MM台式大容量高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂;G08L双层研磨杯,浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司;5HG-2AK果蔬烘干机,云南种业集团有限责任公司;电子舌,上海保圣实业发展有限公司;电子鼻,AIRSENSE分析有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 纤维素酶酶解单因素试验
在预实验基础上固定料液比为1∶20,取等量兰茂牛肝菌粉。固定初始pH 4.5、反应温度50 ℃、反应时间2 h,探究酶添加量(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)对肽含量的影响;固定酶添加量0.4%、反应温度50 ℃、反应时间2 h,探究初始pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)对肽含量的影响;固定酶添加量为0.4%、初始pH 4.5、反应时间2 h,探究反应温度(40、45、50、55、60 ℃)对肽含量的影响;固定酶添加量0.4%、初始pH 4.5、反应温度50 ℃,探究反应时间(1、2、3、4、5 h)对肽含量的影响。
1.3.2 纤维素酶正交优化试验
在单因素试验基础上,选取酶添加量、pH值、温度、时间4个因素设计 L9(34)正交试验,以还原糖含量为评价指标,进行工艺优化并确定最佳酶解工艺。正交试验设计表如表1所示。
表1 纤维素酶正交试验因素水平表
Table 1 Cellulase orthogonal test factor level table
水平因素酶添加量/%pH温度/℃时间/h10.23.5403.020.34.0453.530.44.5504.0
1.3.3 风味蛋白酶酶解试验
根据前期研究结果,风味蛋白酶酶解条件为:酶添加量1.0%、初始pH 7.5、反应温度60 ℃、反应时间3 h。
1.3.4 双酶酶解试验
基于纤维素酶、风味蛋白酶的正交优化试验结果,采用分段酶解技术,先进行纤维素酶解(酶解条件:酶添加量0.3%、初始pH 4.0、反应温度45 ℃、反应时间4 h),酶解结束后沸水浴灭酶10 min,冷却后进行风味蛋白酶酶解(酶解条件:酶添加量1.0%、初始pH 7.5、反应温度60 ℃、反应时间3 h)。酶解结束后沸水浴灭酶10 min,冷却后4 000 r/min离心10 min,分离上清液备用。
1.3.5 还原糖含量的测定
a)样品制备:兰茂牛肝菌酶解液离心后取上清液稀释20倍后备用。
b)还原糖含量测定:酶标仪提前预热30 min,调节波长至540 nm;在EP管中按照表2加入试剂。混匀后,在95 ℃水浴中加热5 min,冷却至室温,取200 μL至96孔板中,于540 nm处测定吸光值A。
表2 还原糖含量测定 单位:μL
Table 2 Determination of reducing sugar content
试剂空白管测定管酶解上清液0175蒸馏水1750DNS溶液125125
c)还原糖含量按公式(1)计算:
还原糖
(1)
式中:A1,测定管吸光值;A2,空白管吸光值;V,加入样品体积,0.175 mL。
还原糖含量计算标准曲线为:y=5.416 7x-0.197 8,R2=0.997 3。
1.3.6 肽含量的测定
a)样品制备:将兰茂牛肝菌酶解上清液稀释2倍,取稀释后的酶解上清液500 μL加入1 mL的三氯乙酸提取液,充分混匀后静置 30 min,12 000 r/min 4 ℃离心 10 min后取上清液进行测定。
b)肽含量测定:酶标仪提前预热 30 min,调节波长至 562 nm;在96孔板中按照表3 加入试剂。混匀后置于 60 ℃烘箱保温 30 min,在 562 nm处测定吸光值。
表3 肽含量测定 单位:μL
Table 3 Measurement of peptide content
试剂空白管测定管标准管蒸馏水1000标准品0010上清液0100工作液190190190
注:标准品为四肽;工作液配制:将试剂盒中的试剂A(BCA、Na2CO3、酒石酸钠、NaOH、NaHCO3溶液,混合溶液,pH值为11)和试剂B(CuSO4·5H2O)按照50∶1的比例混合,60 ℃水浴30 min备用。
c)肽含量按公式(2)计算:
肽含量
(2)
式中:C标,标准品浓度,0.5 mg/mL;A1,测定管吸光值;A2,空白管吸光值;A3,标准管吸光值;V1,样品体积,0.5 mL;V2,加入的提取液体积,1.0 mL。
1.3.7 氨基酸态氮测定
参照 GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》,采用自动电位滴定仪测定。
1.3.8 电子鼻检测
a)香气收集:提前调节样品pH至7.5,在样品瓶中加入30 mL样品,60 ℃水浴保温30 min后进行检测。
b)检测条件:采用单样检测,传感器清洗时间60 s,样品制备时间 5 s,样品检测时间120 s,样品流入流量400 mL/min,每个样品重复3次。传感器名称及性能如表4 所示。
表4 电子鼻传感器名称及性能
Table 4 Electronic nose sensor and their properties
序号传感器名称性能描述R1W1C芳香成分R2W5S对氮氧化合物敏感R3W3C对芳香成分敏感R4W6S对H2有选择性R5W5C烷烃芳香成分R6W1S对甲烷灵敏R7W1W对硫化物、萜烯类灵敏R8W2S对醇类、醛酮类灵敏R9W2W芳香成分,对有机硫化物灵敏R10W3S对烷烃灵敏
1.3.9 电子舌检测
采用电子舌检测酶解样品味觉特性,该电子舌由6个传感器(钨 S1、金 S2、钛 S3、钯 S4、银 S5、铂 S6、氯化银参比)组成。检测方法参考LI等[15],并结合试验实际进行修改。酶解上清液4 000 r/min、4 ℃离心15 min,重复上述操作3次,以确保上清液无杂质。取40 mL离心好的样品进行检测,传感器的信号放大3倍,检测时间120 s。
1.4 数据处理与分析
试验数据采用 Excel 处理,GraphPad prism5 做差异性分析及作图。电子鼻数据使自带软件 Winmuster 进行分析和作图。电子舌数据使用自带数据分析软件进行分析及作图。
2 结果与分析
2.1 纤维素酶单因素试验
纤维素酶通过酶解可以释放样品中的还原糖,进而通过判断酶解产物中还原糖的含量来判断酶解程度。一般而言,酶解产物中还原糖含量越高,说明样品中还原糖释放率越高,酶解程度越大[16]。
2.1.1 纤维素酶添加量对还原糖含量的影响
由图1可知,酶解液中还原糖含量随着酶添加量的增加呈先上升后下降的趋势。当酶添加量为0.3%时,还原糖含量最高,之后随着酶添加量的增加还原糖含量不断下降,这是因为酶添加量的增加会使酶解效率增大,但酶与底物具有一定的饱和度,当酶添加量达到饱和时,再增加酶反而会抑制酶解效率,降低还原糖含量,且高浓度的酶还会引起资源浪费,成本增加[17]。因此,最适酶添加量为0.3%。
图1 纤维素酶添加量对酶解液还原糖含量的影响
Fig.1 Effect of cellulase addition on reducing sugar content of enzyme digestion solution
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.1.2 初始pH值对还原糖含量的影响
由图2可知,酶解液中还原糖含量随着pH值的增加呈下降趋势。当pH值为4.0时,还原糖含量最高,随着pH值的增加,还原糖含量不断降低。这是因为pH值的变化会影响酶活性进而影响酶解效率,而纤维素酶的最适pH值范围为4.0～5.5,但其最适值又受反应底物影响。因此,最适pH值为4.0。
图2 初始pH对酶解液还原糖含量的影响
Fig.2 Effect of initial pH on reducing sugar content of enzyme digestion solution
2.1.3 反应温度对还原糖含量的影响
由图3可知,酶解液中还原糖含量随着反应温度的升高呈先增加后降低的趋势。当反应温度为45 ℃时,还原糖含量最高,之后随着温度的升高,还原糖含量逐渐降低。这是因为酶活性受温度影响,温度过高会抑制酶活性甚至使酶失活,进而影响反应速率及还原糖的溶出量[18]。因此,最适反应温度为45 ℃。
图3 反应温度对酶解液还原糖含量的影响
Fig.3 Effect of reaction temperature on reducing sugar content of enzymatic digestion solution
2.1.4 反应时间对还原糖含量的影响
由图4可知,酶解液中还原糖含量随着酶解时间的延长呈先增加后稳定的趋势。1～4 h内,还原糖含量不断增加,4 h时,还原糖含量最高,延长酶解时间也不能增加还原糖含量,表明4 h时纤维素酶解完成。因此,最适酶解时间为4.0 h。
图4 反应时间对酶解液还原糖含量的影响
Fig.4 Effect of reaction time on reducing sugar content of enzymatic digestion solution
2.2 纤维素酶正交优化试验结果
基于纤维素酶解单因素试验结果,以还原糖含量为指标,选取酶添加量、pH、温度、时间4个因素进行正交优化试验,试验结果见表5。4个因素对还原糖含量的影响顺序为pH>时间>温度>酶添加量。最佳酶解工艺为:A2B2C2D2,即纤维素酶添加量0.3%、初始pH 4.0、反应温度45 ℃、反应时间4 h。在此条件下进行3次验证试验,得出还原糖含量为(5.002±0.02) μg/mL。
表5 纤维素酶正交优化试验结果
Table 5 Results of cellulase orthogonal optimization tests
试验号A 酶添加量/%B pHC 温度/℃D 时间/h还原糖/(μg/mL)111114.028212224.659313333.447421234.426522314.265623123.917731324.506832134.221933213.834K14.0454.3204.0554.042K24.2034.3824.3064.361K34.1873.7334.0734.031R0.1580.6490.2510.330A2B2C2D2
2.3 不同酶解条件下的还原糖、肽及氨基酸态氮含量比较
将兰茂牛肝菌粉分别经过纤维素酶、风味蛋白酶、双酶处理后测定还原糖、肽及氨基酸态氮含量,并对测定结果进行比较分析。
由图5可知,纤维素酶组释放的还原糖(5.095 μg/mL)显著高于风味蛋白酶组(0.499 μg/mL)(P<0.05),双酶组的还原糖含量(5.022 μg/mL)与纤维素酶组无显著差异(P>0.05)。
图5 不同酶解方式对还原糖含量的影响
Fig.5 Effect of different enzymatic methods on reducing sugar content
注:双酶表示纤维素酶与风味蛋白酶分段酶解(下同)。
蛋白质经水解生成肽,其水解程度往往与肽的生成量呈正相关[19],此外,肽是蛋白质酶解产物中对风味影响较为关键的组分,既能同时参与食品风味物质的形成,改善食品品质;也是制备高档香精香料、复合调味料重要基料[20]。由图6可知,纤维素酶组的肽含量(3.288 mg/mL)显著低于(P<0.05)风味蛋白酶组(3.773 mg/mL)和双酶组(4.516 mg/mL),而双酶组的肽含量显著高于风味蛋白酶组(P<0.05)。
图6 不同酶解方式对肽含量及氨基酸态氮含量的影响
Fig.6 Effect of different enzymatic digestion methods on peptide content and amino acid nitrogen content
氨基酸态氮包含游离氨基酸、多肽类等重要的呈味物质。其含量是酱油等调味品品质分级的依据,该指标越高,说明氨基酸含量越高,鲜味越好。此外,氨基酸态氮含量也是表征酶解程度的重要指标[21-22]。双酶组的氨基酸态氮含量为128.0 mg/100 mL,显著高于纤维素酶组及风味蛋白酶组(P<0.05),且相较于风味蛋白酶组(112.3 mg/100 mL),其氨基酸态氮含量提升了14%。说明纤维素酶的预处理可以提高酶解程度,增加肽及氨基酸态氮含量。
综上所述,纤维素酶通过降解兰茂牛肝菌粉中的纤维素产生还原糖,以破坏兰茂牛肝菌粉的细胞壁,经过纤维素酶预处理后再进行风味蛋白酶酶解,可以提高酶解效率,促进兰茂牛肝菌风味物质的溶出率。
2.4 电子鼻分析
电子鼻也称人工嗅觉系统,电子鼻将传感器探测到的气味物质强度转换成数据,再结合化学计量学等方法和模型,最终形成能够反映样品总体气味轮廓的图谱从而区分样品[23]。
2.4.1 电子鼻响应值雷达图及传感器响应值分析
PEN3 电子鼻中的 10 个金属传感器能分别针对不同气体产生响应信号,通过响应信号强弱,即响应值的大小来判定对香气组分的敏感程度[24]。电子鼻传感器响应值雷达图(香气轮廓)见图7。3组样品传感器响应值较高的主要是W1C、W5S、W1S、W1W、W2S、W2W传感器,说明3组样品中的主要香气组分是芳香成分、氮氧化合物、甲烷、硫化物、醇类、醛酮类等。纤维素酶组样品,W1C、W5S、W1S、W1W、W2S、W2W的响应值高于风味蛋白酶组和双酶组,说明该样品中这几类香气组分含量高于其他2组样品;与纤维素酶组相比,风味蛋白酶组各个传感器响应值均较低,特别是W5S、W1S、W1W、W2S,说明该样品中氮氧化合物、甲烷、萜烯类、醇类、醛酮类这几类香气组分含量较低,二者的香气轮廓也有较大差异;双酶组的香气轮廓介于纤维素酶组和风味蛋白酶组之间,该样品的传感器响应值低于纤维素酶组,但W5S、W1S、W1W、W2S高于风味蛋白酶组,表明这几类香气组分含量较风味蛋白酶组较高。总而言之,不同的酶解处理方式会对样品的香气组分产生影响,香气组分的变化又会形成不同的香气轮廓。
图7 电子鼻雷达图
Fig.7 Electronic nose radargrams
2.4.2 电子鼻主成分分析(principal component analysis,PCA)
为了更直观地描述样品间的差异,对电子鼻数据进行了PCA,分析结果见图8。第一主成分PC-1的贡献率为68.50%,第二主成分PC-2的贡献率为31.41%。双酶组与风味蛋白酶组距离较近,表明样品间香气组分相似,风味差异较小,而纤维素酶组与其他2组距离较远,表明纤维素酶处理产生的香气物质与其他2组样品所产生的香气物质不同,说明该样品与其他2组样品风味差异较大。总之,由PCA图可以直观的看出,3组样品无重叠,有较好的区分度,表明3组样品存在风味差异,该结果与2.4.1节的结果一致。
图8 电子鼻PCA结果
Fig.8 Results of PCA of electronic nose
2.5 电子舌PCA
电子舌也称人工味觉识别技术[23]。由传感器阵列、信号调理系统、测试平台和应用软件4个部分组成。利用电化学的方法,使得分析检测对象表现出物质本质属性的脉冲弛豫现象,再结合多元统计分析技术表征样品的味觉特征[25]。
电子舌味觉评价结果如图9所示,第一主成分PC-1为99.52%,第二主成分PC-2为0.37%,表明该结果可以代表样品特性。图中3组样品互不重叠,可以清楚地进行区分。双酶组与纤维素酶组距离较近,表明二者的味觉属性具有相似性,但也具有差异;风味蛋白酶组则距离较远,表明风味蛋白酶组与纤维素酶组和双酶组味觉属性均有较大差异。总之,电子舌味觉评价结果说明经过纤维素酶破壁处理后再进行风味蛋白酶酶解,酶解产物的滋味发生了改变。
图9 电子舌PCA结果
Fig.9 Results of PCA of electronic tongue
3 结论
本研究基于分步酶解技术,采用纤维素酶预处理兰茂牛肝菌粉后进行风味蛋白酶酶解,以期提高兰茂牛肝菌酶解程度,促进风味物质溶出。首先以还原糖含量为评价指标进行纤维素酶酶解参数筛选及工艺优化,得到纤维素酶酶解最佳工艺为:纤维素酶添加量0.3%、初始pH 4.0、反应温度45 ℃、反应时间4 h,在此条件下还原糖释放量为(5.002±0.02) μg/mL。经过纤维素酶预处理后再进行风味蛋白酶酶解,酶解液中肽含量及氨基酸态氮含量显著提高,主要香气组分包括芳香成分、氮氧化合物、甲烷、硫化物、萜烯类等,但香气轮廓发生变化,风味(香气、滋味)差异明显。综上所述,纤维素酶预处理可以分解纤维素产生还原糖,再进行风味蛋白酶酶解能提高兰茂牛肝菌酶解液中肽含量及氨基酸态氮含量,有效促进风味物质的释放。该研究结果可为食用菌酶解及食用菌类调味基料制备提供参考,并为智能感官技术在食用菌加工领域的应用提供一定的理论依据。
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