乳清分离蛋白纳米纤维-黄原胶稳定的高内相乳液制备和表征

梁清棋1,饶哲楠1,刘燕1,袁夏娟1,雷小娟1,2,3,赵吉春1,2,3,李洪海1,2,3,明建1,2,3*

1(西南大学 食品科学学院,重庆,400715)

2(西南大学,果蔬物流保鲜与营养品质调控研究中心,重庆,400715)

3(川渝共建特色食品重庆市重点实验室,重庆,400715)

摘 要 高内相乳液(high internal phase emulsions,HIPE)因其类凝胶质地和良好的结构稳定性,在食品体系的质构调控和功能化设计中受到广泛关注。然而,由乳清蛋白纳米纤维(whey protein nanofibrils,WPN)单独稳定的HIPE在等电点附近易发生聚集,限制其稳定性和应用范围。该研究引入黄原胶(xanthan gum,XG)作为共稳定剂,构建含油量为74%(体积分数)的WPN-XG复合高内相乳液体系,系统考察其结构特性、微观形貌、流变行为及环境稳定性。结果表明,WPN与XG之间通过静电作用形成复合结构,改善蛋白质构象并增强界面稳定性。复合体系粒径最低降至0.32 μm,zeta电位绝对值随XG添加而升高,荧光强度增强,表明蛋白构象更开放。WPN-XG乳液呈现典型的类固体特性(G′>G″),具备良好的剪切恢复性能,并在加热、离心、碱性及4 ℃冷藏条件下保持稳定。综合评价显示,WPN与XG体积比为1∶2与1∶1时在结构构建与环境适应性方面表现最佳。该研究为开发天然、高稳定性乳化体系提供理论依据与新策略。

关键词 高内相乳液;乳清蛋白纳米纤维;黄原胶;流变学特性

高内相乳液(high internal phase emulsion,HIPE)是指内相体积分数超过74%的高浓度乳液[1],因其液滴紧密堆积形成的半固态结构,在食品、化妆品及生物医药领域具有广泛应用前景。与传统乳液相比,HIPE具有更强的载体能力、缓释性能和组织模拟能力[2]。在食品领域,HIPE常作为低脂替代物,如低脂蛋黄酱、调味酱及功能性载体系统等[3]。这类乳液在低剪切下呈弹性固体行为,在高剪切应力下转变为黏性流体,表现出显著的剪切稀化特性,其结构与流变特性在应用中具有关键作用。

当前,食品级HIPE常由蛋白质或多糖稳定形成。乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)是一种来源广泛、营养价值高的食品蛋白,具有良好的界面活性和凝胶特性。经酸性条件下热处理后,WPI可组装成乳清蛋白纳米纤维(whey protein nanofibrils,WPN)[4],其线性纤维结构赋予体系高黏度与三维网络构建能力,显著提高乳液的稳定性[5]。此外,WPN在油水界面可形成厚保护层,抑制油滴聚集与合并[6]。然而,单独WPN稳定的HIPE在其等电点(pH≈5)附近易发生聚集沉淀,限制其在实际食品体系中的适用性[7]

针对上述问题,多糖作为天然亲水胶体,被广泛引入以与蛋白复配共同稳定乳液体系。其中,黄原胶(xanthan gum,XG)是一种来源稳定、黏度高、流变性能可调的阴离子多糖[8]。其在连续相中能显著提升体系黏度,抑制液滴运动;同时,XG可与蛋白质通过静电相互作用形成复合结构,进一步改善界面稳定性与乳液结构强度[9]。已有研究报道XG与乳清蛋白[10]、卵黏蛋白[11]、大豆蛋白[12]等构建复合体系后,在酸性条件下对乳液稳定性具有明显提升。但目前针对WPN与XG复合体系在高内相乳液中的结构调控机制及流变响应等方面研究仍较少,特别是在大振幅振荡剪切等非线性流变学层面的性能分析更为缺乏。

基于此,该研究采用酸热法制备WPN,并引入XG作为共稳定剂,构建含油量为74%的WPN-XG高内相乳液体系。系统考察其复合机制(粒径、电位、荧光光谱、红外光谱、表面疏水性)、乳液微观结构(光学显微镜、激光共聚焦显微镜)、流变特性(剪切稀化、振幅与频率扫描、大振幅振荡剪切、三段触变测试)、以及多环境稳定性(热、离心、pH、盐离子与4 ℃冷藏),旨在为构建多糖-蛋白复合型食品高内相乳液体系提供理论支持与实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

WPI,上海颖心实验室设备有限公司;XG,上海麦克林生化科技有限公司;大豆油,重庆北碚永辉超市。其他化学试剂为分析纯,实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

XHF-DY高速分散器,宁波新芝生物科技股份有限公司;Spectrum Two傅里叶变换红外光谱仪,铂金埃尔默股份有限公司;MCR302模块化旋转与界面流变仪,奥地利安东帕(中国)有限公司;LSM800激光共聚焦显微镜,卡尔蔡司股份公司;HT7800透射电子显微镜,日本东芝公司。

1.3 实验方法

1.3.1 WPN-XG的制备

参考XIA等[13]的方法,WPI溶于去离子水(质量浓度20 g/L),800 r/min室温搅拌2 h。用1 mol/L HCl溶液调pH值至2后于85 ℃加热5 h制备WPN。随后冷却至室温后于4 ℃贮存备用。XG溶液按MATSUYAMA等[10]的方法配制,质量浓度2 g/L,在80 ℃水浴中分散10 min后搅拌冷却至25 ℃。

制备WPN-XG复合溶液时,先将WPN的pH值调至7.0,按1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1(体积比,下同)分别加入XG溶液,2 000 r/min室温搅拌3 h使其复合。

图1 复合溶液的制备流程

Fig.1 The preparation process of the complex solution

1.3.2 粒径和zeta电位

将WPN、XG及其复合液稀释10倍后,测定粒径和zeta电位,测试温度25 ℃,每组样品平行测定3次。

1.3.3 透射电镜

将样品稀释20倍后滴加于200目铜网,自然干燥过夜后,利用透射电镜观察WPN及WPN-XG(1∶1)的微观结构。

1.3.4 荧光光谱

复合溶液适当稀释后,在激发波长280 nm、扫描范围290~430 nm、扫描速率240 nm/min条件下测定荧光发射谱。

1.3.5 红外光谱

WPN、XG及其复合物冷冻干燥后,测定范围600~4 000 cm-1的光谱,扫描次数32次,分辨率4 cm-1

1.3.6 表面疏水性

使用荧光探针8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonicacid,ANS)确定。以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释样品,4 mL稀释液加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液,避光放置15 min后测定激发波长350 nm、发射波长470 nm,缝宽度5 nm下的荧光强度,荧光强度与蛋白质浓度的斜率即为表面疏水性。

1.4 WPN-XG稳定的HIPE的研究

1.4.1 HIPE的制备

将WPN-XG复合溶液与大豆油(74%,体积分数)混合,高剪切混合器(10 000 r/min,1 min)制备HIPE,于4 ℃贮存备用。

1.4.2 光学显微镜

取2 μL乳液样品制成玻片,光学显微镜(20×)观察液滴形态与分布,每组重复3次。

1.4.3 粒度测定

激光粒度仪(折射率设定为1.59,分散介质1.33)测定乳液液滴粒径,以d[4,3]表示平均直径。

1.4.4 激光共聚焦显微镜

分别用尼罗红(质量浓度1 g/L)(油相)、尼罗蓝(质量浓度2.5 g/L)(WPN)与荧光增白剂(质量浓度1 g/L)(XG)染色后制样,激发波长分别为636、660和405 nm,在激光共聚焦显微镜下观察界面结构,重复3次。

1.4.5 流变学性质测试

使用旋转流变仪(直径25 mm,间隙0.5 mm)测定,参数如下:a)表观黏度:0.1~100 s-1;b)振幅扫描:0.1%~100%应变,恒定频率1 Hz;c)频率扫描:角频率0.1~100 rad/s,应变0.1%;d)温度扫描5~80 ℃加热,80~5 ℃冷却,速率5 ℃/min;e)大振幅振荡剪切:固定频率1 Hz,应变0.01%~1 000%测试。通过收集0.099 8%、0.998%、15.8%、99.7%、397%和997%的振荡信号原始数据来获得Lissajous曲线;f)三段触变测试:固定频率1 Hz,剪切速率0.1 s-1(120 s),10 s-1(60 s),0.01 s-1(180 s)。

1.4.6 稳定性测试

1.4.6.1 热稳定性

将乳液在75 ℃下加热30 min,然后在冰浴中冷却至25 ℃,并评估乳液的视觉外观、微观结构和液滴尺寸。

1.4.6.2 离心稳定性

以8 000 r/min离心10 min进行离心稳定性测试。将所有样品垂直放置至少30 min后,观察其视觉外观、微观结构及液滴尺寸。

1.4.6.3 pH稳定性

分别以pH 4的酸溶液、pH 10的碱溶液处理乳液,按体积比1∶1混合,室温静置24 h后检测。

1.4.6.4 盐离子稳定性

0.1 mol/L NaCl溶液与乳液按体积比1∶1混合,室温静置24 h观察析相及粒径。

1.4.6.5 贮存稳定性

乳液分别在4 ℃与室温贮存30 d,每周观察外观与粒径变化。

1.5 数据分析

每次试验设置3个平行,采用Origin 2024和GraghPad Prism 9.1.0作图,用SPSS 18.0软件分析数据。数据以“平均值±标准差”表示。试验结果之间的统计学差异被认为在P<0.05时具有显著性。

2 结果与分析

2.1 WPN-XG复合溶液的特性

2.1.1 纳米粒径和zeta电位

粒径和zeta电位是研究生物聚合物间静电相互作用的常用表征参数。如图2-a所示,XG的粒径可达3 500 nm,表明其在溶液中呈高度缠绕和聚集状态。在WPN与XG复配后,体系粒径随XG比例变化呈现出明显差异:当WPN∶XG=1∶2时,受XG大分子尺寸影响,复合体系粒径大于WPN本身;而在其他配比条件下,WPN-XG体系粒径均小于纯WPN。这一现象说明,在适宜配比下,XG与WPN的复合可有效抑制WPN聚集,形成尺寸更小、结构更均一的颗粒。zeta电位结果(图2-b)进一步验证了上述规律。随着XG比例的升高,WPN-XG复合体系的zeta电位绝对值逐渐增大,表明复合体系表面电荷密度增加,静电排斥增强,有助于提升胶体稳定性。该趋势与已有文献中关于蛋白-多糖复合体系的研究结果相一致[14],表明XG在复合过程中发挥了重要的静电屏蔽和空间稳定作用。

a-粒径;b-zeta电位

图2 WPN-XG复合溶液的粒径和zeta电位

Fig.2 Particle size and zeta potentialof WPN-XG complex solution

注:不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)(下同)。

综上所述,XG与WPN的复合可显著调节体系的粒径与电位特性,尤其在非过量XG条件下有助于形成尺寸小、分散性好、稳定性高的纳米颗粒体系。

2.1.2 透射电镜结构表征

在酸性条件下经85 ℃热处理5 h获得的WPN呈细长纤维状结构(图3-a),具有纳米级直径和微米级长度,形貌与LIU等[5]制备的乳清蛋白纳米纤维结构基本一致。WPI主要包含α-乳清蛋白、牛血清白蛋白及β-乳球蛋白等多种球蛋白,其中β-乳球蛋白在pH 2及低离子环境下易形成原纤维结构,部分蛋白水解形成的小肽段也可能掺入原纤维中[15],增强了纤维的结构多样性。如图3-b所示,WPN与XG复合后,观察到WPN纳米纤维围绕在XG聚集体周围,显示出明显的空间缠绕与聚集趋势。这一形貌特征说明两者之间存在一定的相互作用力,可能包括静电作用、氢键结合及范德华力等,有助于稳定复合结构并为后续乳液稳定提供基础。

a-WPN;b-WPN-XG

图3 WPN和WPN-XG的透射电镜图像

Fig.3 Transmission electron microscope images of WPN and WPN-XG

2.1.3 荧光光谱分析

荧光光谱常用于表征蛋白质结构变化,尤其是疏水氨基酸残基的环境变化。WPI含有相对丰富的色氨酸,而色氨酸成为其热变性后主要的内源荧光来源[16]。如图4-a所示,WPN发射光谱在337 nm处呈现明显的色氨酸发射峰,与SUN等[17]的报道一致。引入XG后,荧光强度随其比例变化呈现先降后升的趋势:WPN∶XG为1∶2时,荧光强度低于纯WPN溶液;而其他配比下,复合溶液的荧光强度均高于纯WPN溶液,且强度顺序为2∶1>3∶1>1∶1>4∶1。荧光增强可能源于XG阻止WPN聚集,促进蛋白分子链展开,使原本位于分子内部的色氨酸残基暴露至极性环境中[18]。值得注意的是,复合体系的荧光发射峰波长未出现显著红移或蓝移,表明尽管蛋白构象发生一定程度展开,但整体构象未发生剧烈改变。由此可推断,XG与WPN之间的相互作用有助于维持蛋白结构稳定性,同时调节其构象柔性。

a-荧光光谱图;b-红外光谱图;c-表面疏水性

图4 WPN-XG复合溶液的荧光光谱图、红外光谱图和表面疏水性

Fig.4 Fluorescence spectrum, infrared spectrum, and surface hydrophobicity of WPN-XG composite solution

2.1.4 红外光谱分析

红外光谱可以进一步揭示蛋白质和多糖之间的相互作用[19]。如图4-b所示,由于O—H和N—H拉伸振动,所有样品在3 200~3 600 cm-1均表现出强而宽的吸收带。WPN与XG复合后,该吸收带出现微弱红移(3 271.94~3 279.06 cm-1),提示两者间可能形成氢键[20]。此外,复合体系在1 057.49 cm-1处观察到的峰强度增强可归因于C—O和O—H的拉伸振动[21]。该变化与XG比例升高一致,进一步表明两者在复合过程中发生了化学环境上的改变,证实了WPN与XG间的复合形成机制。

2.1.5 表面疏水性

表面疏水性是衡量蛋白-多糖复合物乳化性能和界面活性的关键指标。研究表明,表面疏水性与乳化能力呈正相关,而复合颗粒的乳化性能显著影响脂质体系的口感特性[22]。图4-c显示,随XG添加比例的增加,复合体系的表面疏水性普遍高于WPN单独体系,且随XG比例增加呈上升趋势,说明XG的加入促使更多疏水残基暴露于分子表面。其中,WPN∶XG配比为1∶2、1∶1的样品表面疏水性分别达到1 722.83和1 469.91,显著高于WPN。这一现象可归因于XG带负电荷的线性结构与WPN正电区段之间的静电作用,使疏水片段更容易暴露于颗粒表面[23]。因此,适度的蛋白-多糖复合有助于提升颗粒在油-水界面间的吸附能力和界面活性,从而为后续构建稳定乳液提供结构基础。

2.2 由WPN-XG稳定的HIPE的表征

2.2.1 不同WPN与XG配比对HIPE形成的影响

HIPE的形成能力是衡量复合稳定剂界面活性的核心指标。以纯WPN(质量浓度20 g/L)为对照,分别将WPN与质量浓度2 g/L的XG按不同体积比(1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1)复配,并与体积分数74%大豆油混合后制备HIPE。如图5-a所示,各乳液均呈现均一的乳白色外观,具有良好的黏稠度,倒置不流动或者轻微流动,表明体系具备良好的结构稳定性。显微镜图像进一步显示,WPN单独形成的HIPE液滴较大且不规则;而引入XG后,液滴尺寸显著减小,分布更均匀,结构更加完整。特别在WPN∶XG=1∶2和1∶1的配比下,液滴结构最为紧密。粒径测试结果(图5-b)与显微观察一致,复合体系平均液滴尺寸小于WPN对照组,且粒径随WPN与XG配比的增加呈先减后增趋势,表明存在最佳复配比例。

a-显微镜图(标尺:100 μm);b-粒径

图5 WPN及WPN-XG稳定的HIPE

Fig.5 Stable HIPE of WPN and WPN-XG

2.2.2 激光共聚焦显微镜分析

为进一步探究WPN与XG在乳液界面的协同作用机制,采用激光共聚焦显微镜技术对各组HIPE进行界面微观结构观察,并通过特异荧光染料对油相、蛋白和多糖分别标记。如图6所示,在所有复合样品中,绿色荧光(WPN)紧密包覆油滴表面,表明蛋白质为主要界面活性组分。蓝色荧光信号(XG)主要分布于连续水相中,部分与WPN共聚于油滴界面,构建复合吸附膜。参考HWANG等[24]对油滴、蛋白质和多糖激光共聚焦显微镜图像的分析方法,可观察到WPN包围在油滴表面,鉴于XG的亲水性特性,其难以直接吸附于油滴表面。而在油滴表面观察到来自荧光增白剂的蓝色荧光信号,表明XG通过与WPN相互作用形成复合物,并共同吸附于油滴界面。特别是1∶1和2∶1比例下的Merged图效果尤为清晰地显示,油滴外层被WPN和XG均匀的覆盖,形成一层连续的界面层,证明XG通过与WPN形成复合结构协同稳定油滴,这与MATSUYAMA等[10]的结果一致。此外,XG在连续相的均匀分散有助于提升体系整体黏度和空间位阻,进一步抑制液滴沉降与聚并。

a-合并效果;b-蛋白质;c-油脂;d-多糖

图6 HIPE的激光共聚焦显微镜图

Fig.6 Confocal laser scanning microscopy images of HIPE

注:标尺:20 μm。

2.2.3 流变测试分析

2.2.3.1 表观黏度

如电子版增强出版附图S1-a(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044058,以下附图同)所示,所有样品在0.1~100 s-1的剪切速率下均呈现剪切稀化特性,表现出典型的非牛顿假塑性流体行为。这种现象主要源于剪切力导致液滴结构的部分解聚和排列重组[25]。引入XG后,HIPE的表观黏度显著提升,且随XG比例增加而增强,说明XG通过提高连续相黏度和液滴间黏弹性网络的强度增强了体系结构稳定性[10, 26]

2.2.3.2 频率扫描

频率扫描用于表征乳液在动态振荡条件下的流变特性。如附图S1-b所示,在0.1~100 rad/s的角频率范围内,所有乳液的储能模量(G′)均大于损耗模量(G″),表明乳液具有弹性凝胶状结构[27]。值得注意的是,部分WPN-XG乳液的G′和G″大于WPN乳液,说明XG的引入提升了WPN乳液的流变性能,可能是通过增强连续相黏度和分子间相互作用促进乳液内部形成更为致密的结构[28]

2.2.3.3 振幅扫描

振幅扫描常被用于测试乳液在特定频率下的流变特性。由附图S1-c可以发现,在低应变振幅下,WPN-XG和WPN稳定的乳液的G′值均高于G″,HIPE表现出高弹性和类固体行为[29]。随着应变振幅的增大,G′和G″模量均呈下降趋势,G′下降速度高于G″,最终两模量曲线交叉,表示乳液结构开始崩解,转向以黏性为主导的流动状态[30]。复合体系的结构崩解点普遍晚于WPN,说明XG引入提高了结构抗破坏能力。且部分WPN-XG乳液的G′高于WPN乳液,与频率扫描的结果吻合。

2.2.3.4 三段触变测试

三段触变测试被广泛用于研究乳液的剪切结构恢复性能[31]。附图S1-d显示在初始0.1 s-1低速剪切下,黏度几乎不发生变化,而当剪切速率突然增加至10 s-1,所有乳液的黏度均出现显著降低。当剪切速率降低至0.01 s-1时,黏度迅速恢复,此时在高速剪切下遭受破坏的乳液结构已经重新建立。所有乳液都具有可恢复的凝胶结构,可以抵抗剪切速率的变化。

2.2.3.5 温度扫描

动态温度扫描用于评估乳液对热变化的敏感性。如附图S1-e和附图S1-f所示,5~80 ℃加热阶段,乳液G′和G″值初始阶段未发生显著变化,在接近60 ℃时升高,表明蛋白发生热变性并与多糖协同增强网络结构。80~5 ℃冷却阶段,WPN乳液和1∶2乳液的G′和G″值持续缓慢上升,相比之下,1∶1、2∶1、3∶1、4∶1乳液的G′和G″值先上升,在趋于平稳之前达到最大值,且高于乳液的初始值,表明乳液具有较好的耐温性[32]。这可能归因于高温蛋白质变性与多糖产生聚集体,从而形成更强的凝胶网络[33]。在温度降到50 ℃左右时,蛋白质变性结束,继续剪切乳液凝胶结构被破坏。在5~80 ℃温度范围内,G′值始终大于G″值,说明乳液维持弹性主导的黏弹性结构。

2.2.3.6 大振幅振荡剪切

大振幅振荡剪切下的Lissajous曲线可直观呈现乳液在非线性黏弹性区间内的应力响应特性,是评估其弹性与黏性行为的重要工具[34]。如附图S2-a所示,随着应变幅度的增加,应力-应变速率(粉环)和应力-应变(绿环)轨迹逐渐放大,形状也发生显著变化,表明体系储能和耗能能力随输入能量增强而显著变化[35]。附图S2-b展示了不同应变下乳液的弹性与黏性Lissajous图形。在低应变区(0.099 8%,0.998%,15.8%),弹性Lissajous形状呈现为带有波纹的非标准椭圆状,表明体系以弹性行为主导,结构仍处于线性或近线性黏弹区。随着应变增加至中高水平(99.7%、397%、997%),Lissajous图形显著偏离椭圆,逐渐向类平行四边形形态过渡,说明体系进入非线性黏弹区,此时黏性耗散主导行为增强,表明乳液网络结构受应力扰动逐渐破坏[32,36]。6种乳液的对比分析表明,在相同应变下,WPN-XG乳液的封闭面积普遍大于WPN乳液,其中1∶2和1∶1乳液呈现的效果尤为显著。这表明WPN-XG乳液的弹性模量相对较低,更易发生显著变形,从而产生更强的非线性响应[36]。此外,黏性Lissajous曲线的面积随应变增大而减小,其面积的减少及耗散能量的降低表明在大振幅振荡剪切区域的剪切变稀特性[37]。在397%的应变下观察到明显的二次环路,997%应变下观察到的环路更多,表明存在塑性网络结构以及可逆结构破坏后的微观结构恢复现象[35]。值得注意的是,WPN-XG乳液的二次环较WPN乳液更为明显,意味着其具有更大的触变恢复时间尺度[26]

2.2.4 HIPE环境稳定性分析

为评估WPN-XG稳定乳液的环境稳定性,本研究对其在热处理、离心、pH变化、盐离子干扰以及贮存条件下的表现进行系统分析。所有粒径结果变化均与图5-b中乳液初始粒径相比。

在热处理(75 ℃,30 min)后,所有样品未见明显析油或分层现象,显示良好的热稳定性。光学显微镜(附图S3-a)显示乳液液滴分布均一、结构完整;粒径分析结果(附图S3-e)进一步表明,除1∶2与1∶1的样品粒径略有减小外,其余样品粒径均保持稳定,与温度扫描所得结论一致,表明热处理未破坏乳液内部结构。

在8 000 r/min离心10 min后,样品底部出现一定程度水析,但未观察到油相泄漏。显微图(附图S3-b)显示液滴整体尺寸较原样减小,结构稳定无明显聚集,粒径测定(附图S3-f)亦证实该趋势,说明乳液在受力扰动下依旧保持较强的结构完整性。

pH处理的乳液外观均出现相分离,pH 4有油相析出,其光学显微镜图(附图S3-c)中液滴尺寸整体增大并伴随有大液滴出现,说明乳液液滴发生一定程度的聚集,导致乳液粒径增大。相比之下,pH 10的光学显微镜图(附图S3-d)液滴尺寸变化较小,结构完整但存在轻度分布不均及少许液滴聚集现象,说明乳液在碱性条件下的稳定性优于酸性条件。pH敏感性方面,乳液在pH 4和pH 10下均表现出不同程度的不稳定性。pH 4处理组出现油相析出,显微镜图(附图S3-c)显示液滴尺寸明显增大并出现少量聚集,粒径亦显著上升(附图S3-g);而pH 10处理组液滴结构基本完整,粒径变化较小,附图S3-d所示结构均匀但略有分布不均。这表明WPN-XG乳液在碱性环境下的稳定性优于酸性环境。

盐离子可能会导致乳液发生聚集和絮凝现象,如附图S4-a所示,经NaCl处理后,各组乳液出现明显分层及油相析出。光学显微镜显示WPN乳液的液滴粒径减小,而WPN-XG乳液则出现轻微聚集,表明WPN在盐离子存在下具有更高的稳定性。适量增加XG比例有助于提升复合体系的抗盐性能,但整体耐盐性仍较弱。

贮存稳定性方面,在4 ℃条件下贮存30 d(附图S4-b),各样品外观保持良好,无析油现象。显微观察发现,WPN及4∶1组乳液液滴尺寸明显增大,聚集加剧;而1∶2与1∶1样品液滴尺寸较小且分布均匀,结构稳定,表明较高XG比例有助于维持乳液结构稳定性。相比之下,室温贮存30 d后(附图S4-c),除WPN和2∶1组外,其余样品出现不同程度析油和流动性增强。显微图显示,WPN乳液液滴分布均匀且结构完整,而WPN-XG样品则普遍存在液滴不均与聚集现象。结合粒径变化(附图S4-f),说明室温条件不利于WPN-XG乳液的结构维持,可能与微生物代谢造成的多糖降解和油脂氧化有关[38]

综上所述,WPN-XG乳液在加热、离心、碱性环境及低温贮存条件下均展现出良好的稳定性,优于WPN乳液本体。然而其在酸性与高盐环境中易发生结构破坏,稳定性较差。在所有组分中,WPN与XG配比为1∶2与1∶1的乳液整体表现最佳,结构紧致、抗干扰能力强,适合用于需高稳定性的乳液系统。

3 结论

本研究结论表明,WPN与XG的协同作用能够显著改善高内相乳液的结构和稳定性。XG的引入通过增强静电排斥和空间位阻作用,有效抑制WPN聚集,使液滴尺寸减小、界面覆盖更致密;同时提升了体系的表面疏水性和连续相黏度,从而赋予乳液类凝胶的黏弹特性和优良的剪切恢复能力。综合流变学性能与环境稳定性表现,WPN∶XG=1∶2和1∶1的配比最为适宜,能够在加热、离心、碱性及4 ℃冷藏条件下保持结构稳定。研究结果显示,蛋白-多糖复合作为天然乳化体系的有效策略,为高内相乳液在食品中的应用提供了可靠依据。

参考文献

[1] ZHU Y Q, ZHU Y B, YANG J C, et al.Stabilization of high internal phase emulsions by combination of polysaccharide and protein:Synergistic efficiency, mechanism, and application[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 310:143544.

[2] GAO H X, MA L, CHENG C, et al.Review of recent advances in the preparation, properties, and applications of high internal phase emulsions[J].Trends in Food Science &Technology, 2021, 112:36-49.

[3] LIU X, GUO J, WAN Z L, et al.Wheat gluten-stabilized high internal phase emulsions as mayonnaise replacers[J].Food Hydrocolloids, 2018, 77:168-175.

[4] SERFERT Y, LAMPRECHT C, TAN C P, et al.Characterisation and use of β-lactoglobulin fibrils for microencapsulation of lipophilic ingredients and oxidative stability thereof[J].Journal of Food Engineering, 2014, 143:53-61.

[5] LIU Q G, CHENG J J, SUN X M, et al.Preparation, characterization, and antioxidant activity of zein nanoparticles stabilized by whey protein nanofibrils[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 167:862-870.

[6] CUI F Z, MCCLEMENTS D J, LIU X B, et al.Development of pH-responsive emulsions stabilized by whey protein fibrils[J].Food Hydrocolloids, 2022, 122:107067.

[7] EVANS M, RATCLIFFE I, WILLIAMS P A.Emulsion stabilisation using polysaccharide-protein complexes[J].Current Opinion in Colloid &Interface Science, 2013, 18(4):272-282.

[8] BHAT I M, WANI S M, AHMAD MIR S, et al.Advances in xanthan gum production, modifications and its applications[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2022, 42:102328.

[9] LONG Z, ZHAO Q Z, LIU T X, et al.Influence of xanthan gum on physical characteristics of sodium caseinate solutions and emulsions[J].Food Hydrocolloids, 2013, 32(1):123-129.

[10] MATSUYAMA S, KAZUHIRO M, NAKAUMA M, et al.Stabilization of whey protein isolate-based emulsions via complexation with xanthan gum under acidic conditions[J].Food Hydrocolloids, 2021, 111:106365.

[11] ZENG B Y, CHEN Z, LOU Y M, et al.Preparation and characterization of ovomucin-xanthan gum stabilized Pickering emulsions:Microstructure, rheology, and stability[J].Food Chemistry, 2025, 489:145004.

[12] LI L L, WANG W J, JI S P, et al.Soy protein isolate-xanthan gum complexes to stabilize Pickering emulsions for quercetin delivery[J].Food Chemistry, 2024, 461:140794.

[13] XIA S S, WANG Q M, RAO Z N, et al.High internal phase Pickering emulsions stabilized by zein/whey protein nanofibril complexes:Preparation and lycopene loading[J].Food Chemistry, 2024, 452:139564.

[14] WANG L C, ZHANG H, LI H Y, et al.Fabrication and digestive characteristics of high internal phase Pickering emulsions stabilized by ovalbumin-pectin complexes for improving the stability and bioaccessibility of curcumin[J].Food Chemistry, 2022, 389:133055.

[15] LOVEDAY S M, SU J H, RAO M A, et al.Whey protein nanofibrils:Kinetic, rheological and morphological effects of group IA and IIA cations[J].International Dairy Journal, 2012, 26(2):133-140.

[16] TENG Y T, FREIRE P, ZAMORA A, et al.Tryptophan front-face fluorescence and functional properties of whey:A preliminary study[J].LWT, 2022, 163:113589.

[17] SUN C C, LIANG B, SHENG H J, et al.Influence of initial protein structures and xanthan gum on the oxidative stability of O/W emulsions stabilized by whey protein[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 120:34-44.

[18] LIU Q, LI Y C, ZHOU Y, et al.Zein-whey protein isolate-carboxymethyl cellulose complex as carrier of apigenin via pH-driven method:Fabrication, characterization, stability, and in vitro release property[J].Food Chemistry, 2022, 387:132926.

[19] YAN Y H, TANG R, LI F, et al.Spectral analysis of the impact of various polysaccharides on the entrapment of curcumin by whey protein isolate[J].Food Chemistry, 2025, 468:142441.

[20] HAN Y J, LI L Y, WEI F M, et al.Dandelion polysaccharides improve the emulsifying properties and antioxidant capacities of emulsions stabilized by whey protein isolate[J].Food Chemistry:X, 2024, 21:101218.

[21] TIRGARIAN B, FARMANI J, FARAHMANDFAR R, et al.Ultra-stable high internal phase emulsions stabilized by protein-anionic polysaccharide Maillard conjugates[J].Food Chemistry, 2022, 393:133427.

[22] LI B R, GU W J, BOUROUIS I, et al.Lubrication behaviors of core-shell structured particles formed by whey proteins and xanthan gum[J].Food Hydrocolloids, 2022, 127:107512.

[23] BENICHOU A, ASERIN A, LUTZ R, et al.Formation and characterization of amphiphilic conjugates of whey protein isolate (WPI)/xanthan to improve surface activity[J].Food Hydrocolloids, 2007, 21(3):379-391.

[24] HWANG W, LEE J, CHOI M J.Optimization and characterization of high internal phase double emulsion (HIPDE) stabilized by with soybean protein isolate, Gallic acid and xanthan gum[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 264:130562.

[25] SRIPRABLOM J, LUANGPITUKSA P, WONGKONGKATEP J, et al.Influence of pH and ionic strength on the physical and rheological properties and stability of whey protein stabilized o/w emulsions containing xanthan gum[J].Journal of Food Engineering, 2019, 242:141-152.

[26] CHEN H, WANG Q M, RAO Z N, et al.The linear/nonlinear rheological behaviors of Pickering emulsion stabilized by Zein and xanthan gum:Effect of interfacial assembly strategies[J].Food Hydrocolloids, 2023, 145:109116.

[27] JIANG L, WANG Q M, RAO Z N, et al.Formulation and characterization of bigels utilizing whey protein and polysaccharides:Potential applications as cream analogues[J].Food Hydrocolloids, 2024, 152:109884.

[28] JIANG W, LEI X J, RAO Z N, et al.Stable Pickering emulsions of cinnamaldehyde were formulated using tannic acid-assisted cellulose nanofibers and applied for mango preservation[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 290:139135.

[29] LI C Y, WANG Q M, ZHANG C, et al.Effect of simultaneous treatment combining ultrasonication and rutin on gliadin in the formation of nanoparticles[J].Journal of Food Science, 2022, 87(1):80-93.

[30] LI C Y, WANG Q M, ZHANG C, et al.Dynamic high-pressure microfluidization enhanced the emulsifying properties of wheat gliadin by rutin[J].Journal of Food Processing and Preservation, 2022, 46(3):e16304.

[31] TAVARES L, ZAPATA NOREA C P, BARROS H L, et al.Rheological and structural trends on encapsulation of bioactive compounds of essential oils:A global systematic review of recent research[J].Food Hydrocolloids, 2022, 129:107628.

[32] WANG Q M, RAO Z N, CHEN Y Y, et al.Characterization of responsive zein-based oleogels with tunable properties fabricated from emulsion-templated approach[J].Food Hydrocolloids, 2022, 133:107972.

[33] LI S N, LI P P, WANG J, et al.Characterization and stability of low-oil emulsion gels with newly shaped droplets stabilized by Camellia saponin and k-carrageenan[J].Food Hydrocolloids, 2024, 149:109585.

[34] DA S FERREIRA G, DA SILVA D J, ROSA D S.Nonlinear viscoelasticity of Melaleuca alternifolia essential oil Pickering emulsion stabilized with cellulose nanofibrils[J].Journal of Molecular Liquids, 2024, 406:125058.

[35] DUVARCI O C, YAZAR G, KOKINI J L.The comparison of LAOS behavior of structured food materials (suspensions, emulsions and elastic networks)[J].Trends in Food Science &Technology, 2017, 60:2-11.

[36] LI Q, XU M Y, XIE J, et al.Large amplitude oscillatory shear (LAOS) for nonlinear rheological behavior of heterogeneous emulsion gels made from natural supramolecular gelators[J].Food Research International, 2021, 140:110076.

[37] FARIAS B V, KHAN S A.Probing gels and emulsions using large-amplitude oscillatory shear and frictional studies with soft substrate skin surrogates[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2021, 201:111595.

[38] TAN H, ZHANG R Y, HAN L Y, et al.Pickering emulsions stabilized by aminated gelatin nanoparticles:Are gelatin nanoparticles acting as genuine Pickering stabilizers or structuring agents?[J].Food Hydrocolloids, 2022, 123:107151.

Preparation and characterization of whey protein nanofibrils-xanthan gum stabilized high internal phase emulsion

LIANG Qingqi1, RAO Zhenan1, LIU Yan1, YUAN Xiajuan1, LEI Xiaojuan1,2,3, ZHAO Jichun1,2,3, LI Honghai1,2,3, MING Jian1,2,3*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

2(Research Center for Fruits and Vegetables Logistics Preservation and Nutritional Quality Control, Southwest University, Chongqing 400715, China)

3(Chongqing Key Laboratory of Speciality Food Co-Built by Sichuan and Chongqing, Chongqing 400715, China)

ABSTRACT High internal phase emulsions (HIPE) attract significant interest for texture modification and functional design in food systems due to their gel-like texture and structural stability.However, HIPE stabilized solely by whey protein nanofibrils (WPN) tend to aggregate near the isoelectric point, limiting their stability and application scope.This study introduced xanthan gum (XG) as a co-stabilizer to construct WPN-XG composite HIPE with 74% (V/V) oil content.It systematically investigated their structural properties, microstructure, rheological behavior, and environmental stability.Results revealed that electrostatic interactions between WPN and XG formed a composite structure.This interaction improved protein conformation and enhanced interfacial stability.The composite system achieved a minimum particle size of 0.32 μm.The absolute zeta potential value increased with XG addition.Enhanced fluorescence intensity indicated a more open protein conformation.The WPN-XG emulsion exhibited typical solid-like characteristics (G′>G″) and good shear recovery performance.It maintained stability under heating, centrifugation, alkaline conditions, and refrigeration.Comprehensive evaluation identified WPN∶XG ratios of 1∶2 and 1∶1 as optimal for structural formation and environmental adaptability.This work provides a theoretical basis and novel strategy for developing natural, highly stable emulsifying systems.

Key words high internal phase emulsion (HIPE); whey protein nanofibrils (WPN); xanthan gum (XG); rheological properties

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044058

引用格式:梁清棋,饶哲楠,刘燕,等.乳清分离蛋白纳米纤维-黄原胶稳定的高内相乳液制备和表征[J].食品与发酵工业,2026,52(10):127-135.LIANG Qingqi,RAO Zhenan,LIU Yan, et al.Preparation and characterization of whey protein nanofibrils-xanthan gum stabilized high internal phase emulsion[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(10):127-135.

第一作者:本科生(明建教授为通信作者,E-mail:mingjian1972@163.com)

基金项目:国家自然科学基金面上项目(32272308);西南大学大学生创新创业训练计划项目(X202510635682)

收稿日期:2025-07-28,改回日期:2025-10-18