碳中和是实现社会可持续发展的关键要素之一。随着可持续发展理念的深入推进,可再生资源的循环利用日益受到重视。乙酸作为一种清洁能源分子,为构建低成本、可持续的生物制造体系提供了可能,同时避免了与耕地资源和粮食生产的竞争[1]。目前,乙酸的制备途径主要包括化学合成和生物转化2种方式,后者包括木质纤维素生物质降解[2]以及微生物电合成(microbial electrosynthesis, MES)还原二氧化碳等[3]。乙酸因其能直接进入中心碳代谢,同化速度更快速,使其成为合成生物学研究中具有一定优势的底物。目前,乙酸已被广泛应用于生物燃料、氨基酸及其他高附加值化合物的生物合成[4]。
在可利用乙酸的微生物宿主中,解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)因其公认的安全特性(generally recognized as safe, GRAS)、天然的乙酸同化途径以及较强的乙酸耐受性而备受关注。与大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母等传统宿主相比,这种非模式酵母已被成功用于从乙酸合成三乙酸内酯(triacetic acid lactone, TAL)、聚羟基丁酸(poly hydroxy butyrate, PHB)及多种脂质产物[5-6]。然而,高浓度乙酸对细胞的生长抑制作用仍然是一个重要限制因素,因此筛选适合的底盘菌株对于构建高效细胞工厂至关重要。
(R)-3-羟基丁酸[(R)-3-hydroxybutyrate, (R)-3-HB]是一种乙酰辅酶A衍生的短链脂肪酸。作为重要的生物基平台化合物,(R)-3-HB不仅是可降解塑料PHB的单体[7],也是合成碳青霉烯类和二醇类抗生素的关键前体[8-9],同时还具有作为能量补充剂的潜力[10]。近年来,随着合成生物学技术的发展,微生物发酵法生产(R)-3-HB逐渐成为研究热点。目前在以葡萄糖为底物的条件下在大肠杆菌中实现了(R)-3-HB的最高产量,达到75.7 g/L[11]。但是以乙酸作为底物生产量还处于较低水平,现有产量仍显不足。例如,FEI等[12]利用来自富养罗尔斯通氏菌的乙酰辅酶A还原酶(PhaB)改造大肠杆菌,首次实现了以乙酸为唯一碳源合成(R)-3-HB,产量达到0.86 g/L;随后,FEI等[13]通过模拟合成气生成乙酸,将(R)-3-HB产量提升至1.83 g/L。尽管如此,现有产量仍显不足。为实现乙酸高效转化为(R)-3-HB需要筛选合适的底盘菌株。同时,还需对关键酶与代谢途径进行筛选与精准调控。因此,本研究筛选了乙酸耐受型解脂耶氏酵母,并在该底盘中构建了(R)-3-HB合成途径,通过系统筛选关键酶、优化内源碳代谢流,显著提高了(R)-3-HB的合成效率。最终,工程菌株在5 L发酵罐中以乙酸为唯一碳源实现了5.50 g/L的(R)-3-HB产量。
1 材料与方法
1.1 菌株与培养条件
本研究使用大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α作为质粒扩增宿主,于LB液体培养基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl)中37 ℃、220 r/min振荡培养。解脂耶氏酵母工程菌株在YPD培养基(20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖)中30 ℃、220 r/min培养;筛选重组菌株时,培养基中添加终质量浓度为250 mg/L的硫链丝菌素(thiostrepton)。实验所用菌株及质粒信息详见电子版增强出版附表1和附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044375,后附图、附表同)。
此外,本研究选择解脂耶氏酵母基因组中已验证的标签化基因整合位点进行外源基因整合,已有研究表明这些位点的整合不会影响宿主菌的生长特性[14]。
1.2 gRNA质粒构建与重组菌株构建
采用CHOPCHOP在线工具(https://chopchop.cbu.uib.no/)[15]设计20 bp靶向特定基因组位点的gRNA序列,并将其克隆至pCfB3405载体[16]。以解脂耶氏酵母YL305基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得启动子、终止子及同源臂片段。外源基因PhaB及其他相关基因经密码子优化后由北京擎科生物科技有限公司合成。利用重叠延伸聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术制备基因组整合片段。采用醋酸锂转化法[14],将gRNA质粒与相应整合片段共转化至解脂耶氏酵母,获得重组工程菌株。
1.3 摇瓶发酵
(R)-3-HB生产菌株在合成培养基中培养,培养基组成如下(g/L):(NH4)2SO4 7.5,KH2PO4 14.4,MgSO4·7H2O 0.05,乙酸铵26,2 mL/L微量元素溶液(FeSO4·7H2O 3、ZnSO4·7H2O 4.5、CaCl2·2H2O 4.5、MnCl2·2H2O 0.84、CoCl2·6H2O 0.3、CuSO4·5H2O 0.3、Na2MoO4·2H2O 0.4、H3BO3 1、KI 0.1和Na2EDTA·2H2O 19),1 mL/L维生素溶液(D-生物素0.05、D-泛酸半钙盐1、盐酸硫胺素1、盐酸吡哆醇1、烟酸1、4-氨基苯甲酸0.2、肌醇25)。将种子液以初始OD600nm值=0.1接种至含20 mL培养基的100 mL锥形瓶中,30 ℃、250 r/min振荡培养72 h。
1.4 产物分析
发酵液经14 000 r/min离心5 min后,取上清液过0.22 μm无机微孔滤膜。采用Agilent Infinity 1200高效液相色谱系统进行分析,色谱条件为:Aminex HPX-87H色谱柱(Bio-Rad),流动相为5 mmol/L H2SO4,流速0.6 mL/min;示差折光检测器(differential refractive index detector, RID)温度35 ℃,柱温63 ℃;进样体积5 μL。通过外标法计算(R)-3-HB和乙酸浓度。
1.5 补料分批发酵
在5 L发酵罐中进行补料分批发酵,初始装液量2 L,培养基组成与摇瓶发酵相同。发酵参数控制如下:搅拌速率300～1 000 r/min,通气量0.4 VVM(1.6 L/min),溶解氧(dissolved oxygen, DO)维持在30%;温度30 ℃,pH 6.0(通过自动补加10 mol/L KOH调节)。浓缩补料液组成(g/L):(NH4)2SO4 25,KH2PO4 15,MgSO4·7H2O 2.5,10 mL/L微量元素溶液(成分同1.3节微量元素溶液),5 mL/L维生素溶液(成分同1.3节维生素溶液)和乙酸铵400。发酵过程中控制乙酸质量浓度约10 g/L,定期取样检测菌体密度(OD600nm值)、乙酸及(R)-3-HB质量浓度。
1.6 序列分析与系统发育树构建
本研究从KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)中检索获取K00023基因编码的氨基酸序列,并采用CD-HIT对序列进行聚类分析,设定在70%的序列相似性阈值以去除冗余序列。系统发育分析采用最大似然法(maximum likelihood, ML)bootstrap重复次数设为1 000,分别使用IQ-TREE和MEGA软件进行建树分析。最终获得的系统发育树通过在线平台Interactive Tree of Life(https://itol.embl.de/)进行可视化优化。
1.7 转录组取样与分析
种子液以OD600nm值=0.1接摇瓶发酵,在发酵第72 h取样,迅速转移摇瓶至冰上。在冰上将发酵液转移至50 mL离心管,4 ℃、3 000 r/min。用冰水洗涤菌体3次,第3次洗涤加水后,分装样品至1.5 mL离心管,每个摇瓶取1管,共6管(每组3个平行),4 ℃离心,吸干上清液。液氮速冻,-80 ℃保存,送检。采用RSEM(RNA-Seq by expectation-maximization)根据比对结果估算转录本丰度,差异表达分析则采用R软件包DESeq2进行差异表达分析。筛选条件为差异表达倍数和校正P值(P<0.05),采用R软件包PIANO进行GO分析。
2 结果与分析
2.1 基于多层次策略的底盘菌株筛选
解脂耶氏酵母因其内源乙酸同化途径可将乙酸转化为关键细胞代谢中间体乙酰辅酶A,是乙酸利用的理想宿主。然而,高浓度乙酸及低pH条件会显著抑制其生长代谢活性,这成为制约其高效利用的主要技术瓶颈[17]。
本研究以模式解脂耶氏酵母W29为对照,采用多层次筛选策略从实验室保藏的255株解脂耶氏酵母菌株库中筛选具有乙酸耐受性的优良菌株(图1-a)。首先在pH 4.0～6.0、20 g/L乙酸条件下对W29菌株进行第一层筛选。结果显示,菌株在pH 4.0～5.0条件下均不能生长;在pH 5.5时虽然最大OD600nm值可达7,但延滞期显著延长至72 h,远高于pH 6.0条件下的6 h(附图1)。基于此,在pH 6.0、20～60 g/L乙酸条件下对W29菌株进行第二层筛选,发现在该条件下,延滞期随乙酸质量浓度升高而延长,当质量浓度达60 g/L时生长完全被抑制(附图2)。因此,确定在pH 6.0、50 g/L乙酸条件下对菌株库进行第三层筛选(附图3)。
a-解脂耶氏酵母底盘菌株筛选流程概览;b-在50 g/L乙酸、pH值为6条件下,22株解脂耶氏酵母相对于W29的最大比生长速率提升幅度;c-不同解脂耶氏酵母菌株在50 g/L (R)-3-HB条件下的生长曲线;d-不同解脂耶氏酵母菌株对(R)-3-HB的消耗情况
图1 乙酸基(R)-3-HB生物合成解脂耶氏酵母底盘菌株的筛选
Fig.1 Screening of Y.lipolytica chassis strain suitable for acetate based (R)-3-HB bioproduction
a-解脂耶氏酵母中(R)-3-HB合成途径示意图。b-PhaB的系统发育分析。c-不同来源PhaB在工程菌株中的(R)-3-HB合成能力比较;d-不同来源硫酯酶对(R)-3-HB合成效率的影响
图2 高效(R)-3-HB合成途径的构建及其评价
Fig.2 Construction and evaluation of an efficient (R)-3-HB biosynthetic pathway
注:a图中红色标注的酶表示异源表达蛋白。内源性乙酰乙酰辅酶A合成酶(ERG10)催化2分子乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酰辅酶A;随后由异源表达的PhaB介导乙酰乙酰辅酶A转化为(R)-3-羟基丁酰辅酶A;最终通过硫酯酶水解释放(R)-3-HB。同时,乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A可经羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(Erg13)催化生成羟甲基戊二酰辅酶A,继而在羟甲基戊二酰辅酶A裂解酶(YALi1_B29483 g)作用下生成乙酰乙酸;或由乙酰乙酰辅酶A在3-酮酸辅酶A转移酶(YALi1_34029 g)催化生成乙酰乙酸。此外,通过异源表达3-羟基丁酸脱氢酶(bdhA)同样可获得(R)-3-HB;b图中黑色标注节点代表本研究筛选的PhaB,红色标注节点代表已报道的PhaB来源菌株。
a-优化AlPhaB拷贝数对(R)-3-HB产量的影响;b-解脂耶氏酵母中(R)-3-HB旁路代谢通路示意图(红色路径表示相应反应的敲除);c-敲除ECHS1基因对(R)-3-HB产量的影响
图3 调节(R)-3-HB合成通路的代谢流
Fig.3 Regulation of the metabolic flux of the (R)-3-HB synthesis pathway
注:误差线表示3次重复的标准差,t检验显著性水平:*表示P<0.05,**表示P<0.01;“+”个数表示基因拷贝数。
与W29相比,从菌株库中共鉴定出22株在最大比生长速率上具有优势的菌株,较W29提高130%～200%(图1-b)。进一步,在50 g/L、pH 5.6～5.7条件下对这22株酵母进行第四层筛选,最终获得6株优势酵母(YL47、YL66、YL129、YL140、YL305和YL306)(附图4)。
图4 菌株TL25与TL23转录组数据的GO富集分析
Fig.4 GO enrichment analysis of transcriptome data of strain TL25 vs TL23
注:颜色深浅表示富集程度。
已有研究表明,40 g/L (S)-3-羟基丁酸可显著抑制酿酒酵母的生长[18]。基于此,本研究在更高质量浓度(50 g/L)的(R)-3-羟基丁酸条件下对6株工程菌株及W29进行了生长评估。图1-c表明,各菌株的生长行为存在差异,其中YL140和YL305的最终生物量(OD600nm值)最高,分别达到8.37和8.30。定量分析结果表明,所有测试菌株均具备(R)-3-HB代谢能力,但YL305的单位生物量消耗速率最低[0.43 g/(L·OD)](图1-d)。通过这种多参数筛选策略,最终选定YL305作为后续代谢工程研究的优势底盘菌株。
为便于YL305的基因工程改造,本研究通过将KU70基因编码序列替换为基因编辑Cas9蛋白表达盒,成功构建了重组菌株TL0。随后通过对多个已表征基因组整合位点的测试(附图5),证实TL0中的CRISPR/Cas9基因编辑系统具有预期的基因组编辑效率。
a-乙酰辅酶A代谢途径示意图。b-ackA-pta表达菌株生长参数;c-ackA-pta表达对(R)-3-HB产量的影响;d-ackA-pta表达菌株发酵液中乙酸产量;e-PhaA表达对(R)-3-HB产量的影响
图5 增强前体供应提高(R)-3-HB产量
Fig.5 Enhancement of precursor supply for improved (R)-3-HB production
注:a图中红色表示解脂耶氏酵母内源基因,蓝色表示异源表达基因;“-”表示外源基因未整合,“+”表示外源基因整合表达。
2.2 底盘菌株TL0中(R)-3-HB合成途径的构建
从乙酰辅酶A到(R)-3-HB生物合成已报道有至少4条代谢途径[19]。根据这些途径的特点以及解脂耶氏酵母有无相关酶(图2-a),仅需引入一个外源基因即可在解脂酵母中构建PhaB或bdh途径。基于此,本研究以TL0菌株为宿主,分别对PhaB和bdh途径进行了代谢途径验证。将来源于玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)的PhaB基因[20]与来源于艰难拟梭菌(Clostridioides difficile)的BdhA基因[21]经密码子优化后整合至TL0基因组中分别获得重组菌株TL-PhaB和TL-bdhA。发酵结果表明,TL-PhaB的(R)-3-HB产量为37.8 mg/L,较TL-bdhA提高了61%(附图6),该结果提示了2条内源途径在代谢流分配上存在差异。因此,后续研究选择PhaB途径进行进一步工程化改造。
图6 TL29菌株在5L发酵罐中分批补料发酵检测结果
Fig.6 Fermentation results of strain TL29 in 5-L bioreactor under fed-batch conditions
注:在稳定分批补料条件下,TL29菌株培养过程中(R)-3-HB、乙酸及菌体生物量的定量分析。
为筛选能够高效催化乙酰辅酶A转化为(R)-3-羟基丁酰辅酶A的PhaB,本文从KEGG数据库中收集了2 474个注释为PhaB的序列。经过序列长度筛选和70%序列同一性聚类去冗余分析,最终获得261个候选序列。通过系统发育树分析可将这些PhaB划分为8个进化分支,其中文献中报道的H.boliviensis和杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的PhaB均归属于第Ⅶ类(附图7)。基于上述分析结果,从第Ⅶ类中选择9个PhaB进行密码子优化,并采用TL0菌株作为宿主验证其(R)-3-HB合成能力。实验过程中同时引入2种已报道的参考酶及其突变体(图2-b),最终成功构建13株PhaB过表达工程菌株。
摇瓶发酵实验结果显示,构建的13株工程菌均表现出(R)-3-HB合成能力。其中,以20 g/L乙酸为唯一碳源时,小陌生菌属(Advenella sp.)来源的PhaB在TL05菌株中展现出最优性能,其(R)-3-HB产量达到37.8 mg/L(图2-c)。对比分析发现,虽然H.boliviensis(HbPhaB)和C.necator(CnPhaB)来源的PhaB分别实现了33.6 mg/L和25.4 mg/L的(R)-3-HB产量,但相应菌株生物量与TL05相比分别降低了12.4%和48.8%(附图8),这一结果表明这2种已报道的PhaB可能对宿主细胞产生更大的代谢负担。基于上述结果,后续实验选用TL05菌株及其携带的AlPhaB作为研究对象。虽然解脂耶氏酵母内源硫酯酶(thioesterase, TE)可催化(R)-3-HB-CoA水解反应并释放产物,但引入高活性外源硫酯酶可能进一步提升(R)-3-HB产量。为此,本研究筛选了7种不同来源的酰基辅酶A硫酯酶进行功能评价,包括:E.coli来源的FadM、YciA和TesB;恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的TesB;椰子(Cocos nucifera)来源的FatB1;大鼠(Rattus norvegicus)来源的TEII;以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的ATL4(图2-d)。摇瓶发酵分析显示,在工程菌株TL05中异源表达YciA的改造菌株TL20,(R)-3-HB产量最高可达46.6 mg/L,较TL05提高了23.6%。以上结果表明,在解脂耶氏酵母中成功构建了基于AlPhaB和YciA的高效(R)-3-HB合成途径。实验数据证实,通过优化途径关键酶的协同作用可有效调控代谢流分配。
2.3 代谢途径优化增强(R)-3-HB产量
关键代谢通路基因的过表达往往可以提升目标产物的产量,本研究通过在染色体上整合多个AlPhaB表达盒,构建了TL21至TL24系列工程菌株。通过比较发现,随着拷贝数的增加,(R)-3-HB产量随之增加,其中整合4个AlPhaB拷贝的TL23菌株表现最佳,(R)-3-HB产量达到70.1 mg/L,达到TL20的1.5倍(图3-a)。5拷贝菌株TL24的(R)-3-HB产量相比TL23反而下降,可能是由于拷贝数增加蛋白表达形成的细胞代谢负担加重导致的。
由图1-c可知,底盘菌YL305存在消耗(R)-3-HB的现象。摇瓶发酵过程也显示(R)-3-HB质量浓度呈逐步下降趋势(附图9)。作为短链脂肪酸衍生物,(R)-3-HB既可进入β-氧化循环重新生成乙酰辅酶A用于中心代谢,也可通过逆向β-氧化用于脂肪酸链延长[22]。在解脂耶氏酵母中,烯酰辅酶A水合酶{[enoyl-coenzyme A(CoA) hydratase,ECH],注释为ECHS1}催化3-羟基酰辅酶A脱水生成反式-2-烯酰辅酶A,是短链脂肪酸(C4～C6)代谢的关键步骤(图3-b)。基于该代谢特征,本研究推测敲除ECHS1可阻断(R)-3-HB-CoA的脱水过程,从而减少产物的代谢消耗。实验结果显示,ECHS1敲除菌株TL25的(R)-3-HB产量达到219.9 mg/L,较TL23提高了213.6%(图3-c)。
然而,ECHS1敲除对细胞产生了显著的负面影响:菌体生物量下降66.0%,乙酸同化率降低61.3%。推测这可能是由于ECHS1在脂肪酸生物合成中的关键作用所致,其缺失会显著抑制长链脂肪酸(C16～C18)的合成,进而破坏细胞膜完整性,最终导致生长受限[23]。对ECHS1敲除菌株TL25进行了转录组学的检测,并通过GO富集分析绘制了相关的代谢热图(图4)。转录组学数据进一步揭示分析ECHS1敲除对细胞系统性的影响。TL23菌株在ECHS1基因敲除后,真菌型细胞壁组织相关基因[GO:0031505]的下调削弱了膜重塑能力,中心碳代谢[GO:0005975]相关基因呈现严重下调,碳代谢流重新获得了分配,基于上述分析可能是TL25中(R)-3-HB产能强化的潜在原因。
2.4 增强前体供应提高(R)-3-HB产量
前期研究证实,解脂耶氏酵母具有内源性Acs途径,可通过乙酰辅酶A合成酶(acyl coenzyme A synthetase, ACS)将乙酸直接转化为乙酰辅酶A。然而,该过程需消耗2分子ATP。与Acs途径相比,异源ackA-pta途径通过乙酸激酶(ackA)和磷酸转乙酰酶(pta)将乙酸转化乙酰辅酶A(图5-a)。由于该途径仅消耗1分子ATP,因此认为是更高效的乙酸同化途径[24]。
本研究通过整合E.coli的ackA和pta基因至TL25菌株,成功构建了TL26至TL28工程菌株。发酵实验结果显示(图5-b和图5-c),单独表达ackA菌株TL26展现出严重的生长受损现象,(R)-3-HB产量仅有55.8 mg/L。相比TL25菌株,生物量和产量分别下降了93.2%和73.7%。而单独表达pta的TL27菌株产量达到268.93 mg/L,较TL25提高了34.7%。但72 h乙酸消耗量达13.5 g/L,较TL25提高70%。单位细胞乙酸消耗量从2.35 g/(L·OD) (TL25)增至7.03 g/(L·OD) (TL27),提升了近3倍。因此,TL27菌株(R)-3-HB产量虽然增加,但得率下降明显。另一方面共表达ackA和pta的TL28菌株相比TL27未展现出更高的(R)-3-HB产量,且比对照菌株TL25的产量也有下降。这些结果证明,ackA和pta的过表达不利于细胞生长和产物合成。可能的原因是ackA和pta两个基因催化的反应都是可逆反应,结合胞内ACS,可能会形成一个乙酸、乙酰磷酸、乙酰辅酶A之间的低效循环。
为了打破这个循环,本文试图增强乙酰辅酶A的向下游转化的能力。基于文献报道的PhaA(乙酰辅酶A乙酰转移酶)具有提升PhaB途径合成(R)-3-HB的作用[11],结合Halomonadaceae底盘菌株的高(R)-3-HB合成特性,本研究将Halomonas TD01的PhaA基因整合至TL27中。获得的TL29菌株在摇瓶发酵中(R)-3-HB产量达到377.86 mg/L(图5-e)。相比TL27提升了37.7%。该结果表明,外源PhaA可有效弥补解脂耶氏酵母内源Erg10的不足,显著提高(R)-3-HB合成水平。
2.5 放大发酵提升(R)-3-HB生产水平
为评估工程菌株TL29在补料发酵条件下的产物合成水平,本研究在5 L发酵罐中进行了乙酸浓度受控(维持在约10 g/L)的分批补料发酵实验。发酵过程pH值控制在6,溶氧水平控制在30%。发酵216 h,共消耗343.7 g/L乙酸。整体上菌体生物量OD600nm值与产物浓度均呈现持续增长的趋势。细胞OD600nm值达到63.3,(R)-3-HB产量达到5.50 g/L(图6),这是目前报道中以乙酸为唯一碳源在解脂耶氏酵母中生产(R)-3-HB的最高产量。该结果表明TL29作为高效乙酸利用底盘菌株,在(R)-3-HB工业化生产中具有重要应用价值。
3 结论
本研究成功筛选了一株具有乙酸高耐受解脂耶氏酵母的底盘菌株。在该底盘菌株中构建了以乙酸为唯一碳源合成(R)-3-HB的代谢途径。通过合成途径的系统优化,显著提高了(R)-3-HB的合成能力,摇瓶培养条件下(R)-3-HB产量达377.86 mg/L;在5 L发酵罐分批补料培养中,产量进一步提升至5.50 g/L。这一结果创造了以解脂耶氏酵母为宿主、乙酸为唯一底物合成(R)-3-HB的最高产量纪录。本研究成果不仅为微生物合成(R)-3-HB的细胞工厂构建提供了重要基础,也为乙酸生物转化制备高值化学品开辟了新路线。但总体上(R)-3-HB产量相比葡萄糖作为碳源时仍然较低。一方面,通过辅因子工程或者耦联胞外能量供给也许可以解决乙酸作为碳源时的还原力和能量供给不足的问题,提升产物合成水平。另一方面,调整接种水平、乙酸和铵盐的补料方式是未来缩短发酵周期,提升产物合成效率的改造方向。
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