沙棘(Hippophae rhamnoides L.subsp.chinensis Rousi)是一种资源丰富、分布广泛的植物,兼具悠久的食用与药用历史。其果实营养全面,药用价值显著,数个世纪以来已被广泛应用于多种传统医学体系。其中,沙棘多糖(sea buckthorn polysaccharides,SBP)因具有抗氧化[1]、抗衰老[2]、降血糖、护肝[3]、抗肿瘤[4]等多重药理活性而备受关注;研究证实,多糖的生物活性受其相对分子质量调控:过高的分子质量会因分子间作用力强、空间位阻大而导致溶解性下降,这种理化性质的限制最终削弱了其生物活性和应用潜力[5]。而降解可以降低多糖分子质量和聚合度从而改善其溶解性和生物活性[6]。
目前主要分为化学、物理、生物等方法对植物多糖进行降解和结构修饰。化学降解主要包括酸降解、碱降解和自由基降解等多种途径。化学降解主要通过化学试剂或反应条件破坏多糖分子中的碳链,使其断裂成低聚糖、寡糖或单糖的过程。化学降解方法虽具有操作简便、成本低廉且无辐射污染等优点,但其使用的试剂可能造成环境污染并引入重金属离子,存在一定的环境与安全风险。常见的物理降解方法,如超声波、微波、水热及电离辐射法,通常具备操作流程简单、降解效率高的特点;然而,这些方法往往依赖于专用设备,导致其初始投入成本较高。生物降解主要利用微生物或酶;微生物降解主要是利用微生物发酵植物多糖,从而改变多糖的组成结构和生物活性。酶降解通过特定的水解酶(果胶酶、纤维素酶、淀粉酶等)使多糖大分子的糖苷键断裂,从而降低多糖聚合度[7];生物降解法有着条件温和、环保无污染、降解高效、专一性强的优点,尤其是酶法降解对多糖的降解高效且特异性较强,但酶法降解还需要对酶解条件进行控制以确保其能高效降解。LI等[8]利用藻酸盐裂解酶通过热酸-酶解法从海带中制备低分子质量多糖,结果表明,该多糖在体外具有优异的油脂与胆固醇吸附能力,在体内能显著抑制高脂饮食小鼠的体重增长、调节脂质代谢、改善肝脏脂肪变性及肠道损伤。SUMIYOSHI等[9]研究发现,壳聚糖酶水解后的低分子质量壳聚糖能有效抑制胰脂肪酶活性、减少肠道脂质吸收,并通过促进粪便胆汁酸和脂肪排泄发挥降脂作用,表现出最显著的降脂活性。ZHANG等[10]用蜗牛酶降解杏鲍菇多糖,降解后的多糖可显著改善高脂血症小鼠的血脂水平、肝功能指标及抗氧化状态,并有效减轻肝组织损伤。TAO等[11]使用纤维素酶降解人参多糖,降解后的人参多糖具有较好的抗氧化、降血糖和降血脂活性。王秋艳[12]利用果胶酶修饰金针菇多糖,研究发现,经过酶法修饰的金针菇多糖具有更好的降血脂功效。孔志强等[13]利用H2O2联合Fe2+法降解沙棘多糖,降解后的沙棘多糖的功能特性和抗氧化活性明显增强。目前尚未有研究报道利用聚半乳糖醛酸-果胶酶酶解技术从沙棘多糖中制备具有降脂护肝活性的酶解产物。
因此,本研究利用聚半乳糖醛酸-果胶酶对沙棘多糖进行酶法降解。通过响应面法与人工神经网络-遗传算法(artificial neural network-genetic algorithm,ANN-GA)协同优化酶解工艺,成功制备了酶解沙棘多糖(enzymatic sea buckthorn polysaccharides,ESBP),测定其抗氧化活性,并通过建立游离脂肪酸诱导人肝脏胚胎肿瘤(HepG2)细胞高脂模型,探究沙棘酶解多糖对HepG2细胞的降脂保护作用。本研究不仅为多糖的酶法修饰提供了新方法,也为开发缓解非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的功能性食品奠定了理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘果,陕西天行健生物化工技术有限公司;聚半乳糖醛酸-果胶酶,上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇(分析纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;HepG2细胞,中国科学院细胞库;杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM),美国Gibco公司;胎牛血清,美国Zeta Life公司;棕榈酸钠、油酸钠,西安鲲创科技发展有限公司;胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒,北京坛墨质检科技有限公司。
1.2 仪器与设备
RE52-99旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器;BSA224S-CW电子天平,德国Sartorius公司;T2600紫外分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司;BC-J160-S CO2培养箱,博讯科技有限公司;1300 series A230%生物安全柜、Varioskan flash全波长扫描多功能酶标仪,赛默飞世尔科技有限公司;CKX53光学显微镜,Olympus科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 沙棘多糖的提取
参照宋永程[14]的方法,并略作改动。将沙棘果烘干粉碎后,用石油醚脱脂,将粉末与蒸馏水按1∶20(g∶mL)的料液比在80 ℃水浴条件下浸提2次,经Sevag法除蛋白、乙醇沉淀、树脂脱色、分离纯化、透析及冻干,制得沙棘多糖,于干燥皿中保存备用。
1.3.2 酶解沙棘多糖的制备
参考方甜[15]的方法,并略作改动。称取100 mg冻干沙棘多糖,溶于超纯水,配制为1 mg/mL的母液。随后,向反应体系中加入果胶酶,并使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节至目标pH;设置不同酶添加量、时间、温度及pH进行酶解。反应结束后沸水浴10 min灭酶,8 000×g离心15 min,取上清液测定还原糖含量,以评估各因素对酶解效率的影响。在最优条件下酶解,灭酶离心后浓缩上清,加入无水乙醇4 ℃静置过夜,离心弃上清,沉淀经Sevag法除蛋白、分离纯化、冷冻干燥,即得酶解沙棘多糖。
1.3.3 还原糖生成量的测定
参考胡云飞等[16]方法,并略有改动。取0.5 mL 酶反应上清液、0.5 mL 超纯水和1.0 mL试剂依次加入试管,混匀后于沸水浴中反应5 min以终止酶反应并显色。冷却至室温,用超纯水定容至10 mL,于540 nm 波长下测定吸光度,平行测定3次。还原糖含量(质量分数)根据公式(1)计算得出:
还原糖含量
(1)
式中:C,根据吸光度值计算出的溶液质量浓度,mg/mL;V,样品总体积,mL;m表示样品的质量,g。
1.3.4 单因素试验
单因素试验的范围基于前期预实验结果确定。在预实验中,通过对各参数进行宽范围初步筛选,明确了其对还原糖含量具有显著影响的有效参数区间。在此基础上,设定了如下正式试验水平:酶添加量(600～1 100 U/g)、酶解时间(30～150 min)、酶解温度(30～70 ℃)和酶解pH值(3～7)对还原糖生成量的影响。
1.3.5 响应面实验
在单因素试验的基础上,以还原糖生成量为指标,选择酶添加量(700、800、900 U/g)、酶解时间(60、90、120 min)、酶解温度(40、50、60 ℃)和酶解pH值(4、5、6)根据响应面 Box-Behnken 设计原理,利用 Design Expert13.0.6 软件进行4因素3水平的响应面分析实验,实验设计见表1。
表1 响应面优化实验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface optimized experiment
水平因素酶添加量/(U/g)酶解时间/min酶解温度/℃酶解pH值-1700604040800905051900120606
1.3.6 ANN-GA建模实验
本研究基于Python语言与Pytorch框架,构建了用于优化沙棘多糖酶解工艺的ANN-GA模型。模型结构如图1所示,由1个输入层、2个隐藏层及1个输出层构成。输入层接收4个特征参数:酶添加量、酶解时间、酶解温度与酶解pH值;2个隐藏层分别包含12和18个神经元;输出层设1个神经元,用于输出以还原糖含量为主要指标的综合评价值(Y)。通过该模型预测得到的Y值,即为沙棘多糖酶解工艺的最优解。
图1 ANN-GA模型结构
Fig.1 Structure of the ANN-GA model
1.3.7 凝胶渗透色谱分析(gel permeation chromatography,GPC)
参考胡润锋等[17]的方法,并略作改动。采用凝胶渗透色谱法测定SBP和ESBP的分子质量。采用Agilent GPC/SEC高效液相色谱系统,配置THU-H2O色谱柱与示差折光检测器,以水溶液为流动相,流速为1.0 mL/min,进样量为50 μL。
1.3.8 体外抗氧化活性测定
1.3.8.1 DPPH自由基清除能力测定
参考李艾莲等[18]的方法,分别将SBP、ESBP溶液中加入0.2 mol/L的DPPH无水乙醇溶液,混匀后水浴25 ℃避光放置30 min,在517 nm波长处测定吸光度。以与多糖溶液相同浓度的维生素C溶液为阳性对照组。
1.3.8.2 羟自由基(·OH)清除能力测定
参考李艾莲等[18]的方法,将多糖溶液与9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水杨酸-乙醇及8 mmol/L H2O2溶液等体积混合,经37 ℃水浴反应30 min后,于510 nm波长下测定吸光度。以等浓度的维生素C溶液作为阳性对照。
1.3.9 NAFLD细胞模型及分组
1.3.9.1 细胞培养
本研究使用完全培养基[向DMEM基础培养基添加10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)青霉素-链霉素溶液双抗溶液配制而成]在37 ℃、5%(体积分数)CO2条件下培养HepG2细胞。细胞每2～3 d进行常规传代,所有后续实验均选用处于对数生长期的细胞。
1.3.9.2 造模及实验分组
为建立稳定的NAFLD模型,本研究采用不同浓度的油酸钠与棕榈酸钠混合溶液[c(OA)∶c(PA)=1∶2 ]对HepG2细胞进行梯度浓度诱导,该比例的选择基于既往研究[19]。该比例能有效模拟非酒精性脂肪性肝病进展中饱和脂肪酸比例升高的病理脂质环境。混合脂质比单一脂质更能协同诱导肝细胞脂质蓄积并伴随内质网应激和胰岛素抵抗等关键事件,是构建NAFLD体外模型的经典方法。同时,通过CCK-8法检测细胞活力变化,以明确不同游离脂肪酸(free fatty acids, FFAs)浓度对细胞增殖与活性的抑制作用,为后续确定适宜建模浓度提供依据。
实验分为正常组、模型组(250 mmol/L OA+500 mmol/L PA)、阳性对照组(辛伐他汀)、SBP组和ESBP组。
1.3.10 检测指标及方法
1.3.10.1 CCK-8试剂盒检测
参照1.3.9.1节细胞培养方法,将对数生长期细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板,经不同浓度药物干预24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液。继续孵育0.5 h,使用多功能酶标仪于490 nm波长下检测吸光度,以评估细胞活性。
1.3.10.2 总胆固醇(total cholesterol, TC)含量测定
参照1.3.9.1节方法,将对数期细胞以每孔5×105个/孔接种于12孔板中,经不同浓度药物干预24 h后,根据试剂盒制造商提供的说明进行后续操作。
1.3.10.3 甘油三酯(triglyceride, TG)含量测定
参照1.3.9.1节细胞培养”方法,将对数期细胞以每孔5×105个/孔接种于12孔板中,经不同浓度药物干预24 h后,根据试剂盒制造商提供的说明进行后续操作。
2 结果与分析
2.1 沙棘多糖酶解单因素试验
酶添加量对还原糖得率的影响如图2-a所示。500～800 U/g时,得率随酶添加量增加而显著提升。当酶添加量超过800 U/g后,得率增长趋于平缓,这主要因为在高酶量条件下,反应体系中的底物结合位点趋于饱和,过量的酶分子可能因空间位阻或聚集效应而增加体系黏度,反而抑制了有效的底物-酶结合与传质效率[20]。因此,综合效率与成本,确定800 U/g为最佳酶添加量。
a-酶添加量;b-酶解时间;c-酶解温度;d-酶解pH
图2 不同反应条件对还原糖含量影响
Fig.2 The effect of different reaction conditions on reducing sugar content
注:图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
如图2-b所示,30～150 min时,还原糖得率随反应时间延长而增加,这源于酶与底物的充分接触与催化。当反应时间超过150 min后,得率增长进入平台期,表明反应体系已趋近动态平衡,此时底物浓度下降与产物抑制效应成为主导因素[21]。基于反应效率与时间成本的综合考量,选择90 min作为最佳酶解时间。
如图2-c所示,还原糖得率随温度升高呈现先增后降的趋势,并于50 ℃时达到峰值。该现象符合一般酶促反应规律:在达到最适温度前,反应速率随温度升高而加快;当超过临界温度后,酶蛋白因热变性导致其空间构象发生不可逆改变,活性中心遭到破坏,催化效率因而急剧下降[22]。因此,综合反应动力学与酶稳定性,确定50 ℃为本体系的最适酶解温度。
酶解pH值通过改变酶活性中心的电离状态及底物分子构象,直接影响酶促反应速率。由图2-d可知,还原糖得率在pH值为4.0～5.0时显著上升,并于pH值为5.0时达到最大值,此后随pH进一步升高而明显降低。研究表明,过酸或过碱环境均会导致酶分子活性中心的关键残基质子化状态改变,降低其与底物的结合能力,甚至引发酶蛋白不可逆失活[23]。故选择pH值为5.0为最佳反应条件,以维持酶的最大催化活性。
2.2 沙棘多糖酶解响应面实验
2.2.1 响应面实验方差分析
基于单因素试验结果,选取酶添加量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)及酶解pH值(D)4个因素进行响应面优化。实验以还原糖含量为响应值,采用Box-Behnken模型进行4因素3水平的实验设计,结果见表2。
表2 响应面设计与结果
Table 2 Response surface design and results
实验号因素ABCD还原糖含量/%100-1-135.572100136.43000045.624000045.61510-1039.266101036.817001135.558-10-1033.629-1-10031.971001-1035.6411011032.14120-1-1036.5713-110032.0814000044.3315-100132.8616-101033.91171-10037.86180-10-134.9319010132.1620100-135.512100-1135.1222000045.5723-100-133.6524010-133.86250-10134.2826110034.22270-11036.3528001-135.2129000045.68
通过Design-Expert10软件对表2的实验结果进行回归拟合分析,得到酶解沙棘多糖还原糖生成量(Y)对酶添加量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)以及酶解pH值(D)的二元多项回归方程:Y=45.36+1.83A-0.99B-0.48C-0.20D-0.94AB-0.69AC+0.42AD-0.82BC-0.26BD+0.20CD-5.23A2-5.99B2-4.28C2-5.61D2。
基于方差分析(表3)可知,本研究所构建的模型极为显著(P<0.01)且失拟项不显著,证明模型可靠有效。通过对各因素F值的分析,确定了其对沙棘多糖降解效率的影响程度依次为:酶添加量(A)>酶解pH值(B)>酶解温度(C)>酶解时间(D)。该结果为工艺优化提供了明确方向,表明酶添加量与体系pH是决定酶解效率的关键控制参数,应在实际操作中予以优先精确控制。
表3 回归方程的方差分析
Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation
来源平方和自由度均方F值P值显著性模型537.801438.4186.69<0.0001∗∗酶添加量(A)40.22140.2290.78<0.0001∗∗酶解pH值(B)11.72111.7226.450.000 1∗酶解温度(C)2.8112.816.350.024 5∗酶解时间(D)0.464 110.464 11.050.323 5AB3.5213.527.930.013 7∗AC1.8811.884.240.058 7AD0.705 610.705 61.590.227 6BC2.692.696.070.027 3∗BD0.275 610.275 60.6220.443 4CD0.15610.1560.352 10.562 4A2177.151177.15399.81<0.000 1∗∗B2232.521232.52524.76<0.000 1∗∗C2118.61118.6267.66<0.000 1∗∗D2203.941203.94460.27<0.000 1∗∗残差6.2140.443 1失拟项4.87100.486 61.460.382 9纯误差1.3440.334 4总差54428
注：**为差异极显著(P<0.01);*为差异显著(P<0.05)。
2.2.2 响应曲面分析
如图3所示,酶添加量、酶解时间、酶解温度及酶解pH值两两组合所形成的响应曲面均呈现较为陡峭的坡度变化,表明这些因素之间存在显著的交互效应(P<0.05)。具体而言,酶添加量与酶解时间、酶解温度与酶解pH值等关键组合的曲面曲率尤为明显,说明这些因素组合对酶解效率具有协同影响,其交互作用不容忽略。该结果进一步证实了沙棘多糖酶解过程的复杂性,也为后续工艺优化中关键参数范围的精准控制提供了理论依据。
图3 响应面三维图分析
Fig.3 3D response surface plot analysis
2.2.3 ANN-GA优化酶解工艺
如图4～图5所示,经100次迭代训练后,ANN模型于第9轮达到最佳性能,训练集均方误差为0.027 627,且训练集、验证集、测试集的相关系数分别为0.950 64、0.905 2与0.943 25,整体R值达0.94 117,表明模型具有优异的预测精度与泛化能力。进一步采用GA全局寻优,获得最佳工艺参数为:酶添加量810.6 U/g、酶解时间90.1 min、温度51.3 ℃、pH值为4.8,对应还原糖得率预测值为47.7%。验证实验中,实际还原糖得率为48.9%,相对误差仅为1.2%,证实该模型能够精准捕捉非线性工艺特征,为多糖酶解过程的精准控制与高效转化提供了可靠的方法学支撑。
图4 人工神经网络模型均方误差效果图
Fig.4 Mean square error of artificial neural network mode
a-训练;b-验证;c-测试;d-全部
图5 人工神经网络模拟仿真效果图
Fig.5 Simulation effect of artificial neural network
a-SBP;b-ESBP
图6 SBP和ESBP的GPC分析
Fig.6 GPC analysis of SBP and ESBP
2.2.4 GPC分析
酶解前后分子质量的检测结果如图6和表4所示。由表4可知,经酶解处理后,沙棘多糖的分子质量由原来的1.57×103 Da显著下降至4.45×103 Da,降解率高达约97.2%。这一数量级上的显著差异(P<0.01)充分证实了该酶对沙棘多糖具有强烈的降解效率。有研究表明,生物酶能够通过水解糖苷键实现对大分子多糖的高效降解,而降解后的多糖具有更强的抗氧化活性、体外降血糖能力和体外降血脂能力[24]。
表4 SBP和ESBP的GPC分析
Table 4 GPC analysis of SBP and ESBP
名称SBPESBP分布指数Mw/Mn1.511.76数均分子质量Mn/Da1.57×1054.45×103重均分子质量Mw/Da2.37×1057.86×103Z均分子质量Mz/Da3.73×1051.29×104
2.2.5 体外抗氧化活性测试
由图7可知,沙棘多糖及其酶解产物对DPPH自由基、·OH的清除能力均呈现明显的剂量依赖性增强趋势。在相同浓度下,ESBP的清除率显著高于SBP。如图7-a所示,多糖质量浓度为1 mg/mL时,ESBP的DPPH自由基清除率比SBP的清除率高25.2%;如图7-b所示:多糖质量浓度为5 mg/mL时,ESBP的·OH清除率比SBP的清除率高12.19%。这些结果表明,酶解处理有效提升了沙棘多糖的体外抗氧化活性。这一增强效应可能源于酶解引发的多糖结构优化:一方面,糖苷键的断裂暴露出更多游离羟基,增加了可提供氢原子的活性位点[25];另一方面,分子质量的降低(表4)显著改善了产物的扩散效率,从而提高了其与自由基在溶液中的相互作用机率。综上所述,酶解处理通过改变沙棘多糖的分子结构与理化性质,进而强化了其自由基清除能力。
a-DPPH自由基清除率;b-·OH清除率
图7 SBP和ESBP对DPPH自由基、·OH的清除能力
Fig.7 DPPH and hydroxyl radical scavenging by SBP and ESBP
2.2.6 对HepG2细胞活力的影响
根据图8结果显示,FFAs对HepG2细胞存活率呈现浓度依赖性抑制作用。当OA和PA浓度分别达到250 mmol/L和500 mmol/L时,细胞存活率仍维持在90%以上,表明该浓度条件下细胞具有较好的代谢耐受性;而当浓度进一步提升至300 mmol/L OA和600 mmol/L PA时,则引发细胞存活率的急剧下降(P<0.0 001),显示明显的脂毒性效应。这一浓度响应关系与既往研究报道的脂肪酸诱导肝细胞脂质过载和内质网应激的机制相符[19]。同时,如图9所示,与对照组相比,OA与PA(浓度比为1∶2)处理显著升高了细胞内TG和TC含量(P<0.01),这为模型的成功建立提供了可靠的量化证据。为在建立脂肪肝细胞模型的同时最大限度保持细胞活性,后续实验选择250 mmol/L OA与500 mmol/L PA作为适宜建模浓度。
图8 FFAs对HepG2的毒性
Fig.8 Toxicity of FFAs to HepG2
注:*表示P<0.05;****表示P<0.000 1。
a-HepG2细胞内TG含量图;b-HepG2细胞内TC含量图
图9 SBP和ESBP对HepG2细胞内TG和TC含量的影响
Fig.9 Effects of SBP and ESBP on TG and TC contents in HepG2 cells
注:*表示与模型组对照相比差异显著(P<0.05);**表示与模型组对照相比差异极显著(P<0.01);###表示相同浓度下SBP组与ESBP组相比差异显著(P<0.001); ####,表示同浓度下SBP组与ESBP组相比差异极显著(P<0.0001)。
2.2.7 对NAFLD细胞模型的降脂活性
为评估酶解沙棘多糖对非酒精性脂肪肝细胞模型脂质代谢的影响,本研究检测了正常HepG2细胞、FFAs诱导模型组、SBP/ESBP干预组及辛伐他汀阳性对照组中TC与TG含量。结果如图9所示,ESBP浓度依赖性地显著抑制细胞内脂质积累,中、高浓度组与模型组相比差异显著(P<0.01),但在中、高浓度区间内效果无显著差异。在800 μg/mL条件下,ESBP能显著降低细胞内TC和TG含量,降幅分别达36.3%与46.1%。此外,ESBP的降脂效果整体优于SBP,并在特定浓度下表现出与辛伐他汀相近的调节潜力。上述结果表明,酶解处理能够显著增强沙棘多糖的降脂活性,其作用机制可能涉及调节脂肪酸氧化相关基因表达或抑制脂质合成关键酶活性,从而有效缓解肝细胞脂质代谢紊乱。
3 结论与讨论
本研究采用聚半乳糖醛酸-果胶酶对沙棘多糖进行酶法降解,通过RSM-ANN-GA多策略优化,建立了高效的降解工艺体系。最佳酶解条件为:酶添加量810.6 U/g、反应时间90.1 min、温度51.3 ℃、pH值为4.8,在此条件下还原糖生成量达48.9%。
凝胶色谱分析结果显示,酶解后沙棘多糖的分子质量由105数量级显著降低至103,表明成功制备出低分子量沙棘多糖,证实了酶法降解的有效性。体外活性评价进一步表明,酶解沙棘多糖相较于未处理样品,表现出更强的DPPH自由基和·OH清除能力。在800 μg/mL质量浓度下,ESBP对HepG2细胞的TC和TG清除率分别达到36.3%和46.1%。
综上所述,本研究证实,聚半乳糖醛酸-果胶酶可通过结构修饰有效改造沙棘多糖,从而增强其降脂护肝活性。该酶法修饰策略为提升多糖的理化特性与生物功能提供了关键路径,也为深入解析其构效关系及进一步开发应用奠定了坚实的理论基础。
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