酱香型白酒的有机酸生成规律及其与酒醅理化指标以及微生物群落结构的相关性

酱香型白酒作为中国传统四大基础香型之一,其独特的“12987”生产工艺以及四高两长工艺特点,赋予了酒体幽雅细腻、回味悠长、空杯留香等典型风格[1]。然而,酱香型新酒普遍存在口感欠佳、辛辣刺激等问题,需经过长期陶坛贮存才能实现酒体醇厚、口感优雅的品质转变[2]。据报道,醛类氧化和酯类水解等反应会促使酒体乳酸、乙酸等有机酸含量显著增加,这些有机酸能够通过与乙醇分子形成氢键结合,有效降低乙醇的刺激感,使酒体口感更为柔和[3];还具有调节味觉平衡的功能,其酸性特征可以中和酒体苦味物质,并通过味觉协同作用增强酒体的甜味感知[4-5]。由此可见,有机酸种类及含量对酱香型白酒风味形成及品质塑造具有极其重要的作用。

现有研究表明,XIAO等[6]评估了白酒中乳酸与吡嗪类物质的感知交互作用,发现添加乳酸能显著降低四甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的嗅觉阈值,而2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-乙基-6-甲基吡嗪的嗅觉阈值则有所升高,为调控白酒风味提供了新认识。LYU等[7]研究指出,乳酸作为酱香型白酒中一种非挥发性有机酸,不仅是酒体酸味的主要贡献者,还会对白酒发酵过程中的微生物活性及香气物质生成产生重要影响,且其在酒中的含量远高于其他非挥发性有机酸。同时,提高非挥发性有机酸含量,有助于乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等酯类物质的形成。此外,非挥发性有机酸与氨基酸的协同作用还能通过改变酯类物质的溶解度和挥发性进一步提高酒体香气释放率。HE等[8]发现在酱香型白酒的第3轮和第4轮酒醅中,乳酸、乙酸、琥珀酸和柠檬酸是4种主要有机酸,并且随着总有机酸含量的上升,微生物生态网络复杂性会随之降低,此时会形成更多小模块以抵御高酸度带来的压力。除此之外,高酸度环境中的酒醅微生物风味物质的生成能力会受到一定影响。黄俊秋等[9]发现在酱香型白酒第5轮次堆积发酵过程中,外层、中层、内层酒醅的乳酸含量均为最高,并且在堆积5 d的内层达到最高值,为43.92 mg/g;其次是甲酸、乙酸、琥珀酸和苹果酸,这5种酸是该轮次堆积发酵中的主体有机酸。相关性分析结果显示,乳酸和甲酸是第5轮次堆积酒醅微生物的关键环境因子,不同醅层之间的有机酸与关键微生物的互作关系存在一定差异。赖昱成等[10]发现在13个不同贮存年份的酱香型白酒中,总有机酸含量均在2 000 mg/L以上。其中,乳酸含量相对稳定;乙乳比(乙酸/乳酸)随贮存年份的增加呈现先下降、后上升、再下降的变化趋势,在贮存12年的酱香型白酒中达到峰值。此外,贮存5年的酱香型白酒总有机酸含量最高,为3 053.50 mg/L,且以乳酸和乙酸为主。迄今为止,针对酱香型白酒的研究,多集中于微生物群落结构、理化特性及挥发性风味物质等方面,且研究对象以成品酒为主,而关于酱香型白酒各轮次酒醅中有机酸的含量及其相关性的研究鲜有报道。

本研究选取酱香型白酒7个轮次酒醅作为研究对象,系统分析了各轮次入窖及出窖酒醅的理化指标、有机酸含量与微生物群落结构,深入探究了发酵过程中乳酸、乙酸与理化特性、微生物群落之间的相关性,解析了与有机酸相关的理化指标及优势微生物,为优化酱香型白酒的发酵工艺参数、提升酒体品质稳定性提供了一定的科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1～7个轮次入窖及出窖酒醅,贵州珍酒酿酒有限公司。

氢氧化钠、硫酸、邻苯二甲酸氢钾、酚酞等均为分析纯,成都市科隆化学品有限公司;乳酸、乙酸均为分析纯(纯度>99.5%),北京化工厂有限责任公司。

1.2 仪器与设备

ICS-3000离子色谱分析仪,美国 DIONEX 公司;BSA224S电子分析天平,德国Sartorius公司;KQ100-DE超声波清洗仪,昆山市超声仪器有限公司;LR10-2.4A高速冷冻离心机,北京瑞邦兴业科技有限公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;DHG-9070A电热鼓风恒温干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酒醅样品采集

7个轮次入窖酒醅(即堆积后酒醅)的取样位点如图1-a所示,分别为表层(距堆面层酒醅0.1 m)、中层(距堆面层酒醅1 m)以及堆芯部分(距堆面层酒醅2 m),每层共有3个取样点,共计9个取样点;出窖酒醅的取样位点如图1-b所示,窖池分为窖面酒醅(距离顶层酒醅0.3 m处)、窖中酒醅(距离顶层酒醅1.2 m处)以及窖底酒醅(距离顶层酒醅2.7 m处),每层酒醅以5点取样法进行取样,共计15个取样点。将以上7个轮次的入窖和出窖酒醅样品分别采集后混合均匀,并立即密封装袋,随后放置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 酒醅基本理化指标的检测

酒醅水分含量、淀粉含量、还原糖含量及酸度的测定,参照黄俊秋等[9]的方法。

1.3.3 酒醅有机酸的检测

酒醅有机酸的检测参照蒙德俊等[11]的方法并稍作修改,具体如下。

前处理:精确称取5.00 g酒醅样品,置于100 mL离心管中,加入30 mL体积分数为40%的乙醇溶液,充分混匀。将混合液超声处理约30 min后,以3 500 r/min的转速离心5 min。取离心后的上清液100 μL,稀释200倍。再取1 mL稀释后的提取液,经0.45 μm有机滤膜过滤后,注入离子色谱仪,检测有机酸含量。

离子色谱条件:离子色谱柱采用Ionpac AS11-HC型分离柱(250 mm×4 mm);Ionpac AG11-HC型保护柱(50 mm×4 mm);柱温30 ℃;以Dione×ADRS 600(4 mm)为阴离子抑制器,抑制电流175 mA;进样量为25 μL。以淋洗液自动发生器产生的KOH溶液为流动相,淋洗液流速1.1 mL/min,梯度淋洗程序为:0～16 min,1.1 mmol/L KOH;17～29 min,16.5 mmol/L KOH,29～35 min,20.0 mmol/L KOH;35～39 min,35 mmol/L KOH,稳定 2 min后;41～47 min,50.0 mmol/L KOH,随后下降,在47.1 min 时KOH浓度降至1.1 mmol/L,稳定至52 min结束。

定性定量方法:配置乳酸与乙酸的混标溶液,含量分别为800.67、1 778.1 mg/L。检测时,将乳乙混标溶液分别按10、20、30、40、50、60倍进行梯度稀释,进样后获取各自的峰面积。每个样品均设置3个平行样,最终结果取其平均值。以ICS-3000检测得到的峰面积为纵坐标(y),标品质量浓度为横坐标(x),构建标准曲线,最终依据样品的峰面积计算其中有机酸的含量。

1.3.4 酒醅微生物群落结构的检测

酒醅微生物群落结构的检测参照BIAN等[12]的方法并稍作修改,具体如下。

采用 FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒提取酒醅微生物的DNA。通过琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行定量,以解析细菌和真菌的群落结构。细菌16S rRNA基因扩增采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC-TAAT-3′)。真菌ITS区扩增采用通用引物 ITS1FI2(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和 ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR 扩增条件如下:95 ℃预变性3 min,随后进行30个循环(95 ℃ 变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),最后72 ℃延伸10 min,之后冷却至10 ℃。

1.4 数据处理与统计分析

所有实验均重复3次,数据采用Excel 2022进行整理筛选,试验结果以“平均值±标准差”表示。用SPSS 27.0软件进行方差分析,通过SPSSPRO软件的Spearman相关性分析功能计算理化指标数据间的相关性系数,并绘制相关性系数热力图。利用Origin 2024软件制作折线图等。

2 结果与分析

2.1 七个轮次出入窖酒醅理化因素变化规律

酒醅理化特性是判断发酵是否正常的重要指标,7轮出入窖酒醅的理化特性存在明显差异,结果如图2所示。

酒醅水分含量过高,会使其质地过于紧实,透气性变差,进而导致厌氧型微生物大量滋生繁殖,不仅会引发明显的酸败现象,还会使蒸馏出的酒体口感下降;而酒醅水分含量过低时,由于无法满足大部分微生物生长所需的水分活度,会造成发酵过程出现异常。由图2-a可知,7个轮次出入窖酒醅的水分含量为40.34～52.79 g/100 g。从增长趋势来看,1～5轮次的水分含量呈逐渐上升趋势,到6～7轮次基本稳定在50～54 g/100 g,并且在前期的增长幅度最大,3～5轮次增长幅度稍缓,这一结果与万勇等[13]的研究结论高度相似。总体而言,出入窖酒醅的水分含量变化趋势基本一致,且出窖酒醅的水分含量略高于入窖酒醅,这是因为每个轮次入窖时,会向酒醅中添加大曲,从而降低酒醅整体的水分含量;而大曲中的微生物在酒醅中进行生长代谢会产生一定量的水分,使得出窖酒醅水分含量略有升高[14]。

酒醅中淀粉含量的高低是衡量出酒率的重要指标之一。酿酒原料中支链淀粉含量越高,高温堆积生成的还原糖就越多,而酵母菌、细菌等微生物利用还原糖会产生大量酯类、醇类等微量成分,使出酒率和风味物质含量相应提高[15]。由图2-b可知,7个轮次出窖酒醅淀粉含量依次为36.88、23.40、21.11、19.96、16.87、15.64、12.25 g/100 g,入窖酒醅淀粉含量依次为43.36、32.31、24.79、22.20、18.56、17.21、16.39 g/100 g。多轮次发酵后的酒醅淀粉含量降至较低水平,表明发酵进行得较为彻底。每个轮次的出窖酒醅在经过出甑、取酒、摊晾等处理后,会加入适量大曲,这不仅为窖内发酵提供了充足的微生物,还额外补充了一定量的淀粉[16]。总体而言,出入窖酒醅中的淀粉含量随轮次增加呈逐渐减少的趋势,其中1～3轮次减少幅度较大,特别是2轮次,出窖酒醅的淀粉含量降低了8.91 g/100 g,而4～7轮次的减少速度则有所减慢。其原因可能是前期酒醅投料量大,且微生物数量相对较少,酒醅酸度较低,使得微生物能迅速利用淀粉并快速生长代谢。而随着轮次的增加,酒醅中的酸度和水分逐渐升高,导致部分微生物生长与代谢速率减缓,淀粉消耗减慢[17]。此外,5～7轮次入窖酒醅中的淀粉含量低于20 g/100 g,淀粉含量较低也是造成消耗速率减慢的重要因素之一[18]。

酿酒原料及大曲中的淀粉会在淀粉酶的作用下转化为还原糖,微生物利用这些还原糖能产生乙醇及呈香呈味物质。因此,酒醅还原糖含量变化情况在一定程度上能够反映微生物的生长代谢及整体发酵情况[19]。由图2-c可知,7个轮次出入窖酒醅的还原糖含量波动较大,没有显著的规律性趋势,但入窖酒醅的还原糖含量均高于出窖酒醅,出现这一现象原因是高温堆积过程中,大曲及环境中富集的大量微生物将淀粉转化为还原糖[20]。从具体数值来看,入窖酒醅还原糖含量为1.5～3.2 g/100 g,其中1轮次酒醅的含量最低;出窖酒醅的还原糖含量为1.1～3.1 g/100 g,同样是1轮次酒醅的含量最低。

酒醅酸度对微生物生长代谢及发酵进程有着直接影响,控制酒醅入窖酸度是保障发酵正常进行的关键环节之一[21]。若入窖酸度过高,可能会抑制微生物的生长与代谢活动,进而导致白酒风味不足和出酒率下降;反之,若酸度过低,则容易促使杂菌大量滋生,造成升酸幅度过大,出现酸败现象[8]。由图2-d可知,7个轮次酒醅酸度为0.97～4.26 mmol/10 g,通常入窖酸度与出窖酸度通常呈正相关[22]。7个轮次的出入窖酒醅酸度均呈现出持续上升的态势,且出窖酒醅的酸度均高于入窖酒醅。通过分析各轮次出入窖酒醅的酸度差值发现,1轮次酒醅的酸度增长幅度最为显著,为2.05 mmol/10 g;相比之下,2～7轮次酒醅的酸度增长幅度相对较小,增长了0.27～0.62 mmol/10 g。因此,酒醅中的有机酸主要是在1轮次的发酵过程中生成的。原因可能是1轮次入窖酒醅(即造沙轮次)刚完成酱香型白酒的2次投料,此时酒醅淀粉含量处于最高水平,且高温堆积过程为乳植杆菌属(Lactobacillus)等产酸微生物的大量富集创造了有利条件,后续发酵产生的乙酸、乳酸等有机酸使得出窖酒醅酸度显著升高[23-24]。

2.2 七个轮次出入窖酒醅有机酸变化规律

2.2.1 两种有机酸标准曲线回归方程的建立

在离子色谱分析中,乳酸、乙酸的出峰时间分别为8.8、9.56 min。建立了2种有机酸的标准曲线,其中乳酸质量浓度为20～80 mg/L,乙酸为20～50 mg/L。所有标准曲线的相关系数(R2)均大于0.99,2种有机酸浓度与峰面积之间存在良好线性关系,表明该方法能够准确测定白酒及酒醅样品中的有机酸含量。

2.2.2 乳酸、乙酸及总有机酸含量的变化

酱香型白酒酒醅中的有机酸主要以乳酸和乙酸为主,因此本研究仅对乳酸、乙酸及总有机酸进行研究。结果如图3所示。由图3-a可知,总有机酸含量随着轮次推进整体呈上升趋势,为5 531.69～40 184.34 mg/kg,并且在前期和后期增长幅度较大。乳酸为不挥发性有机酸,对香气可能没有直接贡献,但对口味有较大影响[25]。乳酸含量变化与总有机酸趋势相似,是酒醅中含量最高的有机酸,7个轮次入窖酒醅乳酸含量分别为3 801.45、19 920.32、19 023.98、20 399.20、23 687.99、32 257.44、36 985.42 mg/kg。乙酸含量相对较低且波动较大,7个轮次入窖酒醅乙酸含量分别为1 467.24、1 082.37、2 841.67、2 076.80、2 197.68、3 127.12、2 974.35 mg/kg,大致呈现上升趋势,后续增长较缓,表明乙酸生成机制与乳酸不同,在发酵前期上升幅度较大,后期受某些因素影响未能大幅提升。由图3-b可知,出窖酒醅总有机酸含量在1～5轮次上升,5轮次后趋于平稳,表明酒醅微生物前期产酸能力逐渐提升,后期达到相对稳定状态,整体含量为23 354.69～42 698.89 mg/kg。乳酸含量趋势与总有机酸保持一致,表明乳酸发酵是主导产酸途径,并且前几轮次的温度、底物、微生物群落等发酵条件利于乳酸积累。7轮次出窖酒醅乳酸含量依次为16 875.69、21 250.57、20 162.75、25 967.22、33 874.31、31 478.49、36 859.94 mg/kg。乙酸含量相对低、波动明显,整体未随轮次大幅增长,受轮次影响小,7轮次出窖酒醅乙酸含量依次为4 532.84、3 135.09、3 238.84、3 412.80、4 246.36、3 832.94、3 901.76 mg/kg。整体来讲,乳酸、乙酸及总有机酸含量均随着轮次逐渐上升,后期趋于平稳,反映出酒醅在不同发酵阶段下,微生物产酸代谢能力存在差异。

2.3 七个轮次出入窖酒醅微生物菌群变化规律

2.3.1 出入窖酒醅微生物α多样性

微生物群落多样性通常通过α多样性指数(如Chao1、Shannon和Coverage指数)进行评估[26]。本研究对7个轮次、14个酒醅样品的微生物群落进行测序分析,结果如表2所示。所有样品的Coverage指数均接近1,表明测序结果足以评估样品中大部分的微生物群落范围,可代表样本真实情况。Chao1指数用于评估物种丰富度,Shannon指数则反映群落的物种多样性和均匀度[27]。从入窖酒醅微生物指数来看,细菌Chao1指数在第1轮次最高,表明该轮次细菌丰富度最高;而真菌的Chao1指数在第3、4轮次达到峰值,说明真菌在这2个轮次中物种数最多。此外,细菌和真菌的Shannon指数均在第3轮次最高,表明该轮次微生物群落的多样性和均匀度最高。在出窖酒醅中,细菌和真菌的Chao1及Shannon指数均在第6轮次达到最高值,说明该轮次出窖酒醅的微生物丰富度和多样性最为突出。测序结果表明,不同发酵轮次的酒醅微生物群落结构存在显著差异,其中第3轮次(入窖)和第6轮次(出窖)的微生物多样性最为丰富。

2.3.2 出入窖酒醅细菌群落结构分析

不同轮次出入窖酒醅的微生物群落结构存在显著差异,1～7轮酒醅细菌的相对丰度如图4所示。

由图4-a可知,入窖酒醅中的优势菌门(至少在1个轮次酒醅中相对丰度>5%)包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteriota)。在前4个轮次中,厚壁菌门占据主导地位,但整体呈逐渐下降趋势,其中1轮次酒醅中该菌门的相对丰度最高,达93.23%;而到了5～7轮次,其占比则明显减少,这一结果与谢丹等[28]的研究结果高度一致。变形菌门是酱香型、浓香型、清香型等多种白酒酿造过程中的重要菌门[29],其在酒醅中的相对丰度呈上升趋势,从1轮次的4.24%逐步增加至6轮次的77.47%。此外,放线菌门的最高相对丰度出现在7轮次,为29.25%,但在其他轮次中丰度较低。

由图4-b可知,7个轮次入窖酒醅细菌属水平的优势细菌属有9种,包括乳植杆菌属、片球菌属(Pediococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、广州克罗彭施泰特氏菌(Kroppenstedtia)、醋杆菌属(Acetobacter)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、劳尔氏菌属(Ralstonia)以及大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)。其中,乳酸菌在白酒等发酵食品中发挥着关键作用,它能产生细菌素、过氧化氢、有机酸等多种具有抗菌活性的代谢产物,对病原体具有较强的抑制作用;同时,酿酒酵母与乳酸菌的共同作用会促进酯类物质的形成,增加酒体风味复杂性[30-31]。乳植杆菌属在1轮次酒醅中的丰度最高,达81.57%,而在之后的6个轮次中,其丰度急剧下降,均处于3%以下。芽孢杆菌属在酱香型白酒酿造过程中发挥着重要作用。该菌属通过代谢合成吡嗪类化合物,能与白酒中的其他风味物质产生协同效应,有效增强酒体的香气复杂度、丰富口感层次,显著提升白酒品质[32]。值得注意的是,在7个发酵轮次中,芽孢杆菌属在第2轮次酒醅中的相对丰度达到峰值(75.48%),在其他轮次中未呈现明显规律性。片球菌属是一种具有低pH耐受性的乳酸菌,是白酒发酵中的主要功能贡献者,可以促进酒体风味化合物的合成[15]。片球菌属的相对丰度较低,均在3%以下。据报道,广州克罗彭施泰特氏菌能分泌大量的淀粉酶,间接促进了三羧酸循环,因此与草酸、乳酸、琥珀酸和苹果酸等酸类物质呈正相关[33]。广州克罗彭施泰特氏菌的最大丰度出现在4轮次,为16.91%。除此之外,其他5种优势菌属的相对丰度变化无明显趋势,具体代谢机制需要进一步研究论证。

由图4-c可知,在7个轮次出窖酒醅的细菌群落组成中,厚壁菌门占据绝对主导地位,各轮次相对丰度均超过95%,平均丰度高达98.72%。作为米香型、浓香型和芝麻香型等白酒发酵过程中的关键菌门,厚壁菌门在不同发酵阶段发挥着重要作用[24]。此外,变形菌门是唯一其他相对丰度超过2%的细菌门,但仅在第1、5、6、7轮次酒醅中被检出。

由图4-d可知,出窖酒醅优势细菌属有6种,分别为乳植杆菌属、魏斯氏菌属(Weissella)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、广州克罗彭施泰特氏菌、片球菌属和芽孢杆菌属。由此可见,产乳酸细菌在出窖酒醅中被大量检出,这类微生物在产乳酸的同时,还会产生醇、酮、长链脂肪酸等其他风味物质[34]。在入窖酒醅中,乳植杆菌属在第1轮次占比很高,但在之后2～6轮次中占比明显较少,但出窖酒醅与之相反,第1轮次中几乎检测不出,而在之后6个轮次中占主导地位。同样,王玉荣等[35]对酱香白酒第4轮次出窖酒醅的研究中检测出的绝对优势菌属为乳植杆菌属,其平均相对含量高达91.59%。另外,魏斯氏菌属在第1轮次中为主导地位,而后6个轮次出窖酒醅中相对丰度较低。而这2个细菌属在7个轮次出窖酒醅中的相对丰度排名靠前,且均为乳酸产生菌,因此,7个轮次出窖中的细菌群落以乳酸产生菌为主。分析其原因可能是因为酒醅经窖内发酵后,乳酸含量高,对较多微生物的生长繁殖有一定抑制作用,而乳酸菌耐酸能力较强。另外,片球菌属与魏斯氏菌属变化趋势相似,仅在第1轮次出窖酒醅中占比稍高,由此可推测乳植杆菌属的耐酸能力较魏斯氏菌属和片球菌属强。

2.3.3 出入窖酒醅真菌群落结构分析

对不同轮次酒醅的真菌类群进行了高通量测序分析,结果如图5所示。

由图5-a可知,子囊菌门(Ascomycota)作为影响有机酸、碳水化合物和脂肪酸等关键代谢产物的重要功能菌门[36],在7个轮次入窖酒醅中均占据绝对优势,各轮次相对丰度均超过95%。相比之下,毛霉门(Mucoromycota)的丰度显著较低,仅在第3轮次入窖酒醅中出现相对明显的富集,为2.5%,其余轮次占比均低于1%。

由图5-b可知,入窖酒醅中的8个优势真菌属分别为伊萨酵母属(Issatchenkia)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、热子囊菌属(Thermoascus)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、嗜热真菌属(Thermomyces)和烟草镰刀菌(Monographella)。其中酵母菌属(包含5个种)表现出显著的丰度优势,除第3轮次(71.01%)外,其余轮次总占比均超过90%。除此之外,具有耐高温特性和高产乙醇潜力的伊萨酵母属在多数轮次中占据主导地位[37],除第2～4轮次外,其相对丰度均超过50%。毕赤酵母属在第2(72.80%)和第3轮次(48.06%)相对丰度较高,其他轮次占比不足10%。虽然热子囊菌属、接合酵母属、假丝酵母属、嗜热真菌属和烟草镰刀菌等功能菌属的相对丰度较低,但作为大曲发酵和白酒酿造过程中的关键功能微生物[38],在产酶、乙醇合成及风味物质形成等方面发挥着重要作用。

由图5-c可知,出窖酒醅的真菌群落结构与入窖酒醅呈现高度相似性,子囊菌门在7个轮次中均占据绝对优势地位。除第7轮次外,该菌门在其他轮次的相对丰度均超过90%。这一发现与茅台镇酱香型白酒发酵过程的微生物研究结果高度相似[39]。担子菌门(Basidiomycota)作为相对丰度第二的真菌,在各轮次中的占比均低于5%,表现出相对稳定的低丰度特征。现有研究表明,子囊菌门和担子菌门共同构成了酱香型白酒发酵体系的核心真菌群落,两者的协同作用对白酒特征风味的形成具有重要贡献[40]。

由图5-d可知,7个轮次出窖酒醅中真菌属有5种,包括罗萨氏菌属(Rasamsonia)、红曲霉属(Monascus)、热子囊菌属、曲霉属(Aspergillus)、嗜热真菌属,与入窖酒醅真菌属水平相比,共存的优势真菌属仅有热子囊菌属、嗜热真菌属,而酵母菌属在各轮次出窖酒醅中占比明显减少,分析其原因可能是因为酒醅发酵后期酸度较高,酵母菌生长受到抑制,占比明显减少。罗萨氏菌属作为大曲优势菌属,不仅具有产糖苷水解酶和辅助氧化还原酶的能力,还与己酸乙酯、庚酸乙酯等酯类合成密切相关[38]。红曲霉属能分泌酯化酶、淀粉酶和蛋白酶,对白酒特征香味的形成至关重要[41]。热子囊菌属作为嗜热属,是高温大曲的核心功能菌,具有产纤维素酶和木聚糖酶的能力[41]。从相对丰度来看,出窖酒醅真菌属水平中,罗萨氏菌属占比最高,其平均相对丰度为27.62%,其次为红曲霉属和热子囊菌属,分别为14.67%和14.4%。

2.4 酒醅有机酸与理化指标以及微生物群落结构的相关性分析

有机酸的组成与含量对酱香型白酒的理化特性、风味特征及微生物群落结构具有重要影响。研究表明,高酸环境不仅会降低挥发性风味物质的浓度,还会抑制酒醅中淀粉的利用效率。并且随着酸度升高,微生物多样性呈现下降趋势,高酸胁迫会降低微生物生态网络的复杂性,但能增强其稳定性[8]。在酱香型白酒酒醅中,乳酸和乙酸作为含量最高的2种有机酸,对发酵过程具有关键调控作用。然而,关于酒醅相关指标与有机酸含量相关性的研究仍较为缺乏,为深入探究这2种有机酸与酒醅理化特性及微生物群落的相互作用关系,本研究基于Spearman相关性分析(|ρ|>0.5,P<0.05),在属水平上对酒醅微生物进行了系统研究,具体结果如下。

2.4.1 酒醅有机酸与理化指标的相关性分析

在实际生产中,水分、酸度等关键理化参数常被用作评估发酵进程和酒体品质的重要指标。因此,本研究通过对7个轮次入窖和出窖酒醅的乳酸含量、乙酸含量、总有机酸含量与理化指标进行相关性分析。如图6所示,影响乳酸生成的主要理化因素包括水分、酸度、淀粉和还原糖含量。乳酸含量与酒醅酸度(P<0.05)和还原糖含量(P<0.05)呈显著正相关,与水分(P<0.01)和淀粉含量(P<0.05)呈负相关。相比之下,乙酸与其他理化指标的相关性较弱,与酸度(P>0.05)和还原糖(P>0.05)呈正相关,与水分(P>0.05)和淀粉含量(P>0.05)呈负相关。此外,总有机酸与还原糖和酸度均呈显著正相关(P<0.05),与水分和淀粉呈显著负相关(P<0.05)。

2.4.2 酒醅有机酸与微生物群落结构的相关性分析

在酱香型白酒生产过程中,有机酸合成主要来源于微生物代谢活动[42]。本研究通过分析入窖及出窖酒醅微生物群落结构与乳酸、乙酸含量的相关性,结果如图7所示。乳植杆菌属作为主要产乳酸菌,与魏斯氏菌属、片球菌属和酵母属等微生物呈现显著正相关,与芽孢杆菌、醋酸杆菌(Acetobacter)等菌属呈负相关。乙酸合成则主要与乳酸杆菌、醋杆菌属相关,并受到魏斯氏菌属、片球菌属、芽孢杆菌属、劳尔氏菌属、酵母属、伊萨酵母属以及毕赤酵母属等微生物的共同影响。乳酸合成与劳尔氏菌属、伊萨酵母属、红曲霉属、丝衣霉属(Byssochlamys)和乳植杆菌属呈正相关,与魏斯氏菌属、片球菌属和酵母属等菌属呈负相关。此外,假丝酵母属、植物乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)和短乳植杆菌属(Levilactobacillus)等微生物也与乳植杆菌属和醋杆菌属表现出较强的相关性,表明这些微生物可能通过协同作用共同参与了酒醅有机酸的代谢过程,但具体相关机制有待进一步论证分析。

3 结论

本研究检测了酱香型白酒发酵过程中酒醅有机酸含量、微生物群落结构和理化特性,并建立三者之间的相关性。研究结果表明,7个轮次酒醅中的入窖及出窖理化指标变化规律相似,酒醅水分和酸度随轮次增加,还原糖含量总体呈现先上升后下降趋势,而淀粉含量持续减少,且于第1、2轮次减少速率最快。酒醅乳酸、乙酸及总有机酸含量随轮次增加,乳酸是主要有机酸,约占总有机酸90%,总有机酸含量的增加主要体现在第1轮次发酵过程中。入窖酒醅细菌属水平中的优势菌属有9种,乳杆菌属在第1轮次的入窖酒醅中占绝对优势,真菌属水平中优势菌属有8种,酵母属占比最高。出窖酒醅优势细菌属水平有6种,以乳酸菌为主。真菌属水平中优势菌属有5种,罗萨氏菌属的平均相对丰度最高。相关性分析结果表明,乳酸含量与酒醅酸度、还原糖含量呈显著正相关,乙酸与酒醅理化性质的相关性较弱。此外,乳植杆菌属、魏斯氏菌属、片球菌属、红曲霉属和丝衣霉属等菌属与乳酸相关性较强;魏斯氏菌属、片球菌属、芽孢杆菌属、醋杆菌属、植物乳植杆菌和短乳植杆菌等菌属与乙酸有较强的相关性。

然而,本文主要聚焦于主要有机酸与优势微生物类群的关系,没有详细研究中低丰度微生物,随着发酵过程的进行,它们可能对理化性质和风味物质等方面产生积极影响。后续研究可进一步深入探讨不同发酵阶段功能微生物的代谢特征及环境因子对微生物群落演替的调控机制,旨在为建立更为完善的酱香型白酒品质调控理论体系提供一定的数据支持。

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