鲊广椒是一种具有地域特色的传统发酵辣椒制品,在我国华中和西南地区具有较大的食用群体[1]。鲊广椒主要由新鲜二荆条辣椒(Capsicum annuum L.)和玉米粉(Zea mays L.)经自发厌氧发酵制成[2],色泽鲜红,酸辣可口,既可以直接用油煎炒,也可作为烹饪调料为菜肴增添独特风味[3]。从营养价值角度来看,鲊广椒富含辣椒碱、有机酸及功能性代谢产物,具有促消化、抗氧化、调节肠道菌群平衡等积极作用[4]。随着地域特色食品市场需求增长,鲊广椒工业化生产需求日益凸显。因而,积极探讨使用纯种进行鲊广椒发酵是极为必要的。
消化伴生乳杆菌(Companilactobacillus alimentarius)作为欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)认证的“合格安全推定”(qualified presumption of safety,QPS)安全菌株[5-6],在植物基质发酵中表现出独特的生态适应性。例如,熊世进等[7]研究发现,在老坛酸菜发酵过程中,C.alimentarius NCU005056不仅表现出较强的产酸能力(8.68 g/kg)和亚硝酸盐降解率(96.06%),同时作为核心功能微生物,该菌株还能通过产生乙酸激酶、草酸脱羧酶和香叶基焦磷酸合酶等关键酶,促进老坛酸菜特征风味的形成。LIU等[8]研究发现,自榨菜腌制第6天起,C.alimentarius含量持续上升,逐渐成为优势菌种,同时腈类物质的浓度与C.alimentarius的含量呈正相关。C.alimentarius的代谢产物如细菌素等,具有一定的抗菌活性,能够进一步保障发酵食品的微生物安全性[9]。因此,深入解析C.alimentarius调控鲊广椒品质的原因对鲊广椒工业化生产具有重要意义。本研究团队长期致力于鲊广椒发酵体系的系统性研究,同时积极采用纯培养技术对其中蕴含的乳酸菌资源进行挖掘,发现C.alimentarius为多个地区鲊广椒中优势可培养乳酸菌[10-12]。值得注意的是,在对传统发酵食品乳酸菌资源进行收集的过程中,发现C.alimentarius主要分离自两类典型发酵环境:鲊广椒与辣椒酱,尽管两者均以辣椒为主要原料[13],但辣椒酱体系营养环境更为贫瘠。基于“环境压力驱动微生物适应性进化”的理论基础[14],本研究提出关键科学问题:不同发酵环境来源的C.alimentarius菌株,是否因其环境适应性分化而导致鲊广椒品质产生差异。
本研究以团队前期从辣椒酱和鲊广椒中分离鉴定的39株C.alimentarius为研究对象,进行鲊广椒的制备,并采用电子鼻、电子舌、微生物计数和高通量测序技术,从多个维度揭示不同分离源C.alimentarius菌株制备的鲊广椒样品在品质上的差异。最后,结合细菌菌群与品质指标的相关性分析,明确C.alimentarius菌株对鲊广椒品质的影响,以期为调控鲊广椒发酵品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 C.alimentarius菌株信息
纳入本研究的39 株C.alimentarius菌株均为本实验室自主分离保藏,分离自辣椒酱(N)和鲊广椒(Y),具体信息见表1。
表1 不同分离源C.alimentarius菌株信息
Table 1 Information on C.alimentarius strains from different isolation sources
鲊广椒样品编号菌株分离源菌株编号NCBI登录号鲊广椒样品编号菌株分离源菌株编号NCBI登录号N1辣椒酱HBUAS664537ON205786Y1鲊广椒HBUAS51427OP024065N2辣椒酱HBUAS664597ON205621Y2鲊广椒HBUAS51429OP024067N3辣椒酱HBUAS56026MK396644Y3鲊广椒HBUAS51430OP024068N4辣椒酱HBUAS664520ON205776Y4鲊广椒HBUAS51431OP024069N5辣椒酱HBUAS664734ON142131Y5鲊广椒HBUAS51452OP024090N6辣椒酱HBUAS66292PV875859Y6鲊广椒HBUAS51464OP024102N7辣椒酱HBUAS66293PV875860Y7鲊广椒HBUAS51465OP024103N8辣椒酱HBUAS66294PV875861Y8鲊广椒HBUAS51475OP024113N9辣椒酱HBUAS66296PV875862Y9鲊广椒HBUAS51476OP024114N10辣椒酱HBUAS66298PV875863Y10鲊广椒HBUAS51480OP024118N11辣椒酱HBUAS664577ON205602Y11鲊广椒HBUAS51481OP024119N12辣椒酱HBUAS59820ON126124Y12鲊广椒HBUAS51482OP024120N13辣椒酱HBUAS66043OQ701440Y13鲊广椒HBUAS51483OP024121N14辣椒酱HBUAS664703ON142100Y14鲊广椒HBUAS51488OP024126N15辣椒酱HBUAS664708ON142105Y15鲊广椒HBUAS51489PV875864N16辣椒酱HBUAS664709ON142106Y16鲊广椒HBUAS51497OP024134N17辣椒酱HBUAS664745ON142142Y17鲊广椒HBUAS51499OP024136N18辣椒酱HBUAS664751ON142148Y18鲊广椒HBUAS51500OP024137N19辣椒酱HBUAS664721ON142118Y19鲊广椒HBUAS51505OP024142N20辣椒酱HBUAS664733ON142130
1.1.2 鲊广椒发酵原材料和试剂
玉米糁、二荆条辣椒、食盐、胡椒、花椒、白酒和陶坛,市售;阴离子溶液、阳离子溶液、内溶液和参比溶液,日本INSENT公司;MRS培养基、平板计数琼脂(plate count agar,PCA)培养基,国药集团化学试剂有限公司;DNeasy mericon Food Kit DNA基因组提取试剂盒,德国QIAGEN公司;引物338F/806R(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),上海美吉生物医药有限公司。
1.2 仪器与设备
LRH-150生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;5810R台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;PEN3电子鼻,德国Airsense公司;SA-402B电子舌,日本INSENT公司;Veriti96-Well梯度基因扩增仪,美国Applied Biosystems公司;164-5050基础电泳仪,美国Bio-Rad公司;UVPCDS8000凝胶成像分析系统,美国ProteinSimple公司;PE300 Illumina MiSeq高通量测序平台,美国Illumina公司。
1.3 实验方法
1.3.1 C.alimentarius菌株的活化和接种菌液制备
将菌株冻存管从-80 ℃超低温冰箱取出后,接入MRS液体培养基,37 ℃静置培养24 h,连续活化2代。吸取500 μL第2代活化菌液接种至装有50 mL MRS液体培养基的锥形瓶内,37 ℃培养24 h后离心去除培养基(3 000 r/min,4 ℃,10 min),无菌生理盐水洗涤2次后,加入50 mL无菌生理盐水制备成菌悬液备用。
1.3.2 鲊广椒样品的制备
鲊广椒的制作参考向秀连等[15]的工艺,选择新鲜的二荆条辣椒和无霉变的玉米糁为主要原料,每225 g辣椒中添加750 g玉米糁、48.75 g食盐、3.15 g胡椒粉、3.15 g花椒粉。工艺流程为:
二荆条辣椒→洗净→烘干→搅碎→搅拌(玉米糁、辅料和菌悬液)→装坛→覆盖玉米叶→坛口喷洒白酒→水封倒置发酵(30 ℃,28 d)→成品
1.3.3 鲊广椒样品挥发性风味指标的测定
使用电子鼻对不同菌株制备的鲊广椒样品的挥发性风味物质进行检测,内置10个对不同气体敏感的金属氧化物传感器,具体而言:W1C、W3C和W5C传感器用于识别芳香化合物;W1W传感器用于识别硫化物;W2W传感器用于识别有机硫化物;W2S传感器用于识别醇类、酮类和醛类;W3S传感器用于识别烷烃;W1S传感器用于识别烷烃类;W5S传感器用于识别氮氧化合物;W6S传感器用于识别氢气。样品预处理:称取10 g鲊广椒样品于50 mL电子鼻顶空瓶内,使用装有硅隔膜的盖子进行密封,室温下静置30 min,进行电子鼻测定,每个样品重复测定3次。测试条件:冲洗时间95 s,预采样时间5 s,样品进样时间90 s,进样流量为230 mL/min。取信号稳定后49～51 s结果的平均值,用于统计分析。
1.3.4 鲊广椒样品滋味指标的测定
使用电子舌对不同菌株制备的鲊广椒样品的滋味品质进行检测,内置7个传感器分别对酸味、苦味、涩味、咸味、鲜味、后味A(涩味的回味)、后味B(苦味的回味)和丰度(鲜味的回味)。样品预处理:称取30 g 鲊广椒样品,用120 mL纯水浸泡30 min后离心取上清(10 000 r/min离心10 min),备用。测试条件:实验前,使用Reference溶液和饱和氯化钾溶液将传感器活化24 h,安装传感器通过自检后,每个样品循环测定4次。
1.3.5 鲊广椒样品菌落总数和乳酸菌菌落总数测定
分别参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》、GB 4789.35—2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》对鲊广椒样本的菌落总数和乳酸菌总数进行统计。
1.3.6 细菌DNA的提取、16S rRNA扩增和高通量测序
根据试剂盒生产厂家的说明,使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因组提取试剂盒从鲊广椒样品中提取微生物群落基因组DNA。使用1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取物,并通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测提取的DNA的浓度和纯度。使用338F/806R扩增细菌16S rDNA的V3～V4区,使用1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测PCR提取物。最后,使用上海美吉生物医药有限公司的Illumina MiSeq平台进行高通量测序。
1.3.7 生物信息学分析
通过QIIME平台对原始16S rRNA基因测序读数进行生物信息学分析。具体而言:a)使用FLASH软件根据重叠区域对原始下机序列进行拼接;b)根据条形码和引物区分样品,并调整序列方向;c)使用UCHIME将序列中的接头、标签和引物进行去除;d)使用UCHIME算法去除嵌合体序列;e)使用Usearch在100%和97%的相似性水平下进行操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)的划分;f)从各个细菌OTU中选取代表性序列与SILVA数据库(http://www.arb-silva.de)进行比对,基于0.7的置信度阈值分析每个OTU代表性序列的分类学地位;g)基于OTU水平计算Shannon指数和Chao1指数,以评估鲊广椒细菌群落的α多样性;h)在OTU水平上基于Euclidean距离进行主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)评估鲊广椒细菌群落的β多样性差异;g)基于OTU水平根据直系同源蛋白数据库(clusters of orthologous groups of proteins,COG)对细菌基因功能进行注释。
1.4 数据处理与可视化
使用Past3软件进行各指标之间P值的差异;使用R软件进行相对强度热图、PCoA散点图、韦恩图、堆积柱形图、线性判别分析(linear discriminant analysis Effect Size,LEfSe)柱形图和相关性拟合曲线的绘制;使用Prism软件进行小提琴图的绘制;使用Canoco 5软件进行冗余分析(redundancy analysis,RDA)的绘制;使用Matlab软件进行马氏聚类的绘制。
2 结果与分析
2.1 不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品风味品质差异分析
使用电子鼻技术对不同分离源C.alimentarius菌株制备的鲊广椒样品的风味指标进行差异分析,结果如图1所示。
A-电子鼻相对强度热图;B-基于Bray距离的PCoA分析;C-RDA分析
图1 不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品风味品质差异分析
Fig.1 Analysis on flavor quality variations of Zha-chili samples prepared with C.alimentarius from different isolation sources
由图1-A可知,传感器W1W和W5S对分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品均具有较高的响应值,表明鲊广椒样品中富含更多的硫化物和氮氧化合物。由图1-B可知,不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品风味品质差异显著(P<0.05)。由图1-C可知,传感器W1C、W3C、W5C、W1W、W2W和W3S是区分2组样品风味品质的关键指标。结合Mann-Whitney检验显示,分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品中,传感器W1C、W3C和W5C的响应值显著偏高(P<0.05),而W1W、W2W和W3S的响应值显著偏低(P<0.05),这表明分离自辣椒酱的C.alimentarius制作的鲊广椒样品芳香类物质含量丰富,且硫化物和烷烃类物质含量品偏低,具有较好的风味品质。
2.2 不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品滋味品质差异分析
使用电子舌技术对不同分离源C.alimentarius菌株制备的鲊广椒样品的滋味指标进行差异分析,结果如图2所示。
A-电子舌相对强度热图;B-基于Bray距离的PCoA分析;C-RDA分析
图2 不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品滋味品质差异分析
Fig.2 Analysis on taste quality variations of Zha-chili samples prepared with C.alimentarius from different isolation sources
A-菌落总数;B-乳酸菌菌落总数;C-Chao1指数;D-Shannon指数;E-基于Euclidean距离的PCoA;F-基于Bray距离的马氏聚类分析
图3 微生物计数和细菌群落多样性差异分析
Fig.3 Analysis of differences in microbial count and bacterial community diversity
注:NS表示P>0.05,差异不显著;*表示P<0.05,差异显著;**表示P<0.01,差异极显著(下同)。
由图2-A可知,传感器咸味和鲜味对分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品均具有较高的响应值,表明鲊广椒样品中咸味和鲜味更突出。由图2-B可知,分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒在空间分布上存在明显分离趋势,PERMANOVA检验显示,两者滋味成分存在极显著差异(P<0.001)。由图1-C可知,分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的样品中,鲜味、苦味、涩味和后味A(涩味回味)的响应值显著偏高(P<0.05),而酸味、咸味、后味B(苦味回味)和丰度(鲜味回味)的响应值显著偏低(P<0.05),这表明辣椒酱来源的C.alimentarius制作的鲊广椒鲜味更突出,滋味品质更好。
2.3 不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品微生物计数和细菌群落多样性差异分析
本研究进一步对鲊广椒样品微生物计数和细菌群落多样性进行了分析,结果如图3所示。
由图3-A和图3-B可知,分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品菌落总数和乳酸菌菌落总数之间差异均不显著(P>0.05)。由图3-C和图3-D可知,分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品Chao1指数的平均值分别为1 082和1 065,Shannon指数平均值分别为3.04和2.28。Mann-Whitney检验发现,Shannon指数在2组样品之间存在显著差异(P<0.05),而Chao1指数之间差异不显著(P>0.05),表明分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品物种多样性显著偏高。由图3-E可知,不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品虽有重叠,但分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品较为集中的分布在X轴负半轴,而分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品分散于X轴正半轴。经PERMANOVA检验发现,不同分离源C.alimentarius制作的鲊广椒样品细菌群落结构之间存在显著差异(P<0.05)。马氏聚类亦证明(图3-F),分离自鲊广椒和辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品细菌群落结构在整体上存在极显著差异(P<0.01)。
2.4 不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品细菌群落结构差异分析
为识别造成不同分离源制作的鲊广椒样品细菌群落多样性存在差异的主要原因,本研究进一步在门和属水平上对2个分离源鲊广椒样品物种的分布特征进行了比较分析,结果如图4所示。
A-属水平韦恩图;B-属水平堆积柱形图;C-优势属差异柱形图
图4 鲊广椒样品细菌菌群分布特征差异分析
Fig.4 Analysis of differences in bacterial community distribution characteristics among Zha-chili samples
由图4-A可知,平均相对含量大于1%的细菌门有2个,分别为厚壁菌门(Firmicutes,91.56%～99.06%)和变形菌门(Proteobacteria,0.32%～6.48%)。由图4-B可知,平均相对含量大于1%的细菌属有6个,分别为伴生乳杆菌属(Companilactobacillus,23.79%～93.70%)、葡萄球菌属(Staphylococcus,0.08%～38.56%)、明串珠菌属(Leuconostoc,0.65%～35.65%)、片球菌属(Pediococcus,0.00%～35.37%)、魏斯氏菌属(Weissella,0.61%～18.90%)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus,0.00%～29.77%)。尽管2个分离源C.alimentarius菌株制备的鲊广椒样品细菌群落结构存在显著差异,但是优势微生物组成相似,均以Companilactobacillus为主,其在分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品中平均相对含量分别为64.48%和76.57%,其次为Staphylococcus和Leuconostoc,其在分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品中平均相对含量分别为7.83%和7.64%,在分离自鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品中平均相对含量分别为5.75%和5.45%。究其原因可能是,在鲊广椒制作过程中,2组实验所使用的原料高度一致,严格仅添加C.alimentarius菌株进行发酵,所以发酵体系中的微生物相对稳定和单一,对鲊广椒发酵过程中优势微生物群落的形成影响较小。由图4-C可知,Mann-Whitney检验发现,分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品中Weissella的平均相对含量为4.18%,极显著高于分离自鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品的2.71%(P<0.001)。Weissella属于革兰氏阳性、非运动、过氧化氢酶阴性和非孢子组细菌,目前大约22个官方认可的物种,广泛存在于发酵食品中[16]。它不仅能够分泌细菌素抑制致病菌生长,提高食品的安全性[17],还能够促进营养特性和感官结构的形成[18-19]。由此可见,辣椒酱分离源C.alimentarius制作的鲊广椒样品可能具有更高的食品安全性和感官品质。
2.5 不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品细菌OTU分布特征
本研究进一步绘制了OTU水平下的韦恩图,结果如图5所示。
A-不同组别OTU韦恩图;B-不同样品OTU韦恩图
图5 OTU水平韦恩图
Fig.5 Venn diagram at the OTU level
由图5-A可知,分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品分别特有947和676个细菌OTU,进一步证明分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品细菌多样性更高,与α多样性分析结果一致。2组共有的3 372个细菌OTU包含了1 115 028条序列,占总序列数的99.42%,亦证明分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品细菌类群大体相似。由图5-B可知,纳入本研究的39份鲊广椒样品中共有36个核心OTU,包含了898 151条序列,占总序列数的80.09%。本研究进一步对平均相对含量大于1%的核心OTU(所有样本中均存在)进行了分析,结果如表2所示。
表2 平均相对含量大于1%的核心OTU相对含量分析
Table 2 Analysis of the relative abundances of core OTU with an average relative abundance greater than 1%
OTU编号鉴定结果辣椒酱分离源/%鲊广椒分离源/%P值OTU7040Companilactobacillus59.28(62.01,18.73～90.89)72.05(76.06,50.04～91.75)0.053 6OTU12362Staphylococcus6.63(2.68,0.04～34.11)4.69(1.39,0.05～17.62)0.749 4OTU12235Pediococcus5.12(0.01,0.00～32.22)1.90(0.02,0.00～20.80)0.837 8OTU14990Leuconostoc2.95(2.40,0.14～14.90)2.06(1.79,0.21～5.28)0.549 9OTU11428Lactiplantibacillus2.23(0.06,0.00～20.99)2.11(0.08,0.00～26.46)0.692 6
注：表中“59.28(62.01,18.73～90.89)”表示“平均值(中位数,最小值～最大值)”,其他同。
由表2可知,平均相对含量大于1%的核心OTU有5个,分别为OTU7040(伴生乳杆菌属,Companilactobacillus)、OTU12362(葡萄球菌属,Staphylococcus)、OTU12235(片球菌属,Pediococcus)、OTU14990(明串珠菌属,Leuconostoc)和OTU11428(植物乳植杆菌属,Lactiplantibacillus),这5个OTU包含了894 529条序列,占总序列数的79.71%。其中,OTU7040占绝对优势,其在分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品中平均相对含量分别为59.28%和72.05%,表明Companilactobacillus是本研究制作的鲊广椒样品的主要细菌类群。
由表2亦可知,Mann-Whitney检验发现,5个OTU的平均相对含量在2个分离源之间不存在显著差异(P>0.05),亦证明分离自辣椒酱和鲊广椒的C.alimentarius制备的鲊广椒样品优势细菌群落组成较为相似。
2.6 不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品细菌基因功能预测分析
本研究进一步利用PICRUSt软件基于OTU水平对细菌群落的COG功能进行注释,探究不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品菌群功能差异,结果如图6所示。
图6 COG功能差异分析
Fig.6 Analysis of COG functional differences
由图6可知,不同分离源鲊广椒样品的COG功能信息组成大体相同,主要集中在“碳水化合物运输和代谢”、“翻译、核糖体结构和生物发生”和“氨基酸转运与代谢”这3个功能类别上,可见2个组别鲊广椒样品在风味物质合成方面具有较高的表达。Mann-Whitney检验发现,分离自辣椒酱的C.alimentarius制备的鲊广椒样品细菌群落在“翻译、核糖体结构和生物发生”和“复制、重组和修复”这2个功能类别上的平均相对含量显著高于鲊广椒分离源(P<0.05)。
2.7 C.alimentarius与风味和滋味指标的关联性分析
通过对微生物群落结构进行分析,本研究发现Companilactobacillus在不同分离源鲊广椒样品细菌群落结构中均占据绝对优势。因此,为探究添加C.alimentarius对鲊广椒样品品质的影响,本研究进一步基于Spearman相关性系数绘制了相关性拟合曲线,结果如图7所示。
A-苦味;B-涩味;C-咸味
图7 C.alimentarius与风味和滋味指标的相关性拟合曲线
Fig.7 Fitting curve of the correlation between C.alimentarius and flavor and taste indicators
由图7可知,Companilactobacillus与苦味(R=-0.325 0,P<0.05)和涩味(R=-0.335 1,P<0.05)显著负相关,与咸味显著正相关(R=0.339 7,P<0.05)。苦味的显著降低可能与Companilactobacillus代谢产生的增强味道属性的其他风味化合物有关,这些化合物可能有助于掩盖苦味[20]。综上所述,在鲊广椒制作中添加C.alimentarius菌株可显著抑制苦味和涩味等不良风味。
3 讨论
鲊广椒现有生产工艺存在2个关键制约因素:a)依赖自然环境微生物接种的发酵模式导致产品品质波动;b)以家庭作坊式生产为主,存在工艺参数模糊、卫生控制缺失等标准化缺陷,这些因素严重制约产业规模化发展。纯种发酵技术为解决这些问题提供了有效解决方案,其工业化应用价值主要体现在以下3方面:a)在食品安全控制方面,纯种发酵能显著提升产品卫生质量。高梦颖等[21]研究发现,相较于自然发酵,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)纯种发酵的豆豉中挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)含量和过氧化值(peroxide value,POV)显著偏低;马艳弘等[22]亦证明,相较于自然发酵,植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum M1)纯种发酵显著降低山药泡菜的大肠杆菌数量。b)在风味品质调控方面,纯种发酵能实现特征风味物质的定向富集。ZHANG等[23]研究发现,米曲霉(Aspergillus oryzae AS3042)纯种发酵豆酱中游离氨基酸和醛类物质含量分别为27.89 mg/g和5 153.3 μg/kg,显著高于自然发酵样品的17.66 mg/g和2 203.8 μg/kg;朱绍林等[24]研究发现,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)C12纯种发酵的葡萄酒中酯类物质总含量为13 112.30 μg/L,显著高于自然发酵样品的9 945.43 μg/L。同时,本研究采用C.alimentarius菌株进行纯种发酵,发现鲊广椒的涩味和苦味得到显著提升。c)在生产效率方面,纯种发酵能明显缩短发酵周期。马文艺等[25]研究发现,接种L.plantarum发酵糟辣椒的发酵周期由20 d缩短至10 d;何扬波等[26]亦使用L.plantarum发酵红酸汤,将发酵时间缩短为9 d。综上所述,纯种发酵技术不仅能有效解决传统工艺的品质波动问题,更能通过菌种选育实现产品创新,为鲊广椒产业升级提供关键技术支撑。
纯种发酵技术的应用效果关键在于菌株的生物学特性,而这些特性主要源于分离源环境的长期驯化。本研究表明,辣椒酱和鲊广椒分离源的C.alimentarius菌株在发酵特性上存在显著分化,表现为辣椒酱来源的C.alimentarius菌株制备的鲊广椒样品风味和滋味品质更优。究其原因,鲊广椒样品感官品质差异与分离源环境密切相关。具体而言,鲊广椒以玉米糁为主要原料,其富含的淀粉和蛋白质等营养物质要求微生物具备分泌淀粉酶系和蛋白酶系的能力,进而通过代谢产生游离氨基酸、有机酸、脂肪酸及含硫化合物[27]。这种特性使得使用分离自鲊广椒的C.alimentarius菌株制备的鲊广椒样品在硫化物含量和酸味上显著偏高。相比之下,辣椒酱的简单糖类基质塑造了微生物的快速代谢特性,因此风味物质的累积也更为迅速。此外,辣椒酱发酵环境选择压力更强:一方面,制作过程中会添加大量的食盐,这要求存活的微生物具备较强的耐渗透压和食盐利用效率,这也解释了为何源自辣椒酱的C.alimentarius菌株所制备的鲊广椒样品咸味显著偏低;另一方面,辣椒酱样品中辣椒素含量偏高,辣椒素可通过改变细胞呼吸速率、抑制糖基转移酶等方式限制微生物生长[28]。在这样强选择压力条件下存活的微生物往往具备更强的环境适应能力,因此当其接种到营养更丰富、环境更温和的鲊广椒中时,能更快适应新环境并表现出更活跃的生长繁殖特性。基于COG的功能预测进一步证实,分离自辣椒酱的C.alimentarius菌株所制备的鲊广椒样品细菌群落在与生长繁殖密切相关的功能类别上的基因显著表达[29],这也为分离自辣椒酱的C.alimentarius菌株在鲊广椒样品中表现出更强的生长繁殖能力提供了支持。综上可见,菌株的生化特性对发酵食品的品质具有决定性影响。因此,许多研究者从遗传学分析角度揭示了不同菌株的基因分布特征,以期通过基因改造手段开展靶向筛选,从而进行发酵性能的优化[30]。
本研究发现,尽管不同分离源C.alimentarius制备的鲊广椒样品均以Companilactobacillus为优势菌属,但分离自辣椒酱的C.alimentarius所制备的鲊广椒样品细菌群落多样性显著偏高。究其原因可能是,辣椒酱分离株长期在营养贫瘠的环境中生存,所以当其转入营养丰富的鲊广椒基质后仍保持较低的底物利用效率,未被充分利用的营养物质促进了其他微生物的生长,进而调控了鲊广椒发酵过程中的微生物群落组装。本团队前期的研究亦从多维度证实了发酵条件的变化直接作用于鲊广椒的微生物群落结构。例如,陈邵德罡等[31]研究发现,相较于塑料罐和玻璃罐,陶瓷罐发酵的鲊广椒中细菌和真菌群落丰富度和多样性显著降低;席啦等[32]研究发现,随着玉米添加量的增加,鲊广椒样品中乳杆菌属(Lactobacillus)的含量不断下降;向秀连等[15]研究发现,随着盐浓度的增加,Lactobacillus的含量逐渐上升,当盐添加量为5%时,鲊广椒中的菌群结构已趋于稳定。综上所述,发酵条件的变化直接作用于鲊广椒样品的微生物群落结构,从而导致微生物的种类、数量、丰度和相互作用关系发生改变。然而,微生物差异会进一步调控代谢产物谱特征,导致鲊广椒品质产生差异。因此,深入揭示“发酵条件-微生物群落结构-感官品质”之间的内在作用机制,能够为鲊广椒的标准化生产与品质提升提供理论指导。
4 结论
相较于鲊广椒分离源的C.alimentarius菌株,辣椒酱分离源的C.alimentarius菌株所制备的鲊广椒样品,其芳香类物质含量丰富,鲜味突出,细菌多样性显著增加。这种差异可能与辣椒酱分离源菌株在翻译、核糖体结构与生物发生以及复制、重组和修复等功能上的优势表达有关。进一步研究表明,添加C.alimentarius菌株能有效提升鲊广椒的滋味品质。因此,辣椒酱分离源的C.alimentarius菌株制作的鲊广椒品质更佳。
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