随着人口的增长和生活水平的提高,食物垃圾的增加已成为全球日益关注的问题。食物垃圾通常产生自餐馆、蔬菜和水果市场、食品加工业以及家庭,其中水果和蔬菜垃圾占食物垃圾的42%[1],如何处理这些高产的蔬果废弃物成为了一个热门问题。垃圾酵素,亦称为“环保酵素”、“垃圾酶”,是由果蔬废弃物、红糖和水按一定比例混合后,避光厌氧发酵3个月以上得到的含有特定活性成分的复杂溶液,制备操作简单易行,且可在短期内实现较高的蔬果废弃物降解率,在实现垃圾减量化资源化方面是一项有效的生物处理解决方案[2]。此外,垃圾酵素发酵液中富含有机酸、蛋白质、蛋白酶、淀粉酶等活性成分,可通过合成、分解、转化、催化等途径发挥作用。同时大量研究表明,垃圾酵素在环境治理和农业生产等方面也有广泛应用,如生活污水处理[3]、城市污泥处理[4]、重金属累积[5]、催化堆肥[6]、抗菌剂[7]等。
前期研究发现,以不同废弃蔬果原材料制备的酵素,在理化性质、生物活性方面表现出显著差异[8]。而垃圾酵素的发酵过程涉及多种微生物的参与以及代谢产物的变化,与其功能息息相关。如在酵素中占据主导地位的变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)菌群,其在有机物降解和营养循环中发挥着重要作用[9]。发酵过程中微生物群落的代谢活动会导致多种代谢产物的生成,如挥发性脂肪酸、醇类和酯类化合物等,这些代谢产物对发酵产物品质有重要影响[10]。
目前关于垃圾酵素的研究更多集中在其应用上,对于发酵过程中微生物组成和代谢变化方面的研究不足,限制了对垃圾酵素功能成分的开发、推广和应用。因此,本研究以多种蔬果废弃物为原料制备的垃圾酵素为对象,采用高通量测序和非靶向代谢组学技术,分析比较垃圾酵素发酵期间的微生物组成和差异代谢物变化,结合其活性成分变化,以期为垃圾酵素功能成分在环境修复中的作用机制提供重要的科学依据,也可为其在实际应用中的优化提供科学指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苹果皮/核(包括坏果)、葡萄皮、橙子皮、香蕉皮、土豆皮、南瓜皮、圆白菜和大白菜黄叶/坏叶等8种蔬果废弃原料收集自周边菜市场;红糖(散装),超市采购;3,5-二硝基水杨酸、L-2-氯苯丙氨酸、牛血清白蛋白、福林酚等试剂,上海麦克林生化科技股份有限公司;羧甲基纤维素,天津市科密欧化学试剂有限公司;色谱纯甲醇等,Fisher公司;Power Soil®DNA提取试剂盒,美国Mo Bio Laboratories公司;凝胶提取试剂盒,美国Axygen Biosciences公司;TruSeq TM DNA样品准备试剂盒,美国Illumina公司;FastPfn Polymerase,北京全式金生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
SCIENTZ-10 N真空冷冻干燥机,宁波新芝冻干设备股份有限公司;NanoDrop 2000分光光度计,美国Thermo Scientific公司;PHS-25精密酸度计,上海雷磁公司;T100 Thermal Cycler PCR仪,美国BIO-RAD公司;JY600C电泳仪,北京君意东方电泳设备有限公司;UHPLC-Orbitrap Exploris 240超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱,美国赛默飞公司;HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.,18 μm),美国Waters公司;SBL-10DT超声波清洗机(300 W-10L),宁波新芝生物科技股份有限公司;Centrifge5430R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;NewClassic MF MS105DU电子天平,瑞士梅特勒公司。
1.3 实验方法
1.3.1 垃圾酵素的制备
本研究分别将苹果皮/核(包括坏果)、葡萄皮、橙子皮、香蕉皮、土豆皮、南瓜皮、圆白菜和大白菜黄叶/坏叶等蔬果原料的废弃物切碎混匀,各称取0.225 kg蔬菜/水果废弃原料(总质量为1.8 kg)与红糖(0.6 kg)、水(6 kg)按3∶1∶10的质量比置于10 L密封塑料容器中。充分搅拌混匀后将容器置于黑暗、通风良好的环境中进行垃圾酵素发酵。垃圾酵素发酵周期通常为3个月,发酵第1个月每日开盖放气并搅拌,后2个月密封厌氧发酵。每月采集1次酵素发酵液(分别记为M1、M2、M3),经3 500 r/min离心15 min后取上清液,将上清液分为2份,一份发酵液于4 ℃保存用于理化分析,另一份发酵液经冷冻干燥后用于微生物多样性和代谢组学分析。
1.3.2 垃圾酵素的理化性质分析
采用pH计测定采集的垃圾酵素各时期发酵液pH。采用GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》中的酸碱滴定法测定总酸含量,以乳酸当量计算。以牛血清白蛋白为标准物质,通过Lowry法测定发酵液中的蛋白质含量。淀粉酶活性采用Bernfeld的3,5-二硝基水杨酸法测定;以酪蛋白为底物,采用福林酚法测定蛋白酶活性;纤维素酶活性由水解羧甲基纤维素产生的葡萄糖量来确定。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)采用GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定》中修改的Marklund法测定;总酚含量采用福林酚法测定;总抗氧化能力和还原力的分析则参考钱籽霖[11]的方法。
1.3.3 垃圾酵素微生物多样性分析
采用Power Soil®DNA提取试剂盒提取冷冻干燥的不同垃圾酵素样品中的细菌和真菌DNA。然后用NanoDrop 2000分光光度计和10 g/L琼脂糖凝胶电泳确定提取的DNA的质量。为了探究发酵过程中微生物群落的变化,使用通用引物338F/806R扩增细菌16S rRNA基因的V3～V4高变区,使用通用引物ITS1F/ITS2R扩增真菌内部转录间隔区。使用凝胶提取试剂盒纯化PCR扩增产物,并按照制造商程序,使用TruSeq TM DNA样品准备试剂盒构建测序文库,在上海美吉生物公司的Illumina MiSeq PE300平台上进行高通量测序。测序数据按照LONG等[12]方法进行生物信息学分析。
1.3.4 垃圾酵素的代谢组学分析
将冷冻干燥后的样品经液氮研磨均匀后,取100 mg样品粉末加入800 μL提取液[含0.02 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸的80%(体积分数)甲醇溶液]混合均匀,5 ℃低温超声提取30 min(40 kHz)。将提取样品于-20 ℃静置30 min后,13 000×g,4 ℃离心15 min。取上清液进行LC-MS分析。色谱条件和质谱条件参照范蕊等[13]方法设定。
LC-MS原始数据经代谢组学处理软件Progenesis QI v3.0处理得到代谢物信息,并上传至美吉云平台(cloud.majorbio.com)进行分析。利用HMDB(Human Metabolome Database)化合物分类、KEGG通路富集、火山图等对代谢组数据进行差异分析。根据多组方差分析得到的偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)模型结果,以变量投影重要性指标(variable importance plot,VIP)≥1、P<0.05、差异倍数(fold change,FC)>2和FC<1/2标准筛选出显著差异代谢物。
1.4 数据分析
实验样品分析均设置4个重复,结果以平均值表示。采用SPSS 26.0和Origin 21、Adobe Illustrator 2020软件进行数据处理分析和绘图。
2 结果与分析
2.1 垃圾酵素发酵期间理化成分变化
垃圾酵素发酵期间理化成分变化如表1所示。垃圾酵素发酵1个月时,发酵液已呈酸性,后续持续发酵pH值差异不明显,基本维持在3.3左右。总酸含量为8.35～10.44 mg/mL,与pH呈相反趋势。垃圾酵素的总糖含量随发酵时间延长逐渐降低,由3 916.67 mg/L减少至3 440.00 mg/L。总酚含量在发酵期间均表现出逐渐升高趋势,上升比例为56.80%。蛋白质含量为55.49～57.87 mg/L。垃圾酵素具有多种酶活性,酶活性大小整体表现为:淀粉酶>蛋白酶>SOD>纤维素酶,淀粉酶发酵2个月时活性最高,为1 010.40 U/mL,较1个月时增加了3倍,而蛋白酶活性则在第2个月时最低。纤维素酶活性呈逐渐降低趋势,由83.60 U/mL降低至15.33 U/mL。SOD活性则相反,随发酵时间延长活性逐渐增加,3个月时活性比1个月时(11.59 U/mL)升高了2.40倍。垃圾酵素的总抗氧化能力(779.18～1 015.53 mg/mL)大于还原力(138.29～196.37 mg/mL),均在发酵第2个月时值最高。
表1 垃圾酵素发酵期间理化成分变化
Table 1 Changes in physicochemical components during the fermentation of garbage enzyme
参数M1M2M3pH3.243.373.30总糖/(mg/L)3 916.673 736.363 440.00总酸/(mg/mL)10.448.359.23总酚/(mg/L)301.83332.25473.27蛋白质/(mg/L)57.8755.4957.36纤维素酶/(U/mL)83.6028.9815.33SOD/(U/mL)11.5921.3927.86蛋白酶/(U/mL)354.39337.98364.05淀粉酶/(U/mL)337.201 010.40876.85总抗氧化能力/(mg/mL)779.181 015.53932.42还原力/(mg/mL)144.04196.37138.29
2.2 垃圾酵素发酵期间微生物种群变化
2.2.1 操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)
OTU物种分类统计结果显示,垃圾酵素样品中细菌总OTU数目为316,在发酵2个月时最大为264,发酵后期(3个月)仅有35。另外,垃圾酵素中真菌OTU数目低于细菌,仅有65 OTUs,整体差异不明显,但也呈逐渐减少的趋势。Venn图分析结果(图1)表明,垃圾酵素各时期共有的细菌和真菌OTUs分别为26和30。
a-细菌;b-真菌
图1 垃圾酵素样品细菌和真菌OTU分类统计
Fig.1 Bacterial and fungal OTU classification statistics of garbage enzyme samples
注:BM1、BM2、BM3:细菌,FM1、FM2、FM3:真菌。
2.2.2 微生物群落多样性指数变化
Chao1指数和Shannon指数可反映微生物群落的丰富度和多样性。垃圾酵素不同时间发酵液中微生物群落的丰富度和多样性均存在差异,在变化趋势上细菌呈先升后降,真菌则是先降后升(表2)。除第3个月外,细菌的Chao1指数和Shannon指数均显著高于真菌,细菌在第2个月时Chao1指数和Shannon指数最大,分别为271.194和2.359,是真菌的5.2和1.5倍。发酵3个月时细菌Chao1指数大幅度降低至53.500,而真菌的Chao1指数和Shannon指数均有所上升,且大于细菌的。说明垃圾酵素发酵过程中,前期发酵液中微生物群落以细菌占主导地位,随着发酵的进行,细菌逐渐减少,真菌开始占领优势。
表2 垃圾酵素不同时期的微生物多样性指数
Table 2 Microbial diversity indices of garbage enzyme at different periods
时期Chao 1指数Shannon指数细菌真菌细菌真菌M1143.60056.6001.9801.743M2271.19452.0002.3591.558M353.50056.0001.1941.703
2.2.3 垃圾酵素微生物群落组成变化
本次研究的垃圾酵素不同发酵时间的细菌和真菌群落组成变化明显。垃圾酵素样品中细菌群落共注释到20门、37纲、86目、138科、226属和289种。在门分类水平上,厚壁菌门、变形菌门是垃圾酵素发酵期间的优势菌门,相对丰度占比分别为47.32%～73.89%和24.41%～52.64%,共计占比大于98%(图2-a)。在发酵第1、2个月时厚壁菌门相对丰度占比最大,分别为68.09%和73.89%;变形菌门在第3个月时相对丰度最高,为52.64%。在属水平上,相对丰度大于1%的包括:乳杆菌属(Lactobacillus)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、克雷伯菌属(Klebsiella)、魏斯氏菌属(Weissella)、泛菌属(Pantoea)、Atopostipes、双芽孢杆菌属(Amphibacillus),其中乳杆菌属和醋杆菌属相对丰度占比最大,分别为45.71%～65.34%和19.60%～52.12%,乳杆菌属在发酵第2个月时最高,醋杆菌属则在第3个月时占优势,较第2个月时增加了32.52%(图2-b)。
a-细菌门水平;b-细菌属水平
图2 垃圾酵素不同发酵期的细菌群落组成
Fig.2 The composition of bacterial communities at different fermentation stages of garbage enzymes
酵素样品中真菌共注释到3门、9纲、13目、27科、33属、46种。在门水平上,子囊菌门(Ascomycota)为绝对优势门,在各时间相对丰度占比最高,均在99.98%以上(图3-a)。另外还注释到担子菌门(Basidiomycota),和一个未分类的门。真菌的优势菌属包括:毕赤酵母属(Pichia)、哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、unclassified_f_Dipodascaceae、念珠菌属(Candida)、伊萨酵母属(Issatchenkia),均隶属于酵母菌目,说明果蔬垃圾酵素的发酵过程中,真菌以酵母菌为主。从发酵时间上对比,哈萨克斯坦酵母属在第1个月时相对丰度最高(62.62%),第2个月时出现大幅度降低(减少至5.98%),第3个月时又增加至21.30%。毕赤酵母属则是在第2、3个月时占优势地位,相对丰度占比分别为59.63%和48.85%。unclassified_f_Dipodascaceae亦表现出先增后降的趋势。另外,念珠菌属丰度随发酵时间逐渐增加,由0.11%增加至10.96%(图3-b)。
a-真菌门水平;b-真菌属水平
图3 垃圾酵素不同发酵期的真菌群落组成
Fig.3 The composition of fungal communities at different fermentation stages of garbage enzymes
2.3 垃圾酵素发酵期间代谢产物变化
2.3.1 垃圾酵素发酵期间差异代谢物分析
垃圾酵素发酵液中共注释到1 029个代谢产物,分为11个大类,且在各发酵时间均具有相同的代谢物分类分布,均以脂类和类脂分子为主(35.57%),其次分别为苯丙烷类和聚酮类(15.06%)、有机氧化合物(14.87%)、有机杂环类化合物(12.63%)、有机酸及其衍生物(11.56%)等,有机氮化合物、木脂素、新木脂素及相关化合物和烃类化合物占比最少,仅占0.19%～0.87%。不同代谢物分类在表达量上呈现不同的变化趋势,如脂类和类脂分子、有机杂环类化合物等在发酵2个月时最高,苯丙烷类和聚酮类、有机氧化合物、木脂素、新木脂素及相关化合物等的表达量逐月降低,有机酸及其衍生物和烃类化合物则随发酵时间呈上升趋势(图4)。
图4 垃圾酵素不同时期代谢物分类的表达量变化
Fig.4 The expression levels of metabolites in different periods of the waste enzyme’s metabolism process
通过多组方差分析比较混合离子源模式下3个发酵时间样品代谢物间的差异性,以P<0.05,VIP>1为条件,共筛选到发酵期间的差异代谢物数量为565,其中差异极显著(P<0.01,VIP>1.5)的代谢物包括(Z)-5-[(5-甲基-2-噻吩基)亚甲基]-2(5H)-呋喃酮、硬脂酸聚烃氧(40)酯、1-己醇、二氢(神经)鞘氨醇、DG(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18:2(9Z,12Z)/0:0)、(3b,4b,11b,14b)-11-乙氧基-3,4-环氧-14-羟基-12-氰基-15-al-14-木糖苷、4 β -羟基川芎内酯E,5′((Z)-阿魏酰基)-3-(2′-甲基阿拉伯糖基木糖)、亚油酰乙醇胺、咖啡酸、洋芫荽黄素、黄曲霉毒素P1等23种(图5)。
图5 垃圾酵素不同时期差异代谢物的丰度变化
Fig.5 The changes in the abundance of metabolites in the waste enzyme at different stages
注:**表示0.001<P≤0.01,***表示P≤0.001(下同)。
将差异代谢物进行HMDB数据库比对,代谢物分类结果(图6)显示,垃圾酵素发酵期间的差异代谢物共分为11大类,分别为:脂类和类脂分子、有机氧化合物、苯丙烷类和聚酮类、有机酸及其衍生物、有机杂环类化合物、苯环类化合物、木脂素类化合物等等。其中脂类和类脂分子、有机氧化合物、苯丙烷类和聚酮类、有机酸及其衍生物等四类代谢物占比均在10%以上,脂类和类脂分子占比最大,为35.79%。例如硬脂酸聚烃氧(40)酯、1-己醇、(3b,4b,11b,14b)-11-乙氧基-3,4-环氧-14-羟基-12-氰基-15-al-14-木糖苷等12种显著差异代谢物均属于脂类和类脂分子,5’((Z)-阿魏酰基)-3-(2’-甲基阿拉伯糖基木糖)、咖啡酸、洋芫荽黄素属于苯丙烷类和聚酮类化合物,而VIP值最大的(Z)-5-[(5-甲基-2-噻吩基)亚甲基]-2(5H)-呋喃酮则属于有机杂环类化合物。
图6 垃圾酵素差异代谢物HMDB分类
Fig.6 The HMDB classification of differential metabolites of garbage enzymes
进一步比较各个发酵时间的差异代谢物情况。如图7(火山图)所示,M2与M1组间共筛选鉴定到差异代谢物264个,其中上调197个,下调67个;M3与M2组间则筛选鉴定出269个显著差异代谢物,其中上调101个,下调168个。发酵期间,占优势的代谢物中,有机酸及其衍生物以上调为主,上调比率为57.14%～61.76%,有机氧化合物则是一直呈下调变化,而脂类和类脂分子、苯丙烷类和聚酮类在发酵2个月时上调个数大于下调数,3个月时下调占比更大。与发酵第1个月相比,发酵2个月时变化差异极为显著的化合物包括(Z)-5-[(5-甲基-2-噻吩基)亚甲基]-2(5H)-呋喃酮、DG(18:2(9Z,12Z)/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/0:0)、焦谷氨酰缬氨酸、焦谷氨酰-异亮氨酸、球姜酮、4,10-十一碳二烯醛、槲皮素、DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、4-苯基-3-丁烯-2-醇等,除槲皮素发生下调外,其余代谢物均为上调。而(Z)-5-[(5-甲基-2-噻吩基)亚甲基]-2(5H)-呋喃酮、焦谷氨酰-异亮氨酸、硬脂酸聚烃氧(40)酯、焦谷氨酰缬氨酸、13-十四碳烯-2,4-二炔-1-醇、3,4,5-三羟基-6-[(2-苯乙酰)氧基]环己烷-1-羧酸、3-(4-异丙基苯基)丙醛、4,10-十一碳二烯醛、(5α,8β,9β)-5,9-环氧-3,6-巨豆二烯-8-醇等则在第3个月时发生了极显著的上下调。
图7 垃圾酵素各时期差异代谢物火山图
Fig.7 Volcanic diagram of metabolites during different stages of garbage enzyme
2.3.2 差异代谢物的代谢通路分析
为了解垃圾酵素发酵期间的差异代谢过程,将3个发酵时间的差异代谢物进行KEGG通路富集分析。所得差异代谢物共富集到109条通路,涉及5个一级分类,包括代谢、遗传信息处理、环境信息处理、有机系统、人类疾病,其中69.72%属于代谢,其次是人类疾病(11.93%)和有机系统(10.09%)。如图8所示,具有较高富集率(>0.1)和显著性(P<0.05)的差异物代谢途径有11个,其中类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、癌症的胆碱代谢的富集最为显著(P<0.001)。比较发酵3个月之间的代谢途径富集差异,图9结果显示,与第1个月相比,发酵2个月时类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、类固醇降解发生了显著改变(P<0.01);而与第2个月对比,第3个月时发生显著变化的代谢途径增多,包括与类黄酮生物合成(P<0.001)、半乳糖代谢、类固醇激素生物合成、逆行内源性大麻素信号传导、产热(P<0.01)、C5-二元酸分支代谢、系统性红斑狼疮、利什曼病、生物膜形成-铜绿假单胞菌(P<0.05)相关的途径,其中系统性红斑狼疮、利什曼病、生物膜形成-铜绿假单胞菌、逆行内源性大麻素信号传导4个代谢途径的富集程度最高(>0.1),类黄酮生物合成的富集显著性最大(P=0.001)。综合来看,垃圾酵素发酵时间的变化对类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等有显著影响,同时发酵后期也会涉及疾病方面的代谢途径。
图8 差异代谢物KEGG通路富集分析
Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis of differential metabolites
图9 垃圾酵素不同发酵时间的KEGG通路富集差异
Fig.9 Differences in KEGG pathway enrichment of waste enzyme samples at different fermentation times
3 结论与讨论
垃圾酵素是微生物以果蔬废弃物为有机组分,红糖为碳源,进行厌氧发酵所得的液体产物。垃圾酵素发酵过程中的代谢反应除了与发酵原料和发酵条件有关外,微生物的作用也是重要的影响因素。微生物可通过自身物质代谢(如分泌酶)分解原料,从而产生复杂的代谢产物[14]。
pH是反映酵素发酵成熟和品质的重要指标[15],通常认为垃圾酵素发酵成功的pH值为3～4,本次发酵所得的垃圾酵素pH值为3.24～3.37,与前人研究结果一致[6,16],且符合QB/T 5323—2018《植物酵素》中环保植物酵素的要求(pH≤4.5),说明垃圾酵素发酵完全。垃圾酵素具有较高的总酸含量(8.35～10.44 mg/mL),且含量变化与pH值呈相反趋势,这是因为果蔬废弃物在微生物作用下经完全发酵后会代谢产生大量酸类物质(如乙酸、乳酸等),致使发酵体系总酸含量增加,从而溶液pH值逐渐降低。且发酵期间乳杆菌属,醋杆菌属占绝对优势,这类微生物均会发酵产生酸类物质,使得发酵液pH值降低。代谢物注释结果也显示发酵液中含有11.56%的有机酸及其衍生物,而其中94%～95%的代谢物为氨基酸、多肽和类似物。食用酵素通常发酵7～14 d[15,17]就能符合食用植物酵素标准(如pH≤4.50),而垃圾酵素在发酵1个月时,pH值已达到3.24,也具有较高的蛋白酶、纤维素酶等活性成分含量(表1),说明垃圾酵素发酵周期可适当缩短,也可根据需求定向选择发酵时间以获取高目标活性成分,在后续的开发应用上可集中关注其工艺优化。
植物食品残渣/废弃物可作为营养保健品和功能性产品的重要来源[18],在食品加工行业更具应用潜力。与其他种类酵素发酵结果相似[8,16,19-20],垃圾酵素具有多种活性成分,包括蛋白质、还原糖、总酚、蛋白酶、淀粉酶、SOD、纤维素酶等,但因发酵原料的不同,其含量和变化规律存在差异。ARUN等[4]的研究表明,垃圾酵素是一类具有高附加价值的产品,其富含的蛋白酶、淀粉酶等活性可降低活性污泥中37.2%～38.6%的固体和99%的病原菌。淀粉酶和纤维素酶不仅可以分解生成β-葡萄糖,而且可用于生物乙醇等生物燃料的生产[1]。总酚、SOD等活性成分能为垃圾酵素提供抗氧化活性,消除外界环境带来的氧化胁迫。经研究证实,施加环保酵素可以缓解重金属对苋菜[5]、白菜[21]等带来的胁迫,促进蔬菜增长,降低蔬菜的重金属积累量,同时还能改变土壤肥力和微生物群落结构。
此外,微生物群落的组成在很大程度上影响了酵素的功能。本次研究的垃圾酵素微生物主要为乳杆菌属,醋杆菌属和酵母菌,这与他人对以蔬菜或水果为原料制备的酵素的分析结果基本一致[14,22]。这类微生物多是有益微生物,已作为发酵剂菌种普遍使用于食品加工行业,用于发酵工艺优化和提高产品品质上[20,23]。有研究表明,植物乳植杆菌的添加显著提高了复合蔬菜酵素的总酚、总黄酮含量及SOD、蛋白酶活性,且自由基清除能力、还原力和对大肠杆菌的抑菌能力均有明显增加[24]。王科杰等[25]从环保酵素液中筛选出乳酸菌、酵母菌和醋酸菌用于环保酵素的生物强化发酵,结果显示与自然发酵相比,生物强化发酵方式能缩短发酵时间,提高乳酸和醋酸等有机酸含量,增加发酵液的有效活菌数。另外常用作微生物源防腐剂和环保菌剂的微生物主要也是乳酸菌、醋酸菌这类发酵产酸菌[26],它们可通过产酸抑制有害微生物生长[27],如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等[19,24,26],从而使得发酵液不易腐败变质,延长使用周期[20,26],此外乳酸菌可有效去除硫化氢和氨气等恶臭气体,酵母菌可通过产香遮掩恶臭气体,被广泛应用于环境保护中[25]。变形菌门和厚壁菌门在垃圾酵素中占据主导地位,而这些菌群在有机物降解和营养循环中发挥着重要作用[9],从而促使垃圾酵素能改善污染土壤环境。此外,厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门等微生物也被发现在垃圾酵素介导的堆肥过程中发挥有效作用,可通过保留氮和加速堆肥过程,从而提高堆肥的质量[6]。乳杆菌属、醋杆菌属、酵母菌作为垃圾酵素的绝对优势菌群,为垃圾酵素的开发应用提供了可靠的菌种资源,后期可考虑从酵素液筛选出优势功能菌株或者将垃圾酵素液作为发酵前体强化制备工艺。
总酚含量(表1)随发酵时间逐渐延长,代谢物表达量上酚类化合物也呈上调变化,这是因为发酵过程中微生物会将复杂的大分子酚类物质转换成小分子物质,产生的酶类及有机酸会使酚类物质溶出并呈游离态[28],从而导致发酵过程中总酚含量上升。苹果、葡萄、橙子、土豆皮等原料富含多酚类化合物[18],这为微生物的发酵提供了充足的来源。而酚类物质具有一定的抗氧化活性和抑菌作用[29]。各时期的差异代谢物变化结果显示(图7),(Z)-5-[(5-甲基-2-噻吩基)亚甲基]-2(5H)-呋喃酮差异最为显著,且VIP值最大。该物质是一类噻吩化合物,相关研究表明含噻吩的化合物具有广泛的生物学特性,例如抑菌,抗病毒,抗/杀虫等[30],这可能也是垃圾酵素具有抑菌功能的原因之一。
类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等代谢途径在垃圾酵素发酵期间变化显著(图8),而黄酮类化合物是植物主要的次生代谢物之一,普遍存在于植物中。调查显示大部分蔬菜、水果类食物均含有黄酮成分,如柑橘类的黄酮醇、黄烷酮含量较高(>30 mg/100 g),浆果类水果的黄酮化合物种类最多,其中花色苷含量最高(>70 mg/100 g),其次是原花青素,而叶类和瓜类蔬菜含有较高的黄酮醇成分[31]。本次的垃圾酵素采用的蔬果(葡萄、橙子、香蕉、苹果、南瓜等)均含有较高的黄酮类化合物,这给发酵期间类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等代谢途径提供了充足的物质条件。而这类天然的黄酮化合物多与糖类结合成苷类,发酵体系中乳酸菌、醋杆菌等微生物消耗了糖类,可能促使了黄酮类化合物的游离。发酵期间,杨梅黄素、毛地黄黄酮、芹菜素、吡喃花青素A等黄酮类化合物出现显著的上调,槲皮素、3′-O-乙酰阿福豆苷等则是显著下调。研究表明,大多数黄酮类化合物均有较强的抗氧化自由基作用,黄酮醇表现出有趣的生物活性,包括抗氧化、抗菌、抗病毒等[32]。此外,黄酮类化合物参与植物的多种生物活动,可以保护植物免受不同的生物胁迫(植物-寄生线虫、真菌和细菌)和非生物胁迫(盐、干旱、重金属、低温等)[33]。这些都为垃圾酵素的环保应用提供了有力支撑。
除此之外,值得关注的是垃圾酵素发酵后期系统性红斑狼疮、利什曼病、生物膜形成-铜绿假单胞菌、逆行内源性大麻素信号传导等4个代谢通路的富集程度显著增高(图9)。高通量测序结果显示,在发酵液中存在一些铜绿假单胞菌属微生物(相对丰度占比为0.23%),这类微生物的存在可能促进了铜绿假单胞菌的生物膜形成。另外,发酵原料采用的是果蔬废弃物,坏果、烂菜叶等腐烂部分自身携带的有害微生物、病变物质可能导致了毒性代谢产物的累积。代谢通路分析显示,参与系统性红斑狼疮、利什曼病代谢通路的代谢物PS(18:0/18:1(9Z))(一种甘油磷脂类化合物),参与生物膜形成-铜绿假单胞菌通路的N-丁酰基-高丝氨酸内酯,在发酵3个月时均出现了显著的上调。目前关于果蔬酵素类发酵中毒性产物的相关研究甚少,其产生的原因尚不清晰。结合本次研究结果和应用安全性考虑,垃圾酵素的制备可控制发酵时间,缩短至1～2个月,同时接入乳酸菌、酵母菌等益生菌进行强化发酵,抑制有害微生物的生长,从而避免代谢毒性产物的累积。后续研究可通过多组学联用分析和验证垃圾酵素的潜在风险,并针对性的优化发酵工艺。
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