越桔属(Vaccinium)樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)是一种极具药用及健康价值的多年生常绿植物,由其叶芽炮制成的‘雀嘴茶’,常饮有舒筋活络、祛风除湿之功效。乌金苷[6′-O-咖啡酰基熊果苷(6′-O-caffioylarbutin,CA)]、绿原酸[3′-O-咖啡酰奎尼酸(3′-O-caffeoylquinic acid,CGA)]和熊果苷[对-羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(arbutin,Arb)]被证明是樟叶越桔叶芽中富含的3种主要次生代谢产物[1]。Arb是当前国际认可的理想皮肤美白祛斑活性剂[2-3]。绿原酸具有抗菌、抗炎、抗病毒和保护心血管等药理学作用[4]。CA作为樟叶越桔叶芽含量最高的主效成分,具有抑制黑色素合成[1]、抗氧化[5]、降血栓血脂[6]和治疗痛风[7]等活性功能。因此,在樟叶越桔叶芽加工成‘雀嘴茶’的过程中,高效保留CA、CGA和Arb等主效成分显得至关重要。
干燥是药用等植物产品加工的重要环节,干燥过程伴随着物理和化学变化,进而引起各类次生代谢产物含量及生物活性的变化[8-10]。樟叶越桔因富含CA、CGA和Arb等极具开发利用价值的化合物而倍受关注。在涉及樟叶越桔样品的干燥实验时,不同研究者采用的干燥方法不完全相同[11-12]。在不同干燥方法比较研究中,仅见李国泽等[13]探讨了2种干燥方式(45 ℃ HAD和NAD)对樟叶越桔成熟叶片、嫩叶、花芽3种组织主效成分含量的影响,显示2种干燥方法下3种主效成分含量存在显著差异,推测干燥方法显著影响着樟叶越桔中次生代谢产物的提取含量。但樟叶越桔叶芽主效成分高保留的干燥方法研究仍处于滞缓状态,这导致‘雀嘴茶’主效成分含量研究缺乏统一的干燥标准,也使得各研究结果的可比性降低。
本研究以‘雀嘴茶’加工原料樟叶越桔叶芽为试材,通过HPLC技术进行化合物定量分析,探究了9种干燥方法对3种主效成分保留含量的影响。其中真空冷冻干燥(freeze vacuum drying,FVD)[14]、热风干燥(hot air drying,HAD)[14]、微波干燥(microware drying,MD)[14]、真空干燥(vacuum drying,VD)[15]、日晒干燥(sun drying,SD)[15]和自然阴干(natural air drying,NAD)[16]是已知文献报道的植物样品干燥方法,蒸制阴干(steaming and natural air drying,S-NAD)、烫制阴干(quick-boiling and natural air drying,QB-NAD)和煮制阴干(boiling and natural air drying,B-NAD)是本研究组创新性设计的3种干燥方法。进一步对表现优秀的3种创新干燥方法的蒸制、煮制和烫制的预处理时间进行了优化探究。以期筛选出樟叶越桔叶芽3种主效成分高保留的最佳干燥工艺,服务于该植物下游产品‘雀嘴茶’的生产加工。
1 材料与方法
1.1 植物材料
试验植物材料樟叶越桔叶芽(图1)采自云南省楚雄彝族自治州武定县的樟叶越桔野生资源保护基地(经度:102.36°E,纬度:25.55°N,海拔:2 100 m)。叶芽混样于当日带回实验室。2022年4月采集的叶芽用于后续1.3.1节干燥试验,2023年4月采集的叶芽用于后续1.3.2节干燥试验。
图1 樟叶越桔叶芽
Fig.1 Leaf buds of V. dunalianum
1.2 试剂与仪器
CA为本课题组从樟叶越桔中提取分离得到(纯度≥95%);CGA、Arb标准品,上海源叶生物科技有限公司;纯甲醇,上海星可高纯溶剂有限公司,冰乙酸,天津市致远化学试剂有限公司;73%甲醇和1%乙酸水均现配现用,以上均为体积分数。HPLC测定用试剂经0.22 μm微孔过滤膜过滤、超声波清洗器脱气25 min。
1260型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司;CF16RXⅡ台式高速冷冻离心机,日本HITACHI公司;LU10AT超声波清洗器,上海冠特超声仪器有限公司;101-1AB电热恒温鼓风干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司;DP43C型真空干燥箱,重庆大和科技有限公司;BTP-8ZL00X真空冷冻干燥机,美国SP科学公司;MK-2270M微波炉,青岛胶南海尔微波制品有限公司;FW-100高速万能粉碎机,北京中兴伟业仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 樟叶越桔叶芽的干燥方法与处理条件
试验从混样中随机称取10 g叶芽,选用9种干燥方法进行干燥处理,3个生物学重复。各干燥方法和试验条件见表1。干燥后的样品用粉碎机破碎1 min,粉末过40目筛后装入离心管,置在玻璃干燥器内保存备用。
表1 应用于樟叶越桔叶芽干燥的9种干燥方法及试验条件
Table 1 9 drying methods and test conditions for leaf buds drying of V. dunalianum
序号干燥方法试验条件1HAD样品置于60 ℃烘箱内,定期翻动,烘干至恒重2FVD样品于-80 ℃的超低温冰箱预冷12 h后置于真空冷冻干燥机中,真空49 mTorr,-67.2 ℃,干燥32 h3VD样品放入真空干燥箱(60 ℃、0.08 MPa)干燥至恒重4SD样品在阳光下晒干至恒重5MD样品先置于玻璃器皿上,再放入微波炉(功率950 W)中进行干燥,采用间歇式干燥,间隔时间为1 min,持续干燥至恒重6NAD样品置于通风良好、无阳光照射的室内阴干至恒重7B-NAD先将纯水加热至沸腾,样品再放入沸水中煮制5 min,后按NAD法阴干8S-NAD先将纯水加热至沸腾使其上汽,样品再放在蒸笼上蒸制5 min,后按NAD法阴干9QB-NAD先将纯水加热至沸腾后关火,样品放入开水中烫制5 min,后按NAD法阴干
1.3.2 创新干燥方法的预处理时间试验
试验分别设置S-NAD、QB-NAD和B-NAD 3种创新干燥方法的蒸制、烫制和煮制的6个不同预处理时间,1、2.5、5、7.5、10和12.5 min,以NAD法为对照。试验样品重复数和实验操作步骤同1.3.1节。
1.3.3 样品主效成分提取和HPLC测定
参照李国泽等[13]建立的方法步骤执行。
1.3.4 标准曲线绘制
参照李国泽等[13]建立的方法,以标准样品溶液质量浓度(μg/μL)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,其线性方程:CA为Y=10 890X+388.070 0;CGA为Y=13 336X+23.754 0;Arb为Y=4 059.5X-1.021 1,通过标准曲线计算CA、CGA、Arb含量。
1.4 数据分析方法
根据HPLC测定的结果,采用Excel 2010处理原始数据,测定3种主效成分含量结果以平均值±标准误表示,用SPSS 26软件采用单因素ANOVA检验中的LSD法和Duncan法分析数据,GraphPad Prism 8作图。
2 结果与分析
2.1 干燥方法对樟叶越桔叶芽3 种成分含量高低规律的影响
9种干燥方法处理试验获得的樟叶越桔叶芽CA、CGA和Arb的保留含量如表2所示,显示不同干燥方法处理下3种主效成分含量高低规律一致,为CA>CGA>Arb,且两两化合物间的差异极显著(P<0.01)。表明樟叶越桔叶芽中这3种主效成分含量高低规律不受干燥方法的影响。
表2 九种干燥方法处理下樟叶越桔叶芽中乌金苷、绿原酸、熊果苷的含量(n=3) 单位:mg/g DW
Table 2 Contents of 6′-O-caffeoyl arbutin, chlorogenic acid and arbutin in leaf buds of V. dunalianum under nine drying methods(n=3)
干燥方法CACGAArbS-NAD428.726±20.408a113.213±2.260b11.815±0.806cQB-NAD416.376±10.764a106.517±3.123b10.845±0.175cMD389.007±15.656a98.483±3.381b11.998±0.641cB-NAD352.525±5.035a103.772±2.095b9.820±0.450cFVD343.175±4.123a77.452±1.595b6.991±0.320cVD341.664±8.044a88.107±2.426b16.054±0.803cHAD320.490±2.281a80.808±0.275b13.200±0.212cNAD104.265±4.007a20.893±0.950b9.186±0.269cSD91.532±2.817a22.090±0.417b12.516±0.483c
注:不同小写字母表示横向表格中3种化合物含量差异显著(P<0.05)。
2.2 干燥方法对樟叶越桔叶芽 3 种主效成分保留含量的影响
樟叶越桔叶芽中CA、CGA和Arb的提取保留含量均受到干燥方法的影响,但变化规律不同(图2)。CA保留含量由高到低的干燥方法为:S-NAD>QB-NAD>MD>B-NAD>FVD>VD>HAD>NAD>SD(图2-a)。S-NAD法得到的CA含量显著高于除QB-NAD法以外的7种干燥方法(P<0.05),QB-NAD与S-NAD、MD间无显著差异(P>0.05),但显著高于其他6种干燥方法(P<0.05);B-NAD、FVD、VD和HAD 4种方法获得的CA含量相对居中,4者之间差异不显著(P>0.05);NAD和SD法得到的CA含量最低、且二者之间差异不显著(P>0.05),均极显著低于其他7种干燥方法(P<0.01);相比NAD,S-NAD和QB-NAD得到的CA含量提高了4倍,B-NAD也提高了3倍以上(表2和图2-a)。
a-CA的保留含量;b-CGA的保留含量;c-Arb的保留含量
图2 樟叶越桔 3 种主效成分在9种不同干燥方式处理下的含量变化(n=3)
Fig.2 Content of three main components of V. dunalianum under nine different drying methods (n=3)
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
CGA保留含量由高到低的干燥方法为:S-NAD>QB-NAD>B-NAD>MD>VD>HAD>FVD>SD>NAD(图2-b)。与不同干燥方法对CA含量的影响类似,S-NAD法得到的CGA含量显著高于其他8种方法的(P<0.05);QB-NAD和B-NAD得到的CGA含量相对较高,显著高于后续6种方法的(P<0.05);NAD和SD法得到的CGA含量最低,均极显著低于其他7种干燥方法(P<0.01);相比NAD,S-NAD、QB-NAD和B-NAD得到的CGA含量提高了5倍以上(表2和图2-b)。
Arb保留含量由高到低的干燥方法为:VD>HAD>SD>MD>S-NAD>QB-NAD>B-NAD>NAD>FVD(图2-c)。不同于CA和CGA受不同干燥方法的影响,VD法处理得到的Arb含量最高、且与其他8种干燥方法的差异显著(P<0.05);HAD、SD、MD和S-NAD四种方法间差异不显著(P>0.05),与其他干燥方法差异显著(P<0.05);FVD法获得的Arb含量最低,与其他8种方法存在差异(P<0.05);S-NAD、QB-NAD和B-NAD 3种干燥方法介于其他干燥方法之间。相比NAD,S-NAD和QB-NAD得到的Arb含量也提高了1.2倍～1.3倍;而VD法获得的Arb含量是FVD的2.3倍(表2和图2-c)。
综合上述结果分析,S-NAD法能同时最高保留樟叶越桔叶芽中CA和CGA含量,QB-NAD和B-NAD法也能同时使CA和CGA在叶芽中以高含量水平保留。VD却是樟叶越桔叶芽中Arb含量最高的保留方法,不过S-NAD、QB-NAD和B-NAD法也能使Arb含量在叶芽中保留在较高水平。CA、CGA和Arb是樟叶越桔叶芽富含的主要酚酸类化合物,创新的S-NAD、QB-NAD和B-NAD法中蒸、烫和煮制的高温高湿处理使植物细胞中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)瞬间钝化、丧失活性,使植物细胞壁快速软化、纹孔扩张、细胞膜结构破裂,更有利于细胞内次生代谢产物的释放。因此,为同时实现CA、CGA和Arb含量高效保留,可优先选择S-NAD、QB-NAD和B-NAD法对樟叶越桔叶芽进行干燥处理。
2.3 创新干燥方法的预处理时间对樟叶越桔叶芽3 种主效成分含量的影响
试验进一步探讨了S-NAD、QB-NAD和B-NAD方法6个不同预处理时间对3种化合物含量的影响,结果显示S-NAD、QB-NAD和B-NAD不同时间处理组的3种化合物含量均极显著高于NAD法的(图3～图5)。S-NAD试验组中(图3),CA、CGA和Arb 含量均随着蒸制时间的延长先升高再下降,均在5 min处理组最高,与7.5 min处理组的CA、Arb差异不显著(P>0.05),CGA差异显著(P<0.05),而5 min和7.5 min处理组均显著高于其他4个时间处理组(P<0.05)。表明,S-NAD干燥方法中,蒸制预处理时间在5～7.5 min时可以获得樟叶越桔叶芽3种主效成分最高保留含量。QB-NAD法试验组中(图4),3种主效成分含量也均在1 min组最高,并随烫制时间延长逐渐下降,但1 min处理组的CA和CGA含量显著高于其他时间处理组(P<0.05)。B-NAD法试验组中(图5),CA、CGA和Arb含量均在1 min处理组最高,并随煮制时间的延长呈逐渐下降趋势,但1 min处理组的CA和CGA含量与2.5 min处理组的差异不显著(P>0.05)。因此,3种创新干燥方法的预处理时间均显著影响着樟叶越桔叶芽3种主效成分的保留含量。S-NAD中,样品置于蒸汽中,随蒸制时间延长,植物细胞壁逐渐软化、纹孔逐渐扩张、细胞膜逐渐破裂,细胞内次生代谢产物逐渐释放,至5 min左右时达最大程度且次生代谢产物不流失,蒸制5 min后,蒸汽在样品中聚集成水并导致次生代谢产物逐渐流失。QB-NAD和B-NAD中,样品置于沸水中,植物细胞壁和细胞膜被快速软化、破裂,次生代谢产物快速(1 min)达到最大释放量,且逐渐流失到水中。因而创新干燥方法中,缩短样品与液态水接触的时间,是樟叶越桔叶芽的3种主效成分有效保留的关键之一。
a-CA保留含量;b-CGA保留含量;c-Arb保留含量
图3 在S-NAD法不同处理时间下樟叶越桔中 3 种主效成分的含量变化
Fig.3 The content changes of three main components in V. dunalianum under different treatment time by S-NAD method
a-CA保留含量;b-CGA保留含量;c-Arb保留含量
图4 在QB-NAD法不同处理时间下樟叶越桔中 3 种主效成分的含量变化
Fig.4 Changes in the content of three main components in V. dunalianum under different treatment time of QB-NAD method
a-CA保留含量;b-CGA保留含量;c-Arb保留含量
图5 在B-NAD法不同处理时间下樟叶越桔中 3 种主效成分的含量变化
Fig.5 The content changes of three main components in V. dunalianum under different treatment time of B-NAD method
2.4 三种创新干燥方法最优预处理时间下的3种主效成分含量比较
以上结果表明,3种创新干燥方法对CA、CGA和Arb中任一主效成分保留含量的高低均表现为S-NAD>QB-NAD>B-NAD,此结果中蒸制、烫制和煮制预处理时间均为5 min。2.3节实验结果显示S-NAD蒸制最优时间为5 min,但QB-NAD烫制和B-NAD煮制最优时间均为1 min。因此,进一步将3种创新干燥方法的最佳预处理时间获得的3种主效成分含量进行对比分析,结果显示(图6),对于CA和CGA保留含量的高低仍然表现为S-NAD>QB-NAD>B-NAD,且S-NAD和B-NAD间差异显著(P<0.05);对于Arb保留含量,B-NAD法仍然最低,QB-NAD法则高于S-NAD,但3种方法间差异不显著(P>0.05)。综合评价,3种创新干燥方法均可实现樟叶越桔叶芽3种主效成分的高保留,其中S-NAD是最理想的干燥方法。
a-CA保留含量;b-CGA保留含量;c-Arb保留含量
图6 创新干燥法最优预处理时间下樟叶越桔中3种主效成分的含量变化
Fig.6 Content changes of three main components in V. dunalianum under optimal pretreatment time of innovative drying method
3 讨论
樟叶越桔叶芽主效成分主要以CA和CGA为代表的酚酸类化合物为主。PPO是一种催化酚酸类物质形成醌类化合物的氧化还原酶[17]。越桔属植物中PPO存在很宽的活性温度(20～60 ℃),以35 ℃最佳[18]。本研究在考察9种干燥方法对樟叶越桔叶芽主效成分保留效果时发现,SD和NAD的处理温度处于PPO活性范围,CA和CGA等样品主效成分含量保留效果最差。S-NAD、QB-NAD、B-NAD和MD是获得CA和CGA保留含量最高的干燥方法,推测这4种干燥方法的高温使得样品中PPO快速钝化失活[19],因此有效成分含量保留效果突出;此外,还可能与高温诱导的化合物热转化有关,在越橘属植物蓝莓加工试验中,高温可使新绿原酸热转化成绿原酸[20-21]。本研究中S-NAD、QB-NAD、B-NAD和MD方法的高温也可能引起CA和CGA的热转化合成,导致其含量增加。FVD和VD法的CA和CGA主效成分含量保留效果紧次于S-NAD、QB-NAD、B-NAD和MD、FVD、VD法,主要受氧气影响,将叶芽样品与空气隔绝,阻断了PPO与O2作用,在一定程度上降低了PPO活性,使主效成分得到较好的保留。本研究中应用的HAD(60 ℃)法获得的主效成分含量高于NAD和SD法的,原因是在HAD 60 ℃条件下PPO处于低活性状态,相比较高的温度又加速叶芽水分流失,进一步抑制PPO活性[22],这表明樟叶越桔叶芽主效成分保留率受到了温度和氧分压的影响。后期需要进一步从不同干燥方法处理樟叶越桔叶芽后的PPO等相关酶活性等指标进行考察验证。
在樟叶越桔叶芽主效成分CA和CGA含量保留试验中,本文创新的S-NAD、QB-NAD和B-NAD 3种干燥方法相比已知6种干燥方法表现更优越,3种创新干燥方法预处理均与湿热有关,推测叶芽主效成分保留率还受到了水分的影响。CGA等植物次生代谢产物合成后主要存储于液泡中[23-24],3种创新干燥方法预处理样品时,高温高湿条件能软化细胞壁,扩张细胞壁纹孔,破坏细胞膜和液泡膜,有利于樟叶越桔主效成分CA和CGA的释放,提高了保留含量。QB-NAD和B-NAD方法的烫制和煮制试验中,样品直接浸入水中,释放的CA和CGA等主效成分会流失到水中,预处理时间越长,水沸腾越剧烈,主效成分流失越严重,因此主效成分随烫制和煮制时间的延长呈逐渐下降趋势。S-NAD方法的蒸制处理时,一定时间(5 min)内主效成分逐渐释放且不流失,主效成分含量逐渐升高;超过该时间,主效成分释放达到最佳且随着蒸汽形成的水而流失,主效成分含量又逐渐降低。因此,对于樟叶越桔抗氧化活性物质的保留,蒸制是最好的方法。
4 结论
试验考察了9种干燥方法(NAD、HAD、MD、FVD、VD、SD、S-NAD、B-NAD和QB-NAD)对樟叶越桔叶芽3种主效化合物(CA、CGA、Arb)的保留能力,樟叶越桔叶芽3种主效成分的保留受温度、氧分压和水分影响。S-NAD法能同时最高保留CA和CGA含量,VD是Arb含量最高的保留方法。为同时实现CA、CGA和Arb含量高效保留,S-NAD最适用于樟叶越桔叶芽的干燥,其中S-NAD(5 min)保留效果最佳。本研究为樟叶越桔主效成分的保留利用及提高‘雀嘴茶’产品质量提供理论指导,同时对药用、茶类产品最佳干燥工艺的探索提供方法参考,具有重要指导意义。
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