腌鱼是我国传统水产加工品的典型代表之一,由于其特殊的咸香风味,且具有肉质坚实、易于保藏等特点,在我国沿海地区和东南亚一些国家广受欢迎[1]。由于饮食习惯的差异,我国不同区域腌鱼原料和制作工艺也不同,形成了具有区域特色的腌鱼制品[2]。色泽是评价食品品质的关键指标之一[3]。肉制品的颜色主要与肌红蛋白和血红蛋白的含量有关,而血红蛋白存在于血液中,多在宰杀过程中流失,因此通常认为肌肉中肌红蛋白的含量和存在形式是决定肉制品颜色的主要因素[4-5]。腌肉制品在生产过程中多会通过添加亚硝酸盐来形成腌肉特有的红色色泽,亚硝酸盐还原所得的NO与肌红蛋白结合形成亚硝基肌红蛋白,并在遇热后分解形成稳定的具有鲜红色的亚硝基血色原[6-7]。
亮红色外观是影响腌制鱼产品价值和市场接受度的重要因素。然而由于鱼肉中肌红蛋白含量普遍较低,即使在腌制过程中添加了亚硝酸盐,显色效果也并不明显,甚至部分腌鱼制品呈黄白色,降低了产品价值。目前关于腌制鱼的研究多集中在加工工艺、贮藏条件等对其风味、安全等品质特征的影响[2,8],对于腌制鱼色泽形成方面的研究报道非常有限。由于对影响腌制鱼色泽的物质基础和关键因素尚不清楚,导致腌制鱼生产过程中往往因原料和工艺控制不当引起产品呈现不同红度的外观,降低产品品质稳定性。
因此,为探明影响腌制鱼色泽形成的关键因素,选取以草鱼为原料生产的不同色泽的腌鱼样品为研究对象,以色差、肌红蛋白、金属元素、亚硝基血红素和总色素等为指标,解析2种不同色泽腌鱼样品呈色物质差异,并进一步通过放血、未放血两种宰杀方式探究血红素残留量对腌鱼红色形成的影响,以期为腌制鱼制品色泽调控提供指导。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
腌鱼样品,盱眙好滋味食品有限公司;草鱼,无锡市滨湖区欧尚超市,质量为(2±0.3) kg/条;NaNO2,四川金山制药有限公司;血红蛋白检测试剂盒,伊势久(江苏连云港)生物科技有限公司;其余化学试剂均为国产分析纯,国药化学试剂有限公司。
3K15冷冻离心机,美国Sigma-Aldrich公司;Ultrascan Pro1166分光色差仪,美国Hunterlab公司;RCD-1A高速均质乳化机,常州越新仪器制造有限公司;电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;紫外可见分光光度计,日本岛津制作所;荧光分光光度计,安捷伦科技有限公司;JC-1086A酶标分析仪,青岛聚创环保集团有限公司;iCAP Q电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma source mass spectrometer,ICP-MS),上海仁特检测仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 腌鱼样品收集
收集江苏盱眙某公司经腌制、脱水等工序生产的不同色泽(暗红色和黄白色)腌干草鱼样品。产品规格:(1.0±0.2) kg;水分含量:(50±5)%;于-18 ℃下冷冻保存。
1.2.2 不同宰杀方式腌鱼样品制备
1.2.2.1 宰杀处理
(a)未放血宰杀:敲打鱼的头部,直到其昏厥,将鱼头去除。
(b)放血宰杀:敲打鱼的头部,昏厥后去除鱼尾,将鱼放在冰水中,隔10 min换一次水,直至无明显血液流出。
将2种不同宰杀方式处理的草鱼去鳞、去内脏,冲洗干净后切成约6 cm×4 cm×4 cm的鱼块。
1.2.2.2 腌鱼样品制备
将鱼块质量6%的食盐和0.015%NaNO2与鱼块混合均匀,4 ℃下腌制3 d,擦去鱼体表面水分,在43 ℃下烘干16 h,烘干的鱼块真空包装后于-18 ℃下冷冻保存供品质评价。
1.2.3 指标测定
1.2.3.1 色差测定
使用高精度分光测色仪测定,L*代表亮度值,a*代表红度值,b*代表黄度值。
1.2.3.2 肌红蛋白测定
参考曹雪涛[9]的方法并稍作修改。准确称取2 g切碎鱼肉,加入9倍质量0.04 mol/L,pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液,10 800 r/min高速匀浆30 s,冰浴1 h使其充分溶解。冰浴后在冷冻离心机中以10 000 r/min离心20 min,取上清液过滤,滤液在525 nm和700 nm下测定吸光度。总肌红蛋白的含量按公式(1)计算:
肌红蛋白/(mg/g)=(A525-A700)×23.03
(1)
式中:A525和A700分别为滤液在525 nm和700 nm下的吸光度;23.03为换算系数。
1.2.3.3 血红蛋白测定
血红蛋白采用试剂盒进行测定。
1.2.3.4 亚硝基血红素、总色素测定
参考徐洁洁[10]的方法并略作修改。取两份5 g鱼肉于离心管中,第一组加入21.5 mL提取液1(丙酮∶水=40∶3,体积比),第二组加入提取液2(丙酮∶水∶6 mol/L盐酸=40∶2∶1,体积比),均质后于4 ℃避光静置1 h取出,3 000 r/min离心10 min,取上清液过滤,第一组滤液在540 nm下测定其吸光度A540,第二组滤液在640 nm下测定其吸光度A640。亚硝基血红素和总色素含量的计算如公式(2)、公式(3)所示:
亚硝基血红素/(mg/kg)=A540×290
(2)
总色素/(mg/kg)=A640×680
(3)
式中:A540和A640分别为滤液在540 nm和640 nm下的吸光度;290和680为换算系数。
1.2.3.5 铁、铜、锌离子测定
参考王婷[11]的方法并稍做修改。将鱼肉样品切碎,称取0.1 g(精确至0.001 g)于消解管中,加入3.5 mL硝酸,进行微波消解,消解参数见表1。消解结束后将消解液转移至50 mL容量瓶中,用超纯水定容后过膜,用于ICP-MS测试,测试条件见表2。
表1 微波消解参数
Table 1 Microwave digestion indexes
步骤控制温度/℃升温时间/min恒温时间/min11205521505103190520
表2 ICP-MS仪器测试条件
Table 2 ICP-MS instrument testing conditions
参数名称/单位数值参数名称/单位数值射频功率/W1 500氦气流量/(mL/min)4～5等离子体其流量/(L/min)15雾化室温度/℃2载气流量/(L/min)0.80样品提升速率/(r/s)0.3辅助气流量/(L/min)0.40采样深度/mm8～10
1.2.3.6 血红素铁测定
参考李真等[12]的方法并稍做修改。将鱼肉切碎,取2.5 g碎肉于50 mL的离心管中,加入0.25 mL 6 mol/L盐酸、10 mL丙酮、0.5 mL去离子水,充分混合后避光放置1 h,使其充分溶解,8 000 r/min离心10 min,取上清液过滤并在640 nm处测定其吸光度。血红素铁含量的计算如公式(4)所示:
血红素铁/(mg/kg)=A640×680×0.088 2
(4)
式中:A640为滤液在640 nm下的吸光度;680和0.088 2为换算系数。
1.2.3.7 锌原卟啉测定
参考WU等[13]的方法略作修改。取2 g鱼肉于50 mL的离心管中,加入10 mL体积分数75%的冷丙酮溶液,10 000 r/min均质30 s,冰上避光静置30 min后8 000 r/min 离心5 min,上清液过滤后采用荧光检测器测定荧光强度,激发波长和发射波长分别设置为415 nm和590 nm。根据标准曲线计算样品中锌原卟啉的含量(mg/kg)。
1.3 数据处理
每项指标均重复3次,实验数据采用Excel制表及Origin 2023软件绘图,结果以平均值±标准误差的形式表示。采用SPSS 26.0进行显著性分析,P<0.05表示具有显著差异。
2 结果与分析
2.1 两种色泽腌鱼色差比较
暗红色腌鱼和黄白色腌鱼样品如图1所示,对2种样品的色差进行测定,结果如图2所示。可以看出暗红色鱼肉的L*值和b*低于黄白色鱼肉,a*值高于黄白色鱼肉,且黄白色鱼肉a*值为负。暗红色鱼肉红度值较高,而黄白色鱼肉红度值呈现负数,表示其颜色偏绿。黄白色鱼肉的b*值较高,可能是与其脂肪氧化程度较高,表面呈现淡黄色有关[14]。
图1 两种腌鱼样品外观图
Fig.1 Appearance of two types of cured fish samples
图2 两种色泽腌鱼色差比较
Fig.2 Comparison of color differences between two types of cured fish
注:不同小写字母表示为差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 两种色泽腌鱼呈色物质比较
肌红蛋白、金属元素、亚硝基血红素等均是影响腌肉制品色泽的关键呈色物质。对2种不同色泽腌鱼的呈色物质进行测定,结果如表3所示。暗红色鱼肉与黄白色鱼肉中肌红蛋白含量分别为7.32 mg/g和13.00 mg/g,暗红色鱼肉的红度值较高而肌红蛋白含量较低,表明肌红蛋白并不是导致其呈现红色色泽的关键因素。暗红色鱼肉与黄白色鱼肉中亚硝基血红素含量分别为69.21 mg/kg和5.41 mg/kg,总色素含量分别为83.64 mg/kg和13.15 mg/kg,暗红色鱼肉中亚硝基血红素和总色素含量均显著高于黄白色鱼肉(P<0.05),表明血红素含量可能是影响腌鱼红色色泽形成的主要因素。血红素主要存在于肌红蛋白和血红蛋白中,而暗红色鱼肉中肌红蛋白含量却明显低于黄白色鱼肉,由此推测暗红色腌鱼在腌制前鱼肉中可能含有较多的血红蛋白。而在2种色泽腌鱼中均未检测出血红蛋白,吴正洁[15]研究发现血红蛋白在39～41 ℃高温作用下,其空间结构会发生变化,可能会出现有序结构明显减少、无规则卷曲增加、血红蛋白卟啉环丢失或松散等现象。因此,腌鱼样品中未检测出血红蛋白可能是腌鱼在烘干过程中血红蛋白变性导致。
表3 两种色泽腌鱼肉中呈色物质含量比较
Table 3 Comparison of the content of coloring substances in two types of cured fish
指标/单位样品暗红色鱼肉黄白色鱼肉肌红蛋白/(mg/g)7.32±0.91b13.00±0.54a血红蛋白/(mg/kg)--亚硝基血红素/(mg/kg)69.21±1.17a5.41±0.17b总色素/(mg/kg)83.64±4.14a13.15±1.42b锌原卟啉/(mg/kg)--铜/(mg/kg)0.34±0.06a0.39±0.04a铁/(mg/kg)14.68±0.81a7.13±0.53b锌/(mg/kg)43.48±6.62a21.09±2.96b血红素铁/(mg/kg)7.23±0.72a0.75±0.21b
注:不同小写字母表示为差异显著(P<0.05);-为未检出。
铁、铜、锌等是影响肉品色泽的主要金属元素,这些金属元素都有显著的低氧化性,可以促进脂肪和肌红蛋白氧化并使肉的色泽发生改变[16]。暗红色鱼肉与黄白色鱼肉中铜含量分别为0.34 mg/kg和0.39 mg/kg,无显著差异(P>0.05)。铁在食品中以血红素铁和非血红素铁2种形式存在,血红素铁主要指铁卟啉类,主要与肌红蛋白和血红蛋白含量有关[11]。暗红色鱼肉与黄白色鱼肉中总铁含量分别为14.68 mg/kg和7.13 mg/kg,血红素铁含量分别为7.23 mg/kg和0.75 mg/kg,暗红色鱼肉中总铁和血红素铁含量均显著高于黄白色鱼肉(P<0.05),与总色素含量结果一致。暗红色鱼肉中锌含量较高为43.48 mg/kg,约为黄白色腌鱼的2.06倍,而呈红色色泽的色素物质锌原卟啉在两种腌鱼样品中均未测出,因此锌含量可能对腌鱼红色形成贡献较小。
据上述结果可以得出,较高的血红素含量对腌鱼红色色泽的形成有较大贡献。
2.3 不同宰杀方式对腌鱼呈色物质及色泽的影响
为进一步确证血红素在腌制鱼色泽形成中的作用,探究不同宰杀方式对鱼肉中血红蛋白残留量及腌鱼色泽的影响。
2.3.1 不同宰杀方式对鱼肉肌红蛋白和血红蛋白含量的影响
不同宰杀方式对鱼体中血液残留量有较大影响[17-19]。如图3所示,未放血和放血2种宰杀方式所得鱼肉肌红蛋白含量分别为3.08 mg/g和2.67 mg/g,血红蛋白含量分别为132.60 mg/kg和26.16 mg/kg。可以看出2种宰杀方式所得鱼肉肌红蛋白含量没有显著差异(P>0.05),这是由于肌红蛋白含量主要由鱼体本身决定,而未放血宰杀所得鱼肉血红蛋白含量约为放血宰杀鱼肉的5.07倍,因此宰杀方式显著影响中血红蛋白的含量。
图3 不同宰杀方式对鱼肉肌红蛋白和血红蛋白含量的影响
Fig.3 Effect of different slaughter methods on the content of myoglobin and hemoglobin in fish
2.3.2 不同宰杀方式对腌鱼色泽的影响
如图4所示,未放血宰杀所得腌鱼呈现出较强的红色,而放血宰杀所得腌鱼呈粉白色。色差结果如图5所示,与肉眼所见结果相符。由此可见,通过未放血宰杀调控鱼肉中血红蛋白含量,可以一定程度上提高腌鱼的红度。
图4 不同宰杀方式制得腌鱼外观图
Fig.4 Appearance of cured fish prepared by different slaughter methods
图5 不同宰杀方式对腌鱼色差的影响
Fig.5 Effect of different slaughter methods on the color difference of cured fish
2.3.3 不同宰杀方式对腌鱼亚硝基血红素和血红素铁含量的影响
肌红蛋白和血红蛋白中均含有血红素基团,可与亚硝酸盐还原的NO结合形成亚硝基肌红蛋白和亚硝基血红蛋白,经过烘干后部分蛋白变性,内部的亚硝基血红素配体脱离,形成亚硝基血红素,亚硝基血红素是腌肉制品中的主导色素[20]。如图6所示,未放血和放血宰杀腌制后鱼肉血红素铁含量分别为4.44 mg/kg和1.20 mg/kg,亚硝基血红素含量为13.05 mg/kg和5.03 mg/kg。结果表明,未放血宰杀腌制后鱼肉中血红素铁和亚硝基血红素含量均显著大于放血宰杀(P<0.05),这是由于经过未放血宰杀所得鱼肉中血红蛋白含量较高(图3),含有较多的血红素基团,可以与NO结合形成亚硝基血红素。
图6 不同宰杀方式对腌鱼亚硝基血红素和血红素铁含量的影响
Fig.6 Effect of different slaughter methods on the content of nitroso-heme and heme iron in cured fish
3 结论
通过对2种不同色泽腌鱼呈色物质进行分析,发现血红素含量是影响腌鱼色泽的主要因素。采用不同宰杀方式控制鱼体血红素含量来验证该结论,发现未放血宰杀所得鱼肉中含有较多血红蛋白,且经亚硝酸盐腌制后呈现更强的红色。因此,适当控制鱼肉中血液残留可以增强腌鱼的红色呈色效果。
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