酪蛋白(casein,CN)作为牛乳中含量最丰富的蛋白质,具有良好的界面活性和纳米颗粒包封特性等,在乳制品、肉制品等行业具有重要的应用价值[1]。CN是一种磷酸化程度较高的蛋白,主要由αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN这4种亚基构成;4种亚基通过疏水相互作用、钙桥等与磷酸钙形成直径约80～400 nm的球形聚合体,称为酪蛋白胶束(micellar casein,MC)[2]。
MC的分子构象和表面电荷受pH调控,不同pH条件下分子内静电作用与疏水作用的动态平衡会导致胶束结构的变化[3]。pH值的变化会导致MC结构中离子的解离,使水分子更易渗入MC的聚集结构中,从而改变其溶解行为[4]。LIU等[5]研究了在不同pH值(6.0～12.0)下牦牛乳酪蛋白的结构及功能特性,发现随着pH值升高,牦牛乳酪蛋白的提取率逐渐提高,pH值为10.0时其乳化性最好,归因于碱性pH处理导致酪蛋白解折叠并暴露疏水基团,从而改善了其乳化特性;当pH值为9.0时,酪蛋白聚合物未完全解离,胶束间静电斥力增大,其热稳定性最高,进一步证实了pH对酪蛋白特性的调控作用。课题组前期研究发现,随着pH值的增加(6.8～8.2),牦牛乳MC逐渐解离,游离磷酸钙和酪蛋白单体含量增加,疏水性减小,内源荧光强度增大[6]。因此,pH是一种调控MC结构及性质的有力手段,弱碱性pH可促使MC部分解离,从而改善其功能性质。
近年来,超声技术作为一种新兴的低能耗物理改性手段,在改善乳蛋白结构、溶解性、乳化性和凝胶性能方面展现出显著优势[7]。超声处理能够通过空化效应、机械振动及剪切力等物理机制,诱导蛋白质分子构象发生变化[8]。超声空化作用产生的局部高压和高温可破坏蛋白质次级键(如氢键和疏水相互作用),导致蛋白质分子舒展,亲水性残基暴露;持续的机械效应则能促使蛋白质解聚或重排,从而调控其溶解性、表面疏水性、发泡性、乳化性及热稳定性等性质[9]。ZHANG等[10]研究了超声处理MC浓缩物,发现其溶解性、凝胶性、乳化性均随着超声时间的延长显著增加,归因于超声处理使MC构象变化,亲水区域暴露,促进了水-蛋白质相互作用。课题组前期研究发现,超声处理时间从6 min延长至10 min时,MC在pH 4.0～8.0因粒径减小促使溶解性增大,热稳定性降低,模拟胃肠道消化性能提升[11]。综上所述,超声处理可用于调控MC结构,进而改变其功能特性。
单一的改性方法虽然能够在一定程度上改善MC的功能特性,但其改性效果往往存在局限性。相比之下,多技术协同处理(如高压均质-酶水解联合、超声-pH结合等)可通过互补效应更高效地改善蛋白质的性质,获得更理想的改性效果[12]。GAO等[13]研究发现超声波和碱性条件协同可改变乳清分离蛋白的二级结构,增强其乳化性能;与单一碱性pH改性相比,超声辅助使乳清分离蛋白的粒径分布变得更窄,因此乳化性得以改善。MADADLOU等[14]以35 kHz的频率超声结合pH调控处理CN,发现随着pH值(6.35、8.0、9.7、11.4)的增加,CN的粒径逐渐增大;不同pH下CN浊度和粒径均随着超声功率的增加而减小。FU等[15]研究pH结合超声处理甜瓜籽蛋白发现,在pH值为5.0、7.0、9.0、11.0时,超声处理组的表面疏水性和游离巯基含量更高,粒径显著减小;pH值为9.0时,超声处理组的乳化活性指数为32.34 m2/g,较未超声处理样品高11.23 m2/g。由此可见,超声结合弱碱性pH处理对蛋白质的改性效果优于单一改性技术。然而,pH结合超声处理对MC结构及性质的影响研究鲜有报道。
本研究以MC为原料,设置体系pH值为7.0、8.0、9.0、10.0,超声时间为10 min,对其进行pH结合超声改性;采用粒径、zeta-电位、傅立叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、荧光光谱、紫外-可见光谱、扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)等手段表征了处理前后MC的结构变化,深入分析了MC溶解性、乳化性、发泡性、热稳定性、流变性、消化性及其消化产物的降糖活性等变化规律,探讨了pH结合超声处理对MC功能性质的作用机制,以期为酪蛋白的结构调控提供理论依据,为高品质酪蛋白产品开发提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究所用巴氏杀菌牛乳由兰州庄园牧场有限公司(甘肃)提供;4 ℃冷藏环境下贮存。
三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、胃蛋白酶(15 000 U/g)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷(4-nitrobenzene-α-D-glucoside,PNPG)、DNS、阿卡波糖、可溶性淀粉溶液,山东科源生化有限公司;胰蛋白酶(>2 500 U/mg)、α-淀粉酶(35 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(50 U/mg),上海Macklin生化科技有限公司;SDS,天津市百世化工有限公司;氢氧化钠、盐酸、无水碳酸钠,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SFX550超声波破碎仪,美国Branson超声波公司;NAI-GZJ喷雾干燥机,上海那艾精密仪器有限公司;H1850台式高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;RNF0460-016卷式膜多功能设备,厦门福美科技有限公司;AD500S-H均质机,上海昂尼仪器仪表有限公司;Bettersize2000激光粒度分布仪,丹东百特仪器有限公司;UV-1789紫外可见分光光度计,岛津仪器有限公司;NicoletIs50 FTIR,赛默飞世尔科技公司;RF-5301PC荧光分光光度计,日本岛津公司;STA449F5同步热分析仪,德国耐驰仪器制造有限公司;Phenom Pure台式SEM,Phenom科学仪器有限公司;RH30流变仪,上海保圣实业有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MC的制备
参考课题组前期方法[11],将新鲜牛乳在8 000×g下离心30 min,经脱脂棉过滤去除脂肪层后,使用100 kDa截留分子质量的卷式超滤膜进行4倍浓缩。所得截流液冷冻干燥后即为MC粉末样品,4 ℃冷藏备用。
将MC粉末溶于去离子水,分别调节溶液pH值至7.0、8.0、9.0、10.0,定容,使MC终质量浓度为40 mg/mL。取30 mL溶液置于冷却夹套玻璃容器中,超声处理10 min,超声频率20 kHz,振幅40%,采用脉冲模式,开启时间为5 s,关闭时间为5 s;喷雾干燥后收集,即得超声结合pH处理的MC样品,分别标记为U-pH 7、U-pH 8、U-pH 9、U-pH 10。以未超声处理的MC样品作为对照组,分别标记为pH 7、pH 8、pH 9、pH 10。
1.3.2 粒径及zeta-电位测定
配制质量浓度为40 mg/mL的样品溶液,用去离子水稀释至1 mg/mL。使用激光粒度分布仪测定粒径及电位,介质和样品折射率分别为1.33和1.35,水作为分散剂[15]。
1.3.3 紫外光谱测定
样品经去离子水稀释至0.5 mg/mL后,于200～650 nm的波长进行紫外-可见光谱扫描,去离子水做空白对照[11]。
1.3.4 内源荧光测定
样品溶液经去离子水稀释至终质量浓度0.5 mg/mL后,利用荧光分光光度计扫描其荧光发射光谱。发射光谱范围:290～450 nm;激发波长:280 nm;激发波长与发射波长狭缝:10 nm[16]。
1.3.5 FTIR测定
MC粉末的红外分析采用ATR-FTIR法测定,将样品直接置于ATR晶体表面,透射模式下扫描范围设置为4 000～400 cm-1;分辨率:32 cm-1;扫描次数:32次[10]。
1.3.6 SEM观察
取适量样品均匀涂布于铜台表面的导电胶上,喷金后在10 kV的加速电压下观察形貌[17]。
1.3.7 SDS-PAGE
配制质量浓度为40 mg/mL的样品溶液,超高速离心1 h(60 000×g,4 ℃)后收集上清液,与上样缓冲液按照1∶1的体积比混合,于漩涡混合器上涡旋1 min,水浴煮沸4 min,冰水冷却后离心5 min(4 000×g)。使用微量移液器将15 μL的待测混合液注入SDS-PAGE凝胶加样孔,采用恒压电泳模式(120 V)运行电泳,待电泳结束后对凝胶进行固定-染色-脱色处理,分析MC的解离情况[10]。
1.3.8 溶解性测定
参考CANO-CHAUCA等[17]的方法,略有修改。将MC粉末溶解在50 mL去离子水中,配制终质量浓度为10 mg/mL的样品溶液,于45 ℃恒温磁力搅拌器中搅拌2 h,确保充分溶解,室温放置2 h使得体系稳定。取10 mL MC溶液转移至已恒重的15 mL离心管中,4 000×g下离心15 min,弃去上清液,保留沉淀。于60 ℃烘箱中干燥至恒重,记录沉淀质量m0,10 mL溶液中蛋白质质量记为m1。溶解度的计算如公式(1)所示:
溶解度
(1)
1.3.9 热稳定性测定
MC的热稳定性通过热重-差示扫描量热同步热分析仪评估。将5～10 mg MC粉末置于氧化铝坩锅中,空白坩埚作为参比。升温速率:5 ℃/min;温度范围:30～600 ℃[18]。
1.3.10 流变性测定
用流变仪测定样品的流变性。将MC溶液(4%,质量分数)平铺在平行板(直径50 mm,间隙1 mm)上,于25 ℃下保持平衡2 min;采用振幅扫描模式,剪切应变范围:0.1%～100%;记录储能模量(G′)和损耗模量(G″)[19]。
1.3.11 乳化性测定
参考WU等[20]的方法,将24 mL 2 mg/mL样品溶液与8 mL大豆油混合,使用高速均质机(10 000 r/min)均质1 min,形成均匀的乳液。分别取50 μL静置0、10、30 min时容器底部的乳化液,加入5 mL 1 g/L SDS溶液,在漩涡混合器上涡旋混匀,以SDS溶液做参比,于500 nm下测定吸光度值。乳化活性指数和乳液稳定性指数的计算如公式(2)和公式(3)所示:
乳化活性指数
(2)
乳液稳定性指数
(3)
式中:C,MC初始质量浓度,g/mL;θ,油相体积分数,25%;φ,比色池光径,1 cm;A0/10/30,乳液分别静置0、10、30 min的吸光度值。
1.3.12 发泡性测定
参考MOTOI等[21]的方法,取30 mL 40 mg/mL MC溶液于50 mL的烧杯中,使用高速均质机(10 000 r/min)均质1 min,形成初始泡沫。立即记录初始溶液体积V,静置30 min后,测定剩余溶液体积V0。发泡性和泡沫稳定性的计算如公式(4)和公式(5)所示:
发泡性
(4)
泡沫稳定性
(5)
式中:V0,均质前溶液体积,mL;V1,均质后0 min时溶液体积,mL;V2,均质后30 min时溶液体积,mL。
1.3.13 体外模拟消化实验
1.3.13.1 模拟胃肠道消化液的配制
模拟胃液:溶解0.2 g NaCl和1.6 g胃蛋白酶于去离子水中,用1 mol/L的HCl溶液调pH值至2.0,定容至100 mL。模拟肠液:溶解0.68 g KH2PO4和0.25 g胰蛋白酶于去离子水中,调pH值至7.4,定容至100 mL。上述溶液现用现配。
1.3.13.2 消化方法
模拟胃肠道消化方法参考YANG等[22]的方法,略有修改。移取20 mL的模拟胃液或肠液置于离心管中,加入20 mL 40 mg/mL样品溶液,立即放入37 ℃的恒温振荡器中以150 r/min的转速振荡。于不同时间节点取样5 mL,置于沸水浴中煮沸5 min以灭活消化酶,迅速冰浴冷却以终止反应。模拟胃消化阶段于0、60、120和180 min取样。模拟肠消化阶段于0、30、60、90、120、180、240 min取样。
1.3.13.3 可溶性氮含量测定
参考WANG等[23]的方法,将3 mL的消化产物置于15 mL的离心管中,加入等体积的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液(10%,质量分数),混匀后4 ℃静置30 min,并在4 ℃下充分沉淀12 h,10 000×g离心15 min,使用紫外分光光度计在280 nm处测定上清液的吸光度值,去离子水作为参比调零。
1.3.13.4 降糖活性测定
将MC的消化产物在10 000×g离心15 min,取上清液测定其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制,1 mg/mL阿卡波糖溶液作为阳性对照。
a)α-葡萄糖苷酶抑制率的测定
参照LYU等[24]的方法,用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)配制0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液,同缓冲液配制1 mg/mL的PNPG溶液。取100 μL的消化产物上清液(离心后)与100 μL的α-葡萄糖苷酶涡旋混合2 min,确保充分混匀,于37 ℃孵育10 min。将100 μL PNPG溶液作为底物加入到反应体系中,于37 ℃孵育20 min。向反应体系中加入10 mL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液,充分混匀以终止酶促反应,在405 nm波长处测定溶液的吸光度值。按公式(6)计算α-葡萄糖苷酶抑制率:
α-葡萄糖苷酶抑制率
(6)
式中:A1,消化产物在405 nm处的吸光度;A2,不加消化产物时PNPG和酶在405 nm处的吸光度;A3,不加酶时PNPG和消化产物在405 nm处的吸光度;A4,PNPG在405 nm处的吸光度。
b)α-淀粉酶抑制率的测定
参照WANG等[25]的方法,使用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)配制1 U/mL的α-淀粉酶溶液,同缓冲液配制10 mg/mL的可溶性淀粉溶液。取100 μL的消化产物离心上清液,与100 μL的α-淀粉酶溶液涡旋混合2 min,于37 ℃下孵育10 min。随后,向混合液中添加200 μL可溶性淀粉溶液,于37 ℃下孵育20 min。向样品中加入400 μL DNS试剂,充分混匀后置于沸水浴中加热10 min,随后将样品冷却至室温,以稳定显色产物,在540 nm波长处测定溶液吸光度值。按公式(7)计算α-淀粉酶抑制率:
α-淀粉酶抑制率
(7)
式中:A1,消化产物在540 nm处的吸光度;A2,不加消化产物时可溶性淀粉溶液和酶在540 nm处的吸光度;A3,不加酶时消化产物和可溶性淀粉溶液在540 nm处的吸光度;A4,可溶性淀粉溶液在540 nm处的吸光度值。
1.4 数据统计分析
每组实验独立重复3次,采用SPSS 26软件进行单因素方差分析,P<0.05时判定为具有统计学显著性差异;利用Origin 2021软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 pH结合超声处理对MC结构的影响
2.1.1 粒径和zeta-电位
pH结合超声处理前后MC的粒径及多分散性指数(polydispersity index,PDI)变化如图1-a所示。未超声样品的粒径随着pH值的增加呈现先增大后减小的趋势,在pH值为9.0时达到最大值[(383.54±8.70) nm],且显著高于其他pH下的粒径(P<0.05)。与未超声样品相比,超声后MC的粒径显著降低(P<0.05),在pH值为9.0时达到最小值[(184.75±1.55) nm],pH值为10.0时略有升高。如粒度分布图1-b所示,粒度分布与粒径变化趋势基本一致,未经超声处理的样品随pH值的增大其粒度分布向小粒径偏移。超声处理后,相同pH下MC的粒度分布变窄,且向小粒径偏移,在pH值为9.0时粒度分布最窄。就PDI而言,其随着pH值的增加而略有增大,这是因为MC出现解离所致。而超声后样品的PDI均显著小于未超声样品(P<0.05)。
a-粒径;b-粒径分布;c-zeta-电位;d-紫外-可见光谱;e-荧光光谱;f-FTIR光谱
图1 不同pH下超声前后MC的粒径、粒径分布、zeta-电位、紫外-可见光谱、荧光光谱、FTIR光谱
Fig.1 Particle size, size distribution, zeta-potential, UV-vis spectra, fluorescence spectra, and FTIR spectra of MC before and after ultrasonication at different pH
注:不同小写字母表示组间存在显著差异(P<0.05)。
由于pH值为8.0时MC的解离程度较低,因此粒径变化不显著。随着pH继续升高,MC出现部分解离,解离的单体游离于溶液中,其大分子特性致使测定的粒径较大,因此MC的粒径随pH值的增大而增大。当pH值为10.0时,MC大量解离,剩余胶束结构较小,粒径出现降低现象。超声处理的MC粒径变化趋势与未超声样品呈现相反趋势,表现为粒径和PDI显著降低(P<0.05),这是因为超声产生的空化作用削弱了MC的聚集。另一方面,pH值为9.0、10.0时,MC开始解离,超声波产生的机械搅拌等物理作用促进了MC的解离,其解离的单体在超声作用下结构可能发生改变,分子内或分子间形成相互作用,从而形成较小的聚集体,因此粒径呈现出先减小后增大的趋势[26]。
如图1-c所示,MC的zeta-电位绝对值随着pH值的增大表现为逐渐增加的趋势,这是因为碱性pH下MC的电荷增加。超声后MC的zeta-电位绝对值相较于超声前减小,可能是因为超声削弱了蛋白质聚集,使得原本被掩埋的正电基团暴露。另一方面,超声促使蛋白质表面极性区域部分被掩蔽,表面有效电荷减少[27]。
2.1.2 紫外-可见、荧光和红外光谱
不同pH下超声处理前后MC的紫外-可见光谱如图1-d所示。在280 nm处,MC的吸收峰强度随着pH值的增大逐渐降低;同一pH下,超声处理后MC的吸收峰强度显著降低,且最大波长红移。碱性pH诱导MC解离,负电荷的增加增大了胶束内部分子间的静电斥力,使其发色团微环境向亲水性转移。同时,超声处理进一步削弱了MC的聚集,诱导了MC的解离,导致酪氨酸和色氨酸微环境向亲水性转变[28]。因此,超声结合pH处理显著降低了MC的紫外吸收强度。
不同pH下超声前后MC的荧光光谱如图1-e所示。在pH值为7.0～8.0时,超声前后MC的荧光强度较为接近,这是因为该条件下MC未发生明显解离,其氨基酸残基微环境保持相对稳定,因此荧光强度未出现显著变化。但pH值在9.0～10.0增大时,MC最大荧光强度明显降低,这是由于碱性环境导致MC部分解离,磷酸丝氨酸残基去质子化,静电斥力增强,亲水性增加,从而使其荧光强度减小[29]。但超声后MC的荧光强度高于未超声样品,可见超声改变了解离的酪蛋白单体结构,形成分子间或分子内相互作用,与粒径及粒度分布变化趋势一致。
图1-f为不同pH下超声前后MC的FTIR光谱图。所有MC的FTIR光谱均呈现5个特征吸收区域:位于3 200～3 600 cm-1处分子间氢键的N—H伸缩振动(酰胺A)、位于2 800～3 100 cm-1处蛋白质侧链中C—H的伸缩振动(酰胺B)、位于1 600～1 700 cm-1处C
O和C—N伸缩振动(酰胺Ⅰ)、位于1 500～1 600 cm-1处N—H弯曲及C—N与C—C伸缩振动(酰胺Ⅱ)、位于1 100～1 300 cm-1处C—N和N—H伸缩振动(酰胺Ⅲ)[30]。pH结合超声处理后,MC酰胺A和B区域的峰值无明显变化,说明弱碱性pH结合超声处理不产生化学作用,仅为物理改性。随着pH值的增大,未超声MC的酰胺Ⅰ带的吸收峰透过率略有降低,这与MC的解离和蛋白之间偶极相互作用的削弱有关。超声后MC在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带的吸收峰强度随着pH值的增加而增大,这是由于空化作用和pH诱导致使MC解聚及解离程度增加,使更多肽键暴露。
综上所述,pH结合超声处理对MC的解离作用强于单一pH处理,其可诱导MC大幅度解离,粒径显著降低,亲水性增强。
2.1.3 MC的形貌
pH结合超声处理下MC的SEM图像如图2所示。由图2可以看出,喷干MC的微观形貌为球形或近似球形的颗粒,表面皱缩,呈葡萄干状。不同pH下,喷干MC的形貌相似,而超声处理未显著改变MC形貌。pH结合超声处理虽然改变了MC的解离程度和粒径,但喷干过程中其大分子特性致使其扩散较慢,形成皱缩结构。就喷干颗粒的粒径而言,pH值为7.0时粒子尺寸较为均匀;随着pH值升高,粒子均匀性降低,表现为大尺寸颗粒占比增加。这是因为解离的酪蛋白单体逐渐增加,其在喷干过程中扩散速度大于MC,因此形成了较大颗粒。超声处理后,MC大颗粒减少。由此可见,超声处理改变了酪蛋白单体间相互作用,削弱了酪蛋白的聚集,减少了大颗粒的形成,促使喷干样品粒度分布变均匀。
图2 不同pH下超声前后MC的SEM图
Fig.2 SEM images of MC before and after ultrasonication at different pH
注:放大倍数为5 000倍。
2.1.4 MC解离程度的SDS-PAGE分析
pH结合超声处理后MC超高速离心上清液的电泳结果如图3所示。未超声样品在pH 7.0和pH 8.0时上清液中酪蛋白单体解离程度相似,与粒径分析结果一致。当pH值进一步增大后,上清液中酪蛋白单体条带颜色变深,在pH 10.0时条带颜色最深,说明此时MC解离程度最大。超声处理后,在pH值为8.0～10.0的上清液中酪蛋白单体条带颜色比未处理样品略深,说明超声促进了MC的解离。当pH值为10.0时,超声处理后MC的解离程度最大。SDS-PAGE分析结果进一步证实了pH结合超声处理促进了MC的解离。
图3 不同pH下超声前后MC的SDS-PAGE 条带
Fig.3 SDS-PAGE bands of MC before and after ultrasonication at different pH
2.2 pH结合超声处理对MC理化性质的影响
2.2.1 溶解性
不同pH下超声前后MC的溶解性变化如图4所示。中性条件下,喷干MC的溶解度为(75.87±2.50)%。随着pH值的增大,MC的溶解度逐渐增大,在pH 10.0时约为90%。这是因为碱性条件下蛋白质所带负电荷增加,离子强度增加,导致溶解度增加;该溶解特性变化规律与甜瓜籽蛋白的pH依赖性溶解行为呈现相同趋势[15]。超声处理后,在所有pH下MC的溶解度大于未超声样品。其中,pH 7.0时超声处理对MC溶解度的提升幅度最大[(从(75.87±2.50)%提高到(91.83±1.53)%]。在pH值为10.0时,超声样品的溶解度达到(95.43±1.10)%。超声通过空化效应产生的机械力作用破坏了天然聚集态蛋白分子间的次级键(氢键和疏水相互作用),导致MC粒径显著减小,增强了蛋白质与水的相互作用;另一方面,超声处理增加了喷干MC粒子的均匀度,因此溶解度增加。
图4 不同pH下超声前后MC的溶解性
Fig.4 Solubility of MC before and after ultrasonication at different pH
注:不同小写字母表示超声样品间存在显著差异,不同大写字母表示未超声样品间存在显著差异(P<0.05)。
2.2.2 热稳定性
pH结合超声处理对MC热稳定性能的影响如图5所示。如图5-a所示,在温度为300～350 ℃,MC出现明显的吸热峰,归因于蛋白质构象发生转变以及蛋白肽链在热作用下的降解[31]。随着体系pH值的升高,差示扫描量热曲线中的吸热峰呈现明显的向低温方向迁移的趋势;在pH 10.0时吸热峰变宽甚至消失,说明高pH破坏了MC有序结构,使其解离,从而失去明确的相变温度,热稳定性降低。
a-差示扫描量热曲线;b-热重曲线;c-微分热重曲线
图5 不同pH下超声前后MC的差示扫描量热曲线、热重曲线、微分热重曲线
Fig.5 Differential scanning calorimetry curves, thermogravimetric curves, and differential thermogravimetric curves of MC before and after ultrasonication at different pH
图5-b展示了MC在温度为50～600 ℃的质量损失情况;失重初始阶段观察到约5%的质量损失,来源于150 ℃以下的水分蒸发;在160～400 ℃约65%的急剧重量下降与蛋白质的热降解有关;当温度升至400 ℃以上时,蛋白质发生碳化反应,导致约15%的质量损失。图5-c显示了MC在微分热重曲线中最大失重速率对应的温度。可以看出,随着pH值从7.0增大到9.0,未超声MC的分解温度逐渐降低,是因为pH值的增大导致胶束部分解离,使其热稳定性降低。超声后的MC表现出更高的分解温度,说明超声处理能够改善MC的热性能,使其更耐高温,可能是因为超声波促使解离的酪蛋白单体间产生新的相互作用,从而提高了MC的热稳定性。KHATKAR等[32]发现超声处理后,乳清蛋白热变性温度增加,热稳定性增强,与本研究结果一致。
2.2.3 流变性
采用流变仪研究了不同pH下超声处理前后MC溶液的流变特性如图6所示。在低应变范围,所有样品的G′>G″,表明MC溶液以弹性主导,结构未发生破坏。在高应变区(>20%),G″逐渐超过G′,体系转变为黏性主导,胶束网络结构彻底破坏,蛋白质分子之间的相互作用不足以重新调整其结构以抵抗动态模式施加的机械应力。TANG等[33]研究发现,豌豆蛋白溶液随着振荡角频率的增加从弹性(G′>G″)变为黏性(G′<G″)行为,与本研究结果类似。MC的G′随着pH的增大逐渐减小,表明MC网络结构的弹性逐渐减弱,这是因为胶束表面负电荷增强,静电排斥力增大,削弱了维持胶束结构的疏水相互作用和钙桥,导致胶束网络从致密变得松散,且逐渐解离,其弹性模量降低。
图6 不同pH下超声前后MC的应变扫描曲线
Fig.6 Strain sweep curves of MC before and after ultrasonication at different pH
不同pH下,超声后的MC弹性模量均高于未超声处理组,归因于超声的空化作用促进了MC解离,酪蛋白单体结构展开,单体间形成了新的相互作用,促使网络结构的强度增大,从而有助于黏弹性结构的形成。
2.3 pH结合超声处理对MC功能性质的影响
2.3.1 乳化性
不同pH下MC的乳化性能如图7-a所示。未超声处理的样品乳化活性指数随pH升高呈现显著递增趋势(P<0.05)。据报道,经过碱处理的菜籽分离蛋白的乳化活性指数高于酸性和中性条件下的样品,是由于碱性条件下蛋白质负电荷增加,蛋白分子之间的静电斥力增大,使其能够更好的吸附于油滴表面且较好的分散在乳液中[34]。由于超声处理增大了MC的溶解性,促使其结构部分展开,从而提高其在油-水界面的吸附,因此超声后MC的乳化活性在pH 8.0～9.0时均较高,且高于未超声样品。当pH值为10.0时,超声处理未改善MC的乳化性,这是因为该pH下MC解离程度较大,因其表面负电荷较高使得结构较为伸展,反而阻碍了其在油水界面的吸附。
a-乳化性;b-发泡性
图7 不同pH下超声前后MC的乳化性和发泡性
Fig.7 Emulsification and foamability of MC before and after ultrasonication at different pH
注:不同大写字母表示不同样品间乳化性或发泡性存在显著差异,不同小写字母表示不同样品间乳化稳定性或泡沫稳定性存在显著差异,P<0.05。
2.3.2 发泡性
pH结合超声处理后MC的发泡性和泡沫稳定性如图7-b所示。pH 9.0时MC的发泡性最好,且超声处理显著改善了MC的发泡性(P<0.05)。当pH值为10.0时,MC的发泡性最差。泡沫稳定性与发泡性呈现相同的变化趋势。蛋白质的发泡性与其结构伸展程度及亲水-疏水平衡有关。pH 9.0时,超声处理显著减小了MC的粒径,促进了其解离,使其溶解性增大,结构伸展,易于吸附在水-气表面,因此发泡性显著增大;与超声处理后萝卜籽蛋白的发泡性变化趋势一致[34]。pH值为9.0时,MC溶解性的增大使其在泡沫表面形成了较厚的吸附层,因此超声处理后MC的泡沫稳定性增大。当pH值为10.0时,MC解离程度较大,且表面负电荷较多,酪蛋白单体间斥力较大,结构伸展程度较大,反而不利于其在水-气界面吸附,且吸附的蛋白质易于与邻近的蛋白质发生相互作用而聚集,因此发泡性和泡沫稳定性均降低[35]。
2.4 MC的模拟胃肠消化性
2.4.1 MC模拟胃肠消化产物的SDS-PAGE分析
不同pH下超声处理前后MC模拟胃肠消化产物的SDS-PAGE结果如图8所示。在模拟胃液消化阶段,随着pH值的增大,超声与未超声MC消化液中酪蛋白单体条带颜色均变深,这是因为pH的增加促使MC解离,改善了MC的溶解性,因此体系中游离酪蛋白单体含量增加。观察到酪蛋白单体条带颜色随着消化时间的增加而变浅,表明酪蛋白部分被消化。
a-pH 7;b-U-pH 7;c-pH 8;d-U-pH 8;e-pH 9;f-U-pH 9;g-pH 10;h-U-pH 10
图8 不同pH下超声前后MC消化产物的SDS-PAGE图
Fig.8 SDS-PAGE images of digested products for MC before and after ultrasonication at different pH
注:G0、G60、G120、G180分别代表模拟胃消化0、60、120、180 min;I0、I0.5、I1、I2、I3、I4分别代表模拟肠消化0、0.5、1、2、3、4 h(下同)。
模拟肠液消化阶段,pH值为7.0、8.0、9.0的样品中酪蛋白单体条带颜色较浅,而小分子质量条带颜色较深,说明消化较为彻底,产生分子质量较小的片段。当pH值为10.0时,酪蛋白单体条带较为清晰,说明该条件下酪蛋白消化性较差。样品pH高于胰蛋白酶的最适pH是导致其活性降低的原因,而这直接造成了酪蛋白消化性的变差。与未超声样品相比,超声处理后,同一pH下样品消化产物的条带颜色较深,说明酪蛋白被消化为更多的小分子质量多肽,这是因为超声后MC解离程度增大,酪蛋白单体变多,因此其消化产物的量增加。综上所述,弱碱性pH结合超声处理通过改善MC的溶解性,同时促使其解离,从而改善了MC的消化性。
2.4.2 消化产物中的可溶性氮含量
为了进一步说明pH结合超声处理对MC消化性的影响,通过TCA沉淀法测定了消化产物中的可溶性氮含量,结果如图9所示。经TCA沉淀后,消化产物上清液的吸光度随着消化时间的延长而增加,表明消化过程中MC逐渐被消化为较小的肽和氨基酸,释放出更多可溶性含氮组分。当pH值在7.0～9.0增大时,模拟胃肠消化阶段MC消化液中可溶性氮含量增加,且超声处理提高了样品中的可溶氮含量,这与SDS-PAGE分析得出的结论相符。当pH值为10.0时,MC消化液的可溶性氮含量减少,证实了该pH下MC的消化性减弱。综上所述,弱碱性pH(8.0、9.0)结合超声处理改善了MC的消化性。弱碱性pH促使MC解离,游离酪蛋白单体含量增加,蛋白分子展开,暴露更多反应位点,有利于酶的消化。超声产生的空化效应促进了MC的解离,其高级结构(如氢键)被破坏,使原本包埋于分子内部的酶切位点暴露于溶剂环境,进而提高蛋白酶的酶解效率[36]。
a-模拟胃消化;b-模拟肠消化
图9 不同pH下超声前后MC的模拟胃肠消化液中可溶性氮含量
Fig.9 Soluble nitrogen content of simulated gastrointestinal digested product for MC before and after ultrasonication at different pH
2.4.3 MC模拟肠液消化产物的降糖活性
图10为MC模拟胃肠液消化产物的降糖活性分析结果。阿卡波糖(本研究中的阳性对照)对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为(78.6±4.99)%和(64.63±2.91)%。如图10所示,相比于模拟胃消化,模拟肠消化产物更能抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶。此外,超声前后消化产物抑制酶活的能力随消化时间延长而提高,且超声处理组的抑制效果更好。
a-不同pH下超声前后MC在模拟胃消化阶段的产物对α-淀粉酶的抑制率;b-不同pH下超声前后MC在模拟肠消化阶段的产物
对α-淀粉酶的抑制率;c-不同pH下超声前后MC在模拟胃消化阶段的产物对α-葡萄糖苷酶的抑制率;d-不同pH下超声前后MC在模拟肠消化阶段的产物对α-葡萄糖苷酶的抑制率
图10 不同pH下超声前后MC模拟胃肠消化产物的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率
Fig.10 Inhibition rates of α -amylase and α -glucosidase for simulated gastrointestinal digested MC before and after ultrasonication at different pH
注:不同小写字母表示不同消化时间下同一样品间存在显著差异(P<0.05)。
就模拟肠液消化产物而言,超声处理增大了MC消化产物的α-淀粉酶抑制率,其在消化2～3 h时达到最大值。就不同pH而言,超声处理后MC在pH 7.0时消化4 h的产物对α-淀粉酶的抑制率最大[(53.31±2.58)%],而未超声样品在pH 8.0时消化3 h的样品抑制率最大[(51.78±1.86)%]。可见,超声促使MC解离,改善了其消化性,而未超声样品经pH 8.0的解离诱导和较长时间消化才能达到与其相似的活性。MC消化产物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性与其对α-淀粉酶抑制活性变化趋势类似。总体而言,pH 8.0时超声处理后MC在模拟肠液消化2 h产物的α-葡萄糖苷酶的抑制率较高,为(71.79±2.48)%。综上所述,超声处理提升了MC的溶解性,改善了MC的消化性,其产物中活性肽段含量增加,因此表现出较高的降糖活性。
3 结论
采用pH结合超声法对MC进行结构调控,进而改善其性能,发现碱化结合超声处理诱导MC解离,显著降低了其粒径(P<0.05),从而提升了其溶解性。pH 9.0结合超声处理下MC的发泡性和泡沫稳定性最大,而pH 8.0结合超声处理后MC的乳化性最强,但乳化稳定性变化不大。另外,超声处理改善了MC的热稳定性,提高了其弹性模量。
超声处理改善了MC的消化性,进而改善了消化产物的降糖活性。在pH 7.0时,超声处理的MC经模拟肠液消化4 h的产物对α-淀粉酶的抑制率最大,在pH 8.0时模拟肠液消化2 h的产物对α-葡萄糖苷酶的抑制率最大。综上所述,pH结合超声处理可有效改善MC的功能特性;针对不同的功能性质,需要选择适宜的改性工艺。pH 8.0结合超声改性后,MC模拟肠消化2 h的产物具有一定的降糖活性,具备开发降糖肽类产品的潜力。研究结果可为MC结构及性能的高效调控提供理论基础,为降糖肽类产品开发提供参考依据。
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