高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)的患病率逐年攀升,已成为继Ⅱ型糖尿病后的第二大代谢性疾病[1]。HUA引起的血清尿酸(uric acid,UA)水平异常升高,不仅导致痛风性关节炎等直接危害,还与肾脏疾病、心血管疾病等多种严重疾病密切相关,极大地影响患者的生活质量[2-3]。因此,探索安全有效的辅助缓解策略对于提高高尿酸血症患者的生活质量具有重要意义。
近年来,相关研究发现益生菌具有降低UA水平的潜力,为高尿酸血症的预防和治疗提供了新的思路。作为最具价值的益生菌之一,植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)因其安全性(Generally Recognized as Safe,GRAS)被广泛应用于食品工业[4-5]。且有研究显示,植物乳植杆菌作为益生菌,在调节肠道菌群结构与功能方面发挥着积极作用[6-7]。据报道,植物乳植杆菌LLY-606可以通过调节肠道微生物群落改善高尿酸血症引起的肠道菌群失调[8]。植物乳植杆菌可通过多种机制降低UA水平,包括抑制UA合成、调节UA排泄和改善肠道菌群等[9]。此外,植物乳植杆菌还可通过降解肠道嘌呤、抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)活性及调控尿酸转运蛋白表达等多途径降低UA水平[10]。
生物活性物质因能调节肠道微生态等而备受关注[11]。值得注意的是,葛根素通过抑制UA生成、促进UA排泄、拮抗氧化应激及保护肾功能等途径,显著改善HUA[12],曾有研究证明,葛根素能够剂量依赖性地降低XOD的活性[13]。此外,葛根素可通过抑制NF-κB(nuclear factor-kappa B)和MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号通路,减少促炎因子表达,增强抗氧化酶活性,间接减轻尿酸结晶诱导的炎症反应和组织损伤[14]。然而,现有研究多局限于单一成分的作用评价,益生菌与植物活性成分的联合使用对HUA的缓解机制尚不明确,制约了功能性合生元产品的开发。
本研究旨在探讨植物乳植杆菌与葛根素联合应用对HUA小鼠的缓解作用,重点分析其对肾脏和肠道炎症反应、氧化应激水平以及肠道微生态的调节效应。通过评估联合干预对HUA小鼠肾功能及肾脏病理损伤的保护作用,以及对结肠病理损伤和肠道屏障功能的修复作用,进一步阐明该联合策略缓解HUA的潜在机制,从而为开发降尿酸功能性食品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
雄性SPF级C57BL/6小鼠42只,体质量(22±2) g,北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物许可证号SCXK(京)2021-0006。葛根素、别嘌呤醇、氧嗪酸钾、腺嘌呤,上海阿拉丁生化科技有限公司;羧甲基纤维素钠,北京太阳生物科技有限公司;体积分数4%多聚甲醛固定液,Biosharp公司;UA、肌酐(creatinine,CRE)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)试剂盒,南京建成生物工程研究所;IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α试剂盒,江苏酶免实业有限公司;总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒,南京诺唯赞生化科技有限公司。
1.2 仪器和设备
GM-21M高速冷冻离心机,湖南湘仪离心机仪器有限公司;UV-6100紫外可见光分光光度计,Shimadzu公司;LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;RM2016病理切片机,上海徕卡仪器有限公司;Imark酶标仪,美国伯乐公司;A600荧光定量PCR仪,美国Life Technologies公司;徕卡DM-8倒置荧光显微镜,德国徕卡仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 植物乳植杆菌菌悬液与葛根素溶液的制备
菌悬液的制备:实验所用菌株保藏在东北农业大学乳品科学教育部重点实验室。依据马佳歌等[15]的方法制备菌悬液,以2%接种量将植物乳植杆菌接种于MRS肉汤培养基中,在37 ℃下培养18 h,2次传代培养后,以8 000×g的离心条件,离心10 min,得到菌体沉淀。经无菌PBS洗涤2次后,制备107 CFU/mL和109 CFU/mL的浓度梯度的菌悬液。
灌胃样品的制备:将葛根素溶解于PBS中,调整葛根素溶液质量浓度为5、10 mg/mL
1.3.2 动物实验
选取42只雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组(CON)、模型组(HUA)、阳性对照组(PC)、植物乳植杆菌联合葛根素(the combination of L.plantarum KLDS1.0328 and puerarin,CLP)1组(CLP1)、2组(CLP2)、3组(CLP3)、4组(CLP4),每组6只。在(22±2) ℃、相对湿度(55±5)%的标准环境下,允许小鼠自由进食和饮水,光照/黑暗交替12 h。适应1周后,以100 mg/kg腺嘌呤和200 mg/kg氧嗪酸钾悬浮液灌胃建立HUA模型。除CON组外,其余小鼠均进行造模处理14 d。CON组小鼠给予相同体积的5 g/L羧甲基纤维素钠溶液。造模2 h后,除CON组和HUA组小鼠外,其余各组小鼠均予灌胃,连续灌胃21 d。PC组给予别嘌呤醇5 mg/kg灌胃。CLP1、CLP2、CLP3和CLP4组分别灌胃107 CFU/mL植物乳植杆菌和50 mg/kg葛根素、107 CFU/mL植物乳植杆菌和100 mg/kg葛根素、109 CFU/mL植物乳植杆菌和50 mg/kg葛根素以及109 CFU/mL植物乳植杆菌和100 mg/kg葛根素。CON组和HUA组小鼠给予相同体积的PBS处理。12 h的禁食与禁水后,麻醉小鼠,进行眼球采血,静置2 h后以3 000×g离心10 min,收集上层血清保存在-20 ℃。颈椎脱臼处死小鼠。快速采集脾脏、肝脏和肾脏,称重,计算各器官与体质量之比(脏器指数)。本实验已获中国东北农业大学伦理委员会批准(NEAUEC20240440)。
1.3.3 血清和肝脏生化指标检测
在4 ℃条件下解冻血清样本,采用生化试剂盒测定UA、CRE和BUN浓度,采用生化试剂盒测定血清和肝脏XOD活性。
1.3.4 肾脏和结肠组织病理学观察
结肠与肾脏组织样本经体积分数4%多聚甲醛室温固定24 h后,梯度脱水,石蜡包埋后切片,经梯度脱蜡及乙醇复水后,用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H&E),并进行组织病理学分析。
1.3.5 肾脏和结肠生化指标检测
1.3.5.1 炎症因子测定
按照ELISA试剂盒检测各组小鼠肾脏和结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表达水平。
1.3.5.2 抗氧化指标测定
按照试剂盒说明书检测各组小鼠肾脏和结肠组织中GSH-Px、SOD、MDA和MPO水平。
1.3.6 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)测定小鼠结肠组织紧密连接蛋白
实时荧光定量逆转录PCR测定方法基于WANG等[16]的基础上略作修改。采用Trizol法从结肠组织样本中提取总RNA。取500 ng RNA样本通过第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录反应。实时定量PCR实验在BioRad CFX Connect系统完成,反应程序设置为:预变性95 ℃/10 min;40个循环的变性95 ℃/10 s与退火延伸60 ℃/30 s。检测靶基因包括紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参基因进行表达量标准化。基于2-ΔΔCt算法计算基因相对表达量。引物序列如表1所示。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequence
名称前端引物(5′-3′)后端引物(5′-3′)Claudin-1GGGGACAACATCGTGACCGAGGAGTCGAAGACTTTGCACTOccludinTTGAAAGTCCACCTCCTTACAGACCGGATAAAAAGAGTACGCTGGZO-1AACCCGAAACTGATGCTGTGGATAGCGCCCTTGGAATGTATGTGGAGAGGAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
1.3.7 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平
将肾脏和结肠组织切块后,按1∶10(g∶L)料液比加入含蛋白酶抑制剂的提取试剂,冰上匀浆并孵育30 min。离心后取上清进行SDS-PAGE电泳,转至聚偏二氟乙烯膜后封闭1 h。依次与一抗(ABCG2、GLUT9、URAT1、NLRP3、NF-κB、β-actin)4 ℃孵育过夜,用含吐温20的Tris缓冲盐溶液洗涤后与二抗室温孵育30 min。增强化学发光显影后,用ImageJ分析蛋白表达。
1.3.8 16S rRNA菌群测定
收集CON组、HUA组、PC组和CLP4组小鼠盲肠内容物样本进行16S rRNA基因高通量测序分析。使用OMEGA Soil DNA Kit提取基因组DNA。扩增细菌16S rRNA基因V3～V4区,进行细菌鉴定。使用Illumina NovaSeq平台对DNA样本进行配对端测序。对过滤后的得到的有效Tags进行聚类分析,获得操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)的代表序列。
1.4 数据分析
所有数据均以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 27.0.1软件进行统计分析。采用单因素方差分析,分析不同处理组之间统计学差异,并用Duncan检验进行多重比较。P<0.05在统计学意义上有差异,P>0.05为统计学上差异不显著。
2 结果与分析
2.1 CLP对HUA小鼠脏器指数的影响
脏器指数是评估脏器健康和功能状态的常用指标[17]。如表2所示,与CON组相比,HUA组的肝脏指数显著提高,表明氧嗪酸钾和腺嘌呤处理可能导致HUA小鼠肝脏代谢负担加重。PC组脏器指数相较于HUA组显著降低,但仍显著高于CON组(P<0.05)。与HUA组相比,CLP4组干预后,肝脏指数降低至(4.15±0.30)%,肾脏指数降低至(1.92±0.09)%,脾脏指数降低至(0.27±0.03)%(P<0.05),表明高浓度植物乳植杆菌联合高浓度葛根素处理能够最为有效地缓解HUA对小鼠脏器的损伤。
表2 不同样品干预后HUA模型小鼠的脏器指数 单位:%
Table 2 Organ index of HUA model mice after intervention with different samples
组分肝脏指数/%肾脏指数/%脾脏指数/%CON4.06±0.21c1.33±0.14c0.25±0.04cHUA4.86±0.59a2.12±0.14a0.35±0.01aPC4.35±0.39abc1.70±0.09b0.27±0.02bcCLP14.37±0.42abc1.94±0.12ab0.31±0.03abCLP24.52±0.70abc2.03±0.21a0.32±0.05abCLP34.77±0.09ab1.93±0.11ab0.31±0.01abCLP44.15±0.30bc1.92±0.09ab0.27±0.03bc
注：同一列上标注字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.2 CLP对HUA小鼠UA和XOD活性的影响
如图1-A所示,经氧嗪酸钾联合腺嘌呤诱导后,模型组UA浓度显著升高至(228.06±3.57) μmol/L,证实了HUA动物模型的成功构建。PC组、CLP1、CLP2、CLP3和CLP4干预组小鼠UA浓度与模型组相比显著降低(P<0.05),并且CLP4组UA水平显著低于PC、CLP1、CLP2和CLP3组(P<0.05)。结果表明,CLP干预对UA水平有显著影响,且呈剂量依赖性(P<0.05)。由此可知,CLP具有良好的降尿酸功效。本研究未设单独对照组,但文献[18]显示单用植物乳植杆菌时UA降低了37.48%,而CLP4组达82.98%,显著更优。
A-血清UA水平;B-肝脏XOD活性;C-血清XOD活性
图1 CLP对HUA小鼠尿酸和XOD的影响
Fig.1 The effect of CLP on uric acid and XOD in HUA mice
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
A-血清BUN浓度;B-血清CRE浓度;C-肾脏HE染色
图2 CLP对HUA小鼠肾脏损伤的影响
Fig.2 The effect of CLP on renal injury in HUA mice
如图1所示,HUA组肝脏和血清XOD活性显著升高(P<0.05),别嘌呤醇和CLP干预均显著降低XOD活性(P<0.05)。CLP2、CLP3、CLP4组XOD活性显著低于HUA组(P<0.05),其中CLP2和CLP4显著低于CLP1和CLP3组(P<0.05)。文献表明,植物乳植杆菌和葛根素可抑制XOD活性[10,12]。有类似文献报道,四妙散对XOD活性具有抑制作用[19]。表明抑制XOD是CLP降低尿酸的关键机制之一。
2.3 CLP对HUA小鼠肾脏损伤的影响
如图2所示,与CON组相比,HUA小鼠的血清CRE和BUN含量显著上升,表明HUA导致了小鼠肾脏功能损伤(P<0.05)。与HUA组比较,PC、CLP2、CLP3、CLP4组血清CRE和BUN水平均显著降低(P<0.05),其中CLP4组血清BUN显著低于PC、CLP1和CLP3组(P<0.05)。如图2-C所示,HUA组小鼠肾小管上皮细胞排列紊乱,出现坏死和胞质空泡化,肾小管扩张并伴有炎症细胞浸润。文献报道,HUA可导致小鼠肾功能障碍和肾脏病理损伤[20-21]。CLP干预显著减轻了这些组织改变,表明其能改善肾功能障碍和肾脏损伤,从而缓解HUA。
2.4 CLP对HUA小鼠结肠损伤及紧密连接蛋白的影响
如图3-A所示,与CON组相比,HUA组显示出严重的组织损伤,隐窝结构排列不规则,伴随大量的炎性细胞浸润和显著的杯状细胞减少。在CLP4干预后,结肠形态得到改善,隐窝结构有所恢复,杯状细胞数量逐渐增加,但仍存在一定的炎性细胞浸润。此外,CLP对肠道屏障功能也产生了积极影响。研究发现,HUA可损害肠道屏障,影响Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达[22-23]。CLP干预后,这些蛋白的mRNA表达显著升高(P<0.05),表明CLP通过改善肠道屏障完整性,促进尿酸排泄。
A-结肠HE染色;B-ZO-1的mRNA表达;C-Claudin-1的mRNA表达;D-Occludin的mRNA表达
图3 CLP对HUA小鼠结肠损伤的影响
Fig.3 The effect of CLP on colon injury in HUA mice
A-肾脏IL-1β水平;B-肾脏IL-6水平;C-肾脏IL-10水平;D-肾脏TNF-α水平
图4 CLP对HUA小鼠肾脏炎症的影响
Fig.4 The effect of CLP on renal inflammation in HUA mice
2.5 CLP对HUA小鼠炎症因子的影响
肾脏炎症可能减少UA的排泄,而长期UA升高又可能进一步诱导肾脏炎症并损伤肾脏[24]。肾脏炎症可能导致UA排泄减少,而UA升高又可加剧肾脏炎症并损伤肾脏。由图4和图5可知,HUA小鼠的肾脏和结肠组织中,促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著高于CON组,而抗炎因子IL-10水平显著降低(P<0.05)。研究表明,UA升高与肾脏促炎因子升高和抗炎因子降低相关[25]。CLP干预组与HUA组相比,促炎因子浓度显著降低,IL-10浓度显著升高(P<0.05),且CLP4组的TNF-α浓度低于CLP1和CLP3组,呈现剂量依赖性(P<0.05)。在结肠组织中,CLP2、CLP3和CLP4组同样显示促炎因子水平显著降低,IL-10水平升高(P<0.05)。这些结果表明,CLP干预能抑制HUA小鼠的肾脏和结肠炎症反应。
A-结肠IL-1β水平;B-结肠IL-6水平;C-结肠IL-10水平;D-结肠TNF-α水平
图5 CLP对HUA小鼠结肠炎症的影响
Fig.5 The effect of CLP on colon inflammation in HUA mice
A-肾脏SOD活性;B-肾脏GSH-Px含量;C-肾脏MDA含量;D-肾脏MPO活性
图6 CLP对HUA小鼠肾脏氧化应激的影响
Fig.6 The effect of CLP on renal oxidative stress in HUA mice
A-结肠SOD活性;B-结肠GSH-Px含量;C-结肠MDA含量;D-结肠MPO活性
图7 CLP对HUA小鼠结肠氧化应激的影响
Fig.7 The effect of CLP on colon oxidative stress in HUA mice
2.6 CLP对小鼠氧化应激的影响
相关研究表明,过量尿酸蓄积会显著提升活性氧生成,导致氧化应激状态[26]。由图6可知,在肾脏组织中,HUA组的SOD活性和GSH-Px含量显著下降,MDA含量和MPO活性显著增加(P<0.05)。CLP干预对HUA小鼠的氧化应激指标具有显著影响。CLP2、CLP3、CLP4组小鼠肾脏MDA含量显著降低,CLP1、CLP2、CLP3、CLP4组MPO活性均显著低于HUA组(P<0.05)。由图7可知,HUA组小鼠结肠组织的MDA含量和MPO活性显著高于CON组(P<0.05),而CLP4组的结肠MPO活性显著恢复(P<0.05)。CLP4组的肾脏和结肠GSH-Px含量显著高于CLP1、CLP2、CLP3组,表明CLP的抑制作用具有剂量依赖性。这些结果表明,CLP干预能显著逆转氧化应激指标,且具有剂量依赖性,提示其可能通过调节氧化应激来延缓HUA所致的慢性肾损伤。
2.7 CLP对小鼠尿酸转运蛋白的影响
尿酸代谢依赖尿酸转运蛋白(如ABCG2、GLUT9、URAT1)的平衡[27]。如图8所示,HUA组小鼠肾脏GLUT9和URAT1显著升高,结肠ABCG2表达受抑制(P<0.05)。CLP4干预后,肾脏尿酸重吸收蛋白显著下调,结肠ABCG2表达显著升高(P<0.05)。结果表明,CLP通过抑制肾脏尿酸重吸收和促进结肠尿酸排泄发挥降尿酸作用。
A-肾脏GLUT9和URAT1蛋白条带;B-肾脏GLUT9蛋白表达量;C-肾脏URAT1蛋白表达量;D-结肠ABCG2蛋白条带;E-肾脏ABCG2蛋白表达量
图8 CLP对HUA小鼠转运蛋白的影响
Fig.8 The effect of CLP on the transporter protein in HUA mice
2.8 CLP对小鼠NF-κB/NLRP3炎症通路的影响
在HUA的发展过程中,炎症的异常调节是一个突出的驱动因素。在NLRP3炎性小体激活的典型途径中,NF-κB信号级联的参与启动了NLRP3的启动,随后导致促炎因子释放,导致炎症反应[28-29]。如图9所示,与CON组相比,HUA组NLRP3、NF-κB蛋白表达显著升高(P<0.05)。与HUA组比较,别嘌呤醇及CLP均可降低HUA小鼠结肠中NF-κB和NLRP3的表达,且以CLP4组作用更强(P<0.05)。结合前期的研究结果,CLP4处理显著降低了HUA小鼠肾脏和结肠中的IL-1β的水平。结果表明,CLP可能通过抑制NLRP3/NF-κB通路的激活,进而减少关键促炎因子IL-1β的释放,从而缓解HUA小鼠的炎症反应。
A-结肠NLRP3和NF-κB蛋白条带;B-结肠NLRP3蛋白表达量;C-结肠NF-κB蛋白表达量
图9 CLP对HUA小鼠NF-κB/NLRP3炎症通路的影响
Fig.9 The effect of CLP on the NF-κB/NLRP3 inflammatory pathway in HUA mice
A-Chao 1指数;B-Simpson指数;C-Shannon指数;D-Observe species
图10 Alpha多样性指数箱线图
Fig.10 The boxplot of Alpha diversity index
2.9 CLP对小鼠肠道菌群的影响
如图10所示,HUA小鼠肠道微生物群落的物种丰富度显著受损(P<0.05)。如图11所示,主坐标分析和非度量多维标度揭示HUA组与CON组肠道菌群组成存在差异。CLP4干预后,厚壁菌门、拟杆菌门以及硫杆菌门相对丰度恢复。在属水平上,Angelakisellahe和Bilophila的丰度恢复,说明CLP4干预缓解了HUA诱导的菌群失调。同时,LEfSe结果表明,Lactobacillus在CLP4组中显著富集。此外,CLP干预还恢复了乳酸杆菌的相对丰度。由此可知,CLP通过恢复菌群多样性、调节优势菌属丰度及抑制炎症相关菌属,有效改善肠道微生态失衡,为HUA的治疗提供了新思路。
A-主坐标分析;B-非度量多维标度分析;C-门水平相对丰度;D-属水平相对丰度;E-LEfSe分析
图11 肠道菌群物种组成及物种差异分析
Fig.11 Analysis of species composition and species differences in gut microbiota
注:线性判别分析效应值[linear discriminant analysis (LDA) effect size, LEfSe]
3 结论
本研究探究了CLP对腺嘌呤和氧嗪酸钾诱导的HUA小鼠降尿酸作用。通过血清、肠肾生化指标、肠肾病理切片以及肠道菌群的研究,实验结果表明,与HUA组相比,CLP干预后,血清UA水平明显降低,特别注意的是,CLP4组血清UA水平降低至(38.81±6.78) μmol/L(P<0.05)。通过抑制血清和肝脏中XOD活性和减轻肾功能损伤,减少UA生成。同时,CLP通过调节尿酸转运蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2的表达,抑制尿酸重吸收及促进尿酸排泄。此外,CLP通过抑制NLRP3/NF-κB信号通路以及调控肠道菌群,显著降低了HUA小鼠肾脏和结肠的氧化应激和炎症反应,缓解了HUA小鼠的肾脏和结肠的病理学损伤。因此,CLP为益生菌和生物活性物质的利用提供了理论基础,有望为新型功能性食品的开发和应用通过研究支持,但CLP对调节尿酸代谢的具体分子机制还需进行进一步的研究。
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