随着现代生活方式的改变,环境污染和辐射成为了影响人类健康的重要因素之一。适当紫外线辐射可抑制杀死细菌且对人体生长发育有促进作用[1],但过量辐射则能够引起细胞氧化损伤,导致晒黑、晒伤、光过敏、光老化,甚至导致皮肤癌等一系列疾病的发生[2],生活中,人们一直追求于寻找有效的防晒和抗辐射方法,但市面上大多数防晒抗辐射产品尤其是化学产品,虽具有一定抗辐射能力,过量使用可能会造成皮肤过敏、刺激反应,不利于人体健康[3]。因此,寻找有效的且天然无害的抗辐射物质成为了当今研究的热点之一。黑果腺肋花楸作为重要的功能性浆果,富含花青素、多糖、黄酮等多种活性成分,其中花青素类化合物占比高达总酚含量的25%[4],这类黄酮类衍生物具有清除自由基的抗氧化性能,还能有效地抑制多种酶的生物活性,这些特性与功能赋予了食品健康的功效和安全性能,为功能食品的开发与资源利用提供了充足依据[4]。另外黑果腺肋花楸中多糖提取量为(4.46±0.02)%[5],可见其活性成分具较高利用率,现今研究表明,多糖能够清除自由基[6],具有免疫调节[7]、改善肠道菌群[8]、抗辐射[9]、抗肿瘤[10]等生物活性,还被广泛用于多种疾病的治疗[11]。黑果腺肋花楸不仅具有多种活性物质以及生理功效,还具有极大的开发潜力和价值,因其果肉酸涩不能食,该研究以黑果腺肋花楸为原料,大大的增加了它的资源利用率,开拓出新市场的同时具有充分资源含量供提取与研究,同时,通过对加工副产物的高值化利用,可显著提升黑果腺肋花楸产业链的经济附加值。
花青素作为一种天然植物色素,因其卓越的抗氧化活性和抗辐射特性[12],广泛应用于健康食品和医药领域。黑果腺肋花楸花青素具有较强的抗氧化和抗辐射能力[13],而其与多糖复配后,可能呈现出协同增强的效果[14]。本研究发现复配物在抑制酪氨酸酶活性等方面有良好的效果,能够有效减轻辐射引起的细胞损伤。使用酵母细胞作为实验模型,是本研究的一个创新之处。酵母细胞具有与高等动植物相似的细胞应激反应机制,并且易于操作[15],能够为深入研究花青素与多糖复配物的抗辐射机制提供更加直观的实验数据。这一创新方法不仅丰富了抗辐射研究的内容,也为天然抗辐射物质的开发和应用提供了新的视角。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑果腺肋花楸干果产自中国内蒙古地区。
曲酸(分析纯)、左旋多巴(分析纯),上海源叶生物科技有限公司;酪氨酸酶(分析纯),北京博奥拓达科技有限公司;磷酸盐缓冲液(分析纯),江苏凯基生物技术股份有限公司;亚甲基蓝染色液(分析纯),北京兰杰柯科技有限公司;酿酒酵母(分析纯),安琪酵母股份有限公司;葡萄糖(分析纯),天津市大茂化学试剂厂;YPD液体培养基(分析纯),青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒,南京建成生物工程研究所;活性氧(reactive oxygen species, ROS)试剂盒、过氧化氢酶(catalase, CAT)试剂盒,苏州格锐思生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1FD-II洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;BA210显微镜,麦克奥迪实业集团有限公司;BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;DH63D电热恒温培养箱,天津市泰斯特仪器有限公司;JSM-7500F扫描电镜,JEOL/日本电子。
1.3 实验方法
1.3.1 黑果腺肋花青素(Aronia melanocarpa anthocyanin, AMA)及果渣多糖(Aronia melanocarpa polysaccharide, AMPP)的提取及纯化
1.3.3.1 AMA的提取与纯化
准确称取黑果腺肋花楸冻果(10.00 g),采用95%(体积分数)乙醇按照1∶20(g∶mL)的料液比,并添加10 mL冰醋酸用手持式搅拌机进行5 min的匀浆处理。在超声功率200 W、温度40 ℃条件下提取37 min[16],真空抽滤后收集滤液。大孔树脂纯化获得纯化花青素[17]。花青素含量使用pH示差法[18]进行测定,取1.0 mL待测样品2份,分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲溶液稀释至10 mL定容,避光条件下反应10 min后,使用紫外可见分光光度计分别测定各溶液在510 nm和700 nm处的吸光值。计算黑果腺肋花楸中AMA含量为(169.10±2.22) mg/g。
1.3.3.2 AMPP的提取与纯化
称取10 g黑果腺肋花楸研磨粉,置于200 mL锥形瓶中。按照1∶15(g∶mL)的料液比加入蒸馏水,90 ℃水浴提取4 h。离心后上清液浓缩至1/8体积,80%乙醇沉淀24 h,离心真空干燥制得粗多糖[19]。粗多糖脱色与脱蛋白,经DEAE-52纤维素柱(0.1～0.5 mol/L NaCl梯度洗脱),苯酚-硫酸法监测,收集主峰透析冻干,得精制多糖[20]。使用硫酸苯酚法测定多糖含量,所建立的标准曲线表明,当葡萄糖质量浓度为10～50 μg/mL时,其线性回归方程为y=0.006 4x+0.032 4,相关系数R2为0.999 3,显示出优异的线性相关性。经计算AMP中多糖含量为(42.70±0.51) mg/g。纯化后AMPP中多糖含量为(761.53±29.64) mg/g[21]。
1.3.2 复配物制备及抗辐射能力测定
1.3.2.1 复配物制备与优化
黑果腺肋花楸花青素(AMA)分别与黑果腺肋花楸粗多糖(AMP)及黑果腺肋花楸果渣纯多糖(AMPP)进行复配。采用 pH 3.0 的柠檬酸缓冲溶液将黑果腺肋花楸花青素(AMA)配制成质量浓度为4 mg/mL 的溶液,分别与粗多糖(AMP)、果渣纯多糖(AMPP)按不同质量比混合,得到花青素-粗多糖复配体系 AP(AP1=1∶0.5、AP2=1∶1.0、AP3=1∶1.5、AP4=1∶2.0、AP5=1∶2.5、AP6=1∶3.0)与花青素-纯多糖复配体系 APP(APP1=1∶0.5、APP2=1∶1.0、APP3=1∶1.5、APP4=1∶2.0、APP5=1∶2.5、APP6=1∶3.0)。将混合液置于磁力搅拌器上充分搅拌均匀,转移至4 ℃条件下避光静置12 h,所得复配产物经冷冻干燥处理后,备用。
1.3.2.2 酪氨酸酶抑制能力的测定
使用PBS缓冲液(0.006 7 mol/L,pH 7.2)将待测样品及曲酸对照品配制成系列浓度为0～1 500 mg/g溶液。取3.75 mg酪氨酸酶粉末(500 U/mg)溶于25 mL PBS,配制成75 U/mL的酪氨酸酶溶液。实验时,依次向96孔板中加入40 μL待测样液、40 μL酪氨酸酶溶液及85 μL PBS,37 ℃下孵育15 min,再依次加入40 μL左旋多巴溶液(10 mmol/L),继续放置在37 ℃下反应10 min后,立即测定492 nm处吸光值。设置3组对照:a)以PBS替代酪氨酸酶溶液;b)以PBS替代样品溶液;c)以PBS替代样液和酪氨酸酶溶液[22]。酪氨酸酶抑制率的计算如公式(1)所示:
酪氨酸酶抑制率
(1)
式中:A1,实验组的吸光度;Aa,对照组a的吸光度;Ab,对照组b的吸光度;Ac,对照组c的吸光度。
1.3.2.3 酵母菌悬液的制备
取1%(质量分数)酵母粉末加入已灭菌的50 g/L的葡萄糖溶液中,置于28 ℃摇床中振荡培养(转速200 r/min)活化3 h。
按1%(体积分数)比例将酵母菌液转移到液体培养基中,置于28 ℃摇床振荡培养(转速200 r/min)5 h,将酵母培养至对数期,冷藏保存。
将培养至对数期的酵母菌菌液置于离心管中,然后用离心机4 000 r/min离心5 min,倒掉上清液,收集菌体。用磷酸盐缓冲液(pH=6.9)洗1～2次,并再次加入磷酸缓冲液,即得酵母菌悬液。制备后的酵母悬液采用血球计数板法测定酵母数[23],并调成浓度为104～105 CFU/mL的细胞悬液备用。
1.3.2.4 酵母细胞的抗辐射作用的检测方法
在载玻片上先加1滴酵母悬液,再覆盖1滴复配物溶液或生理盐水(空白对照加蒸馏水),将载玻片在超净台紫外灯下辐照。辐照一定时间后,覆盖1滴0.02%(体积分数)亚甲基蓝溶液,静置5 s,再置显微镜下观察,将被亚甲基蓝染为蓝色的细胞记为死细胞,未变蓝的细胞记为活细胞。计3～4个视野的酵母细胞数,重复3次,取平均数。再计算酵母细胞的存活率,以酵母细胞辐照后的存活率来衡量复配物溶液对酵母的防辐射保护作用,存活率越高说明其防辐射能力越强。实验分4组:覆盖复配物溶液1组(AP)、覆盖复配物溶液2组(APP)、覆盖生理盐水照射组、覆盖水对照组。酵母细胞存活率的计算如公式(2)所示:
酵母细胞存活率
(2)
1.3.2.5 不同照射时间下复配物溶液对酵母防紫外辐射作用
分别取少量2 mg/mL的复配物溶液1及复配物溶液2覆盖在滴有酵母悬液的载玻片上,放入超净台中进行照射。固定辐照距离为45 cm,照射时间分别设定为10、20、30、40、50 min,照射后测定酵母菌存活率。
1.3.2.6 不同照射距离下复配物溶液对酵母防紫外辐射作用
分别取少量2 mg/mL的复配物溶液1及复配物溶液2覆盖在滴有酵母悬液的载玻片上,放入超净台中进行照射。固定辐照时间为30 min,照射距离分别设定为35、40、45、50、55 cm,照射后测定酵母菌存活率。
1.3.2.7 不同复配物浓度对酵母防紫外辐射作用
分别取少量不同质量浓度(2、1.6、1.2、0.8、0.4 mg/mL)的复配物溶液1及复配物溶液2覆盖在滴有酵母悬液的载玻片上,放入超净台中进行照射。固定辐照时间为30 min,照射距离45 cm,照射后测定酵母菌存活率。
1.3.3 复配物对紫外(ultraviolet,UV)辐照的酵母细胞抗氧化损伤性能测试
1.3.3.1 酵母细胞前处理
分别取5 mL酵母悬液与同等体积的2 mg/mL复配物溶液1、复配物溶液2、灭菌水、生理盐水混合,在辐照距离为45 cm的条件下辐照30 min后,240 W下超声15 min,以破坏其细胞结构。随后在10 000 r/min下离心15 min,取上清液备用。
1.3.3.2 复配物对GSH-Px、SOD、CAT、MDA、ROS含量的影响
参见产品试剂盒说明书。
1.4 统计分析
所有实验均设置3个平行重复,数据以“平均值±标准差”表示。使用Excel 2019与Origin 2024软件对数据统计及进行图表绘制,并通过SPSS 25统计软件对数据进行单因素方差分析,设置显著性水平为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 AP和APP对酪氨酸酶抑制活性
UV照射可显著激活酪氨酸酶,促进黑色素合成,抑制该酶活性则能有效减轻光诱导的色素沉着。复配物抑制酪氨酸酶活性,减少黑色素过度积累,在预防晒斑和肤色异常加深方面具有重要应用价值。如图1所示,AP和APP均表现出显著的酪氨酸酶抑制活性,且抑制效果随浓度增加而增强,呈现典型的剂量依赖性效应。酪氨酸酶活性抑制能力的强弱如下:曲酸>AP4>AP6>AP1>AP3>AP5>AMA;曲酸>APP2>APP1>APP4>APP3>AMA>APP5> APP6。这一现象可能与AMA和AP/AMP相互作用有关。
a-AP;b-APP
图1 AP和APP对酪氨酸酶的抑制能力
Fig.1 Inhibitory ability of AP and APP on tyrosinase
2.2 不同照射时间下复配物溶液对酵母细胞防紫外辐射作用
不同辐照时间对酵母细胞的影响如图2所示。
a-辐照时间;b-辐照距离
图2 不同辐照时间和不同辐照距离对酵母细胞防紫外辐射作用
Fig.2 Effect of different irradiation times and different irradiation distances on the protection of yeast cells against ultraviolet radiation
由图2可知,随着照射时间的延长,酵母细胞的存活率不断下降。酵母细胞在不同溶液中的存活率随时间的变化呈现出一定的趋势。在生理盐水中,酵母细胞的存活率随着时间的推移逐渐下降,从10 min的86.89%降至50 min的64.31%,表明在生理盐水中的存活率呈显著的负相关趋势。类似地,在水中的存活率也显示出随时间的延长而呈现逐渐降低的趋势,从10 min的79.58%下降至50 min的49.89%。这种下降可能与水对细胞的渗透压冲击和缺乏必要的营养支持有关。相较之下,在含有AP4溶液的环境中,酵母细胞的存活率表现出较高的维持率,且存活率在不同时间点的变化较为平缓。从10 min的97.25%下降至50 min的89.34%,虽然存活率逐步下降,但整体下降幅度较小,表明AP4溶液可能能够中和自由基,减少氧化损伤,进而延缓酵母细胞的存活率下降的速率,为酵母细胞提供了较为有利的生存环境,有效延缓了细胞死亡的进程。在APP2溶液中的存活率同样呈现出逐渐下降的趋势,从10 min的95.41%降至50 min的80.24%,整体变化趋势与AP4溶液相似,但下降幅度稍大。这可能表明APP2溶液对酵母细胞的保护作用不如AP4溶液显著。实验结果表明,不同溶液对酵母细胞存活的保护作用存在差异。生理盐水和水的存活率呈明显下降趋势,说明这2种溶液未能有效支持酵母细胞在辐照下的存活。相比之下,AP4和APP2溶液的存活率维持较高水平,尤其是AP4溶液对酵母细胞的保护效果更为突出,表现出较低的下降幅度。
2.3 不同照射距离下复配物溶液对酵母细胞防紫外辐射作用
图2表明酵母细胞在不同辐照距离(35、40、45、50、55 cm)下,在各溶液中的存活率随着辐照距离的增大而呈现出逐渐上升的趋势。这一现象表明,随着辐照距离的增加,辐射强度逐渐减弱,从而减少了辐射对细胞的直接损伤,导致细胞存活率的提高。覆盖生理盐水组,酵母细胞的存活率从35 cm的69.31%逐步增加至55 cm的93.47%。这一趋势表明,较短的辐照距离导致了较强的辐射损伤,而随着距离的增加,辐射强度减弱,酵母细胞存活率得以提升。覆盖水组,酵母细胞的存活率同样随辐照距离的增加而增加,从35 cm的60.47%上升至55 cm的90.11%。然而,水相比生理盐水对酵母细胞的保护作用较弱,导致其存活率整体偏低,尤其是在短距离下。水溶液缺乏足够的离子和营养物质,这可能导致细胞在辐射损伤下的恢复能力较差。覆盖AP4溶液组中,酵母细胞的存活率始终保持较高水平,且随着辐照距离的增加,存活率显著提高。从35 cm的91.43%升高至55 cm的98.74%,AP4溶液显著增强了细胞的抗辐射能力。该现象可能归因于AP4溶液中可能含有有助于细胞修复和保护的成分,这些成分能够有效缓解辐射对酵母细胞的损害,减少细胞死亡。覆盖APP2溶液组中,酵母细胞的存活率也随辐照距离的增加而逐渐升高,从35 cm的84.21%增至55 cm的94.01%。虽然APP2溶液的保护作用略逊于AP4溶液,但依然表现出了较强的保护效果。这表明APP2溶液对酵母细胞具有一定的抗辐射保护作用,能够有效延缓辐射引起的细胞损伤。
2.4 不同复配物溶液浓度对酵母细胞防紫外辐射作用的影响
在辐照时间为30 min,照射距离45 cm,观察不同复配物浓度对酵母细胞的影响。不同复配物浓度对酵母细胞的影响如图3所示。
图3 不同复配物浓度对酵母细胞防紫外辐射作用
Fig.3 Effect of different complex concentrations on the protection of yeast cells against ultraviolet radiation
图3表明,酵母细胞在不同浓度AP4溶液中的存活率表现出浓度依赖性。在第1组实验中,酵母细胞的存活率随着AP4浓度的升高而显著增加,分别为80.77%、84.29%、90.75%、91.64%、94.27%。第2组实验的存活率也呈现相似的趋势,分别为75.94%、79.78%、80.24%、89.72%、90.27%。从这些数据可以看出,较高浓度的AP4能够提高酵母细胞在辐射照射下的存活率。该现象表明AP4可能在一定浓度范围内具有抗辐射效应,其作用机制可能包括抗氧化、抗自由基或其他细胞保护机制的激活。随着AP4浓度的增加,酵母细胞可能能更有效地修复辐射引起的损伤,从而提高细胞的存活率。这一现象也可能与AP4的浓度相关的分子作用浓度有关,在低浓度时其保护效应不明显,而在高浓度时其保护效果达到最大。此外,实验中两组数据的差异可能与细胞的生长状态、AP4的溶解度以及实验环境的微小变化等因素有关。
2.5 复配物对UV辐照的酵母细胞抗氧化损伤性能测试
2.5.1 GSH-Px活力的测定
GSH-Px是一种主要的防御机制涉及抗氧化酶,能将活性氧分子转化为低或无害的物质[24]。GSH-Px可以阻止羟自由基的产生,保护细胞成分免受氧化损伤。酶活性的降低与高活性自由基的积累有关,导致细胞膜完整性和功能丧失等有害影响。不同复配物对UV氧化损伤酵母细胞中GSH-Px活力的影响情况如图4所示。
图4 不同复配物对UV氧化损伤酵母细胞GSH-Px活力的影响
Fig.4 Effects of different complexes on SOD activity
注:不同小写字母表示各组之间存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
如图4所示,在对不同样品覆盖后,酵母细胞经辐照处理并测定其GSH-Px活力的实验结果中,蒸馏水组、盐水组、AP4组和APP2组的GSH-Px活力分别为227.10、242.58、423.23、559.78 U/mL。由这些数据可以观察到,随着覆盖物性质的变化,GSH-Px活力呈现逐渐升高的趋势,特别是在AP4和APP2组中,活力显著高于蒸馏水和生理盐水组。由此表明,花青素多糖复配物对酵母细胞的抗氧化能力具有一定的促进作用。GSH-Px活性的升高可能与花青素多糖对酵母细胞的抗氧化防御机制的增强相关。花青素作为一种强效的抗氧化剂,能够通过清除自由基,减轻辐照引起的氧化损伤,进而促进GSH-Px的活性。此作用可能与花青素多糖复合物的结构和化学性质密切相关,其可能通过增强酵母细胞膜的稳定性,改善细胞内抗氧化系统的整体功能。从机制角度来看,花青素和多糖的结合可能有助于提高其在细胞内的生物可利用性,或者通过影响信号通路调节抗氧化酶的表达与活性。例如,花青素已被证实能通过激活Nrf2/Keap1通路增加抗氧化酶的合成,这与GSH-Px活性提升的趋势一致[25]。另外,花青素对细胞膜的保护作用也可能是其提高GSH-Px活性的原因之一,通过减少氧化损伤,进而减少抗氧化酶的耗损,维持其活性。
2.5.2 MDA含量的测定
MDA是酵母细胞脂质过氧化反应的产物,可以间接反映细胞受自由基攻击的损伤程度,是测定酵母在应激下氧化应激的重要指标[26]。图5数据表明,覆盖蒸馏水组的MDA含量为12.24 nmol/L,覆盖生理盐水组为7.69 nmol/L,覆盖AP组为6.07 nmol/L,覆盖APP组为4.64 nmol/L。覆盖复配物组与生理盐水及蒸馏水组相比,酵母细胞中MDA的含量显著下降(P<0.05),从数据趋势来看,随着覆盖物中花青素含量的增加,酵母细胞中MDA的水平逐渐下降,表明复配物可能对辐照引起的氧化损伤具有一定的保护作用。MDA是脂质过氧化反应的产物,常被用作氧化应激的生物标志物。较高的MDA水平即表明细胞遭受了较大的氧化损伤。实验中蒸馏水组表现出最高的MDA含量,可能是由于蒸馏水未能有效缓解辐照引起的氧化压力;生理盐水组的MDA水平有所下降,可能是因为生理盐水能够提供一定的渗透保护作用,但其抗氧化能力有限。而AP组和APP组的MDA含量进一步下降,尤其是APP组,表明此复配物具有较强的抗氧化作用,有助于减缓辐照对细胞的氧化损伤。发生该现象的可能原因包括花青素在抗氧化反应中的关键作用,花青素等能够通过直接与自由基反应或激活抗氧化酶系统来减少氧化应激。此外,花青素在防止脂质过氧化、保护细胞膜完整性方面也发挥着重要作用[27]。这些作用可能解释了在覆盖复配物的组中MDA含量显著下降的现象。
图5 不同复配物对UV氧化损伤酵母细胞MDA含量的影响
Fig.5 Effects of different complexes on MDA content
2.5.3 SOD活力的测定
SOD是酵母中的主要抗氧化酶,能专门清除体内的自由基,SOD活力的变化对酵母细胞中的自由基清除至关重要[28]。辐照对酵母细胞中SOD活力的影响如图6所示。
a-SOD活力;b-CAT含量
图6 不同复配物对UV氧化损伤酵母细胞SOD活力和CAT含量的影响
Fig.6 Effects of different complexes on SOD activity and CAT content in UV oxidatively damaged yeast cells
由图6-a表明,在对覆盖不同样品后的酵母细胞进行辐照处理后,测得的酵母细胞中的SOD(超氧化物歧化酶)活力显示出一定的差异。具体而言,覆盖蒸馏水组的SOD活力为49.63 U/mL,覆盖生理盐水组为55.79 U/mL,而覆盖AP组和覆盖APP组的SOD活力则显著提高(P<0.05),分别为80.72 U/mL和80.55 U/mL。在不同处理条件下,花青素及其多糖的保护作用可能是SOD活力差异的主要原因。首先,花青素及其多糖具有抗氧化和抗辐射的特性。花青素作为一种天然的抗氧化物质,在减少氧化应激和自由基损伤方面起到了显著作用[29]。花青素能够通过清除自由基、减少细胞内氧化损伤,从而激活细胞的抗氧化酶系统(如SOD、CAT等)[30]。因此,AP组和APP组的SOD活力显著高于蒸馏水组和生理盐水组可能是由于其更强的抗氧化活性,有助于减少辐照引起的氧化压力,进而提升了酵母细胞的SOD活力。此外,花青素多糖的结构和分子质量可能影响其生物活性。APP可能具有较高的纯度和更强的生物可利用性,这可能使其在抗氧化过程中发挥了更好的效果,进而提高了SOD的活力。相比之下,蒸馏水和生理盐水作为对照组,其活性较低,可能是由于缺乏有效的抗氧化成分,导致酵母细胞在辐照后的氧化应激响应较弱。
2.5.4 CAT含量的测定
CAT是酵母细胞中重要的抗氧化酶之一,与SOD起共同作用它在清除过氧化氢等有害物质中发挥关键作用[31],能够催化H2O2成为H2O[32]。不同复配物覆盖酵母细胞在辐照后细胞内CAT含量变化如图7所示。由图6-b的数据显示,酵母细胞在不同覆盖物处理后的催化酶(CAT)含量存在明显差异。具体来说,蒸馏水组[1.652 μmol/(min·mL)]和生理盐水组[2.534 μmol/(min·mL)]的CAT含量较低,而AP组[3.871 μmol/(min·mL)]和APP组[4.652 μmol/(min·mL)]的CAT含量则显著较高(P<0.05)。这一趋势表明,花青素多糖类物质可能对酵母细胞的CAT含量有促进作用。造成此现象的原因可能是:花青素多糖复配物具有较强的抗氧化特性,能够清除自由基,减轻氧化应激。辐照可能对酵母细胞造成氧化损伤,而花青素类物质和多糖能够缓解此类损伤,因此在处理后酵母细胞的CAT含量较为明显的提高。APP组和AP组的活力较高可能与多糖分子的免疫调节作用相关。多糖能够激活细胞的免疫系统,增强细胞对外界刺激的应答能力,从而提高酵母细胞的酶活性。而生理盐水和蒸馏水组与复配物组相比,其含量显著较低,可能是因为它们无法为细胞提供抗氧化或免疫调节的额外支持,从而导致酵母细胞的CAT含量相对较低。蒸馏水作为对照组未能提供有效的支持,而生理盐水组虽然在一定程度上能提供适宜的离子环境,但缺乏抗氧化物质,因此其CAT含量也相对较低。
图7 不同复配物对UV氧化损伤酵母细胞ROS水平的影响
Fig.7 Effects of different complexes on the level of ROS in UV oxidatively damaged yeast cells
2.5.5 ROS水平的测定
ROS在体内积累会导致生物体各项机能衰退,从而加速衰老[33]。ROS水平可以通过暴露于氧化应激如电离辐射(X射线、γ射线、β、α或质子)或细胞修复过程中的缺陷而升高[34]。在氧化应激和辐射暴露过程中,会产生过量的自由基,这会损伤包括DNA、细胞膜和酶在内的关键大分子,并导致细胞死亡。辐照对酵母细胞中ROS水平的影响如图7所示。
由图7可知,不同覆盖物处理的酵母细胞在辐照后的ROS水平,采用荧光强度法评估了不同处理组的ROS水平。实验结果显示,覆盖蒸馏水组的ROS荧光强度最高,为47 108.67,紧随其后的是覆盖生理盐水组(47 090.67)。而覆盖AP组和APP组的ROS荧光强度显著低于前两组(P<0.05),分别为41 265.67和40 559.67。从数据趋势来看,随着花青素浓度的增加,ROS荧光强度逐渐降低,表明花青素及其衍生物在减少细胞内ROS水平方面具有一定的作用。蒸馏水组和生理盐水组的ROS荧光强度较高,可能是因为这2种溶液未能有效减轻辐照引起的氧化应激。尤其是蒸馏水组,由于其缺乏抗氧化成分,导致ROS生成较为显著。而覆盖AP组和APP组的ROS荧光强度显著降低,这表明花青素具有较强的抗氧化作用,能够有效抑制辐照引起的ROS积累。这一现象可能与花青素的抗氧化机制相关。花青素可以通过抑制UV辐射导致的细胞内ROS过量产生,保护线粒体膜电位水平,进而抑制UV辐射诱导的细胞凋亡[35],从而减轻辐照对细胞的氧化损伤。
3 结论
本研究通过物理复配黑果腺肋花楸花青素与多糖,成功制备了具有显著抗紫外辐射和抗氧化活性的复合物(AP和APP)。结构表征表明,复配物通过氢键和分子间相互作用形成稳定的无定形颗粒,紫外光谱和红外光谱分析证实了其结构相容性及增色效应。酵母细胞模型实验显示,复配物在最佳条件(辐照时间30 min、距离45 cm、质量浓度2 mg/mL)下显著提高了细胞存活率(P<0.05),并通过增强GSH-Px、SOD活力和CAT含量,降低MDA含量和ROS水平,有效缓解了氧化应激损伤。在不同辐照时间、辐照距离和样品浓度条件下,覆盖APP组的酵母细胞存活率始终高于AP组,而AP组的存活率又高于生理盐水组和蒸馏水组。此外,随着辐照时间、辐照距离和样品浓度的增加,APP组的酵母细胞存活率呈下降趋势,但此趋势与其他组别相比较为平缓。
细胞内有完整的抗氧化防御体系,该系统由酶类和非酶类抗氧化物质共同组成,其中SOD、CAT和GSH-Px等发挥着核心作用。这些防御成分通过协同作用高效清除自由基,阻断脂质过氧化链式反应,减少MDA等有害代谢产物的积累,维持细胞内ROS的动态平衡,这些抗氧化物质的水平变化可以作为评估细胞氧化损伤程度的可靠生物学指标。花青素多糖复配物能显著提高辐照后酵母细胞中GSH-Px、SOD活力和CAT含量,降低MDA含量以及ROS水平,经过覆盖AP及APP后的酵母细胞分别比覆盖蒸馏水的酵母细胞GSH-Px活力增加196.13、311.78 U/mL;MDA含量下降6.17、7.60 nmol/L;SOD活力增加31.09、30.92 U/mL;CAT含量增加2.22、3.00 μmol/(min·mL);ROS水平荧光强度下降5 843、6 549。其中APP的GSH-Px活力、MDA含量、CAT含量以及ROS水平荧光强度均比AP的变化量较大,可能是由于APP具有较高的纯度和更强的生物可利用性,能够更好地被细胞吸收。
本研究解决了天然抗辐射物质稳定性与协同效应的问题,证实了花青素与多糖复配的协同抗氧化机制,为开发高效抗UV辐射的功能性食品或化妆品提供了理论依据。未来研究可进一步探索复配物在人体细胞模型中的效果,优化其生物利用度,并拓展其在医药、农业等领域的应用潜力,例如作为抗辐射膳食补充剂或植物抗逆增强剂。此外,结合分子对接技术深入解析其相互作用机理,将有助于推动天然抗辐射物质的精准设计与产业化应用。
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