酱香型白酒作为中国传统固态发酵蒸馏酒的典型代表之一,以其“酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长”的品质特征享誉全球[1]。酱香型白酒采用“12987”工艺,即周期为1年、采用2次投料、9次蒸煮、8次发酵、7次取酒[2],其中堆积发酵环节是决定酒体风味的关键操作。堆积发酵采用开放式的固态发酵过程,酒醅与环境微生物充分接触,微生物在高温环境下快速生长代谢,产生多种酶类和代谢产物,这些物质进一步通过复杂的生物化学反应逐步转化为酒醅中的风味物质,并最终影响基酒的风味特征[3]。由于不同轮次的基酒在风味上各有特点,如前序轮次清爽醇甜,中后序轮次酱香浓郁[4],因此解析各轮次基酒风味物质与堆积发酵酒醅中微生物的关联作用及其影响因素,对于阐明酱香型白酒轮次基酒风味物质的生成机制具有重要意义。
近年来,随着高通量测序技术和宏基因组学的发展,研究者对酱香型白酒堆积发酵过程的微生物群落结构组成有了更加深入地认识[5]。并且,GC-MS、LC-MS等技术已广泛应用于酱香型白酒风味成分的分析。据相关研究报道,目前已鉴定出酱香型白酒中1 874种风味物质,包括酯类、醇类、醛酮类、有机酸、含氮化合物等,其中酯类物质赋予酒体果香和酯香,吡嗪类化合物是形成酱香的关键成分[6]。在此基础上,研究者进一步结合多元统计分析方法表明微生物与风味物质的关联分析是揭示酱香型白酒风味形成机制的有效方法之一。WU等[7]对不同轮次微生物及基酒风味的差异进行研究发现,窖池发酵酒醅中裂殖酵母、厌氧酵母、有孢圆酵母等与酯类物质的相关性最高,苯乙酸乙酯、十二烷酸乙酯与乳杆菌属显著负相关,在5、6轮次中细菌对酯类合成的贡献不显著。宋建阳等[8]发现窖池发酵过程酒醅中曲酶菌和嗜热真菌与己酸乙酯具有较强相关性,拟杆菌属和乳杆菌与乙酸乙酯具有较强相关性,与陈卓等[9]的研究报道结果一致。此外,蒙德俊等[10]发现7轮次基酒中毕赤酵母(Pichia)和酿酒酵母(Saccharomyces)与乳酸呈现显著相关性,片球菌(Pediococcus)与乙酸显著相关。可见,目前关于基酒风味物质与微生物群落相关研究主要集中于窖池发酵过程中,较少有关于堆积发酵过程酒醅微生物群落对基酒风味化合物的关联性研究报道,多集中于酒醅微生物与酒醅风味化合物的关联性研究。
课题组前期的研究中已发现堆积发酵酒醅中的微生物与酒醅风味物质形成具有密切关联作用,如酵母菌主要与丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇等醇类物质呈显著正相关,而霉菌和细菌与酸类和酯类物质的形成呈显著正相关,并且还受到水分、酸度、温度等理化因子的调控[11]。并且,已有研究报道堆积发酵不同生态位点的微生物群落组成和酒醅中的代谢产物存在差异。YANG等[12]通过研究1～6轮次酱香酒堆积过程中微生物群落结构发现,堆积中心酒醅多样性和丰富度均高于表层酒醅,优势细菌由乳酸杆菌(Lactobacillus)变为醋酸杆菌(Acetobacter),真菌属Pichia逐渐被假丝酵母(Candida)取代,pH和水分分别是堆积表层和中心层酒醅微生物群落构建的主要环境驱动因子。陈岭等[13]发现酱香白酒堆积过程中表面糟醅发酵产酒四甲基吡嗪含量最高,中层糟醅产酒中丙三醇含量最高。然而,堆积发酵过程中微生物群落组成、酒醅挥发性代谢物、基酒风味物质三者间的内在关联机制尚未明晰。
造沙轮次作为投粮轮次与首次取酒轮次(1轮次酒),是唯一个同时涉及润粮和取酒环节的轮次酒醅,其高温堆积过程直接影响后续窖内发酵进程及1轮次基酒的风味物质形成基础[14]。紧接其后的1轮次堆积,因其物料状态、温湿度以及微生物演替的差异,会直接决定2轮次基酒的风味代谢产物。并且,造沙和1轮次由于高粱破碎度低,酒醅原料较为饱满,使得糖化堆疏松,传热效果较好,一般不会进行翻堆操作[15],这就更加有助于了解其堆积过程中的微生物演替规律,进一步了解堆积酒醅中代谢产物的差异[16],明确其各自对基酒的影响机制,对于调控堆积工艺、优化基酒品质、理解轮次差异形成规律具有至关重要的理论与实践意义。基于此,本研究利用高通量测序、气相色谱-氢火焰离子化检测器(gas chromatography-flame ionization detector,GC-FID)、液液微萃取-气相色谱-质谱联用技术(liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,LLME-GC-MS)技术,并结合多元统计分析,解析酱香白酒造沙及1轮次微生物群落演替模式及驱动因素的差异,基于两个轮次的特征性微生物群落,探究堆积结束时酒醅中微生物对轮次基酒风味的潜在贡献,以期为深入理解造沙和1轮次基酒风味差异形成的早期根源提供理论数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品采集
酒醅取样:酒醅均取自贵州省遵义市某酱香型酒厂2025年生产年度造沙及1轮次高温堆积过程。鉴于两个轮次堆积时长存在差异,本研究依据酒醅堆积过程中的温度变化(见电子版增强出版附图1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044031,下同)进行取样,造沙取1、2、3、4 d样品,1轮次取1、3、5、7 d样品,发酵过程包括完堆(WD)、堆积前中期(ES)、堆积中后期(LS)以及下窖(XJ)4个阶段。为保证采样的均一性,取样方式见电子版增强出版附图2,将每个阶段6个点位的共48个样品采集后立即装入无菌袋,并在-80 ℃冰箱中保存。
A-细菌门水平;B-细菌属水平;C-真菌门水平;D-真菌属水平
图1 堆积发酵过程中细菌和真菌在门、属水平相对丰度图
Fig.1 The relative abundance of bacteria and fungi at the phylum and genus levels during the accumulation and fermentation process
A-细菌NMDS分析;B-细菌Lefse进化分支图;C-细菌LDA值柱状图;D-真菌NMDS分析;E-真菌Lefse进化分支图;F-真菌LDA值柱状图
图2 堆积过程中造沙、1轮次微生物差异性分析
Fig.2 Shows the analysis of sand formation and microbial differences in the first round during the accumulation process
基酒取样:一口窖池分为上中下层进行烤酒,结合实际下窖方式,造沙及1轮次堆积结束时,A和B点酒醅进入下层窖池,C和E点酒醅属于中层窖池,D和F点为窖池上层酒醅。每层分别取2瓶50 mL基酒,实验室常温密封保存。
1.1.2 主要试剂
DNA提取试剂盒,美国OMEGA BioTek公司;聚合酶链式反应引物,上海翌圣生物科技股份有限公司;氯化钠、磷酸二氢钾(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;乙醚、正己烷、无水乙醇(均为色谱纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸、2-辛醇(纯度均≥99.0%),默克化工技术(上海)有限公司;乙酸、乳酸、己酸、丁酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙缩醛、糠醛、苯甲醛、正丙醇、丁醇、异戊醇、苯甲醇、苯丙酸乙酯、苯乙醇、十三酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯等标准品(纯度≥99.0%),阿拉丁试剂(上海)有限公司。
1.2 仪器与设备
SB25-12DT超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;KG-AP32L自动蒸汽灭菌器,日本ALP 公司;ETC811 PCR仪,北京东胜创新生物科技有限公司;DYCZ-21电泳仪,北京市六一仪器厂;FR-1000凝胶成像系统,上海复日科技有限公司;GC 8890气相色谱仪、1260 高效液相色谱仪、CP97723 CP-Wax 57 CB 毛细管柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司。
1.3 实验方法
1.3.1 理化参数及乙醇含量检测
根据朱安然等[17]方法对酒醅酸度、还原糖、水分和淀粉含量进行测定;使用温度杆测定糖化堆每个取样点的温度;酒醅乙醇含量使用生物传感器进行测定。
1.3.2 挥发性风味物质的定性定量分析
1.3.2.1 酒醅风味骨架成分GC-FID检测
称取10 g酒醅于50 mL离心管中,加入20 mL体积分数53%乙醇溶液中超声处理30 min,离心后用0.22 μm有机系滤膜过滤,准确吸取1 mL溶液加入10 μL内标(297.46 mg/L叔戊醇、297.59 mg/L乙酸正戊酯和302.37 mg/L 2-乙基丁酸),混匀备用。气相色谱条件为:CP97723 CP-Wax57 CB毛细管柱(50 m×0.25 mm,0.25 μm),进样口温度230 ℃,进样量10 μL,分流比50∶1,升温程序为:40 ℃保持3 min,1.5 ℃/min升温至70 ℃,不保持,再以2 ℃/min升温至80 ℃,不保持,最后以7.5 ℃/min升温至215 ℃,保持20 min;载气流速为0.3 mL/min。
1.3.2.2 基酒微量及吡嗪成分LLME-GC-MS检测
吸取2 mL酒样于25 mL具塞试管中,并加入饱和氯化钠溶液将基酒稀释至10%酒精度,再分别添加10 μL 2-辛醇(终质量浓度:19.82 mg/L)和2-甲氧基-3-甲基吡嗪(终质量浓度20.23 mg/L)内标溶液,最后加入2 mL萃取剂[V(乙醚)∶V(正己烷)=1∶1]进行萃取,漩涡振荡1 min,待溶液分层后吸取1 μL上层有机相进行上级检测。GC-MS条件1:采用不分流模式进样,流量为1 mL/min,升温程序设置如下:起始温度40 ℃,保持1 min,以8 ℃/min升温至80 ℃,接着以2.5 ℃/min升温至115 ℃,再以8 ℃/min升温至155 ℃,再以5 ℃/min升温至220 ℃,最后以5 ℃/min升温至230 ℃。采用SIM模式采集数据,溶剂延迟设为7 min。GC-MS条件2:采用不分流模式进样,流量为1 mL/min,升温程序设置如下:起始温度40 ℃,保持1 min,以2.5 ℃/min升温至100 ℃,保持1 min,再以3 ℃/min升温至160 ℃,最后以5 ℃/min升温至230 ℃,保持10 min。采用SIM模式采集数据,溶剂延迟设为8 min。
1.3.3 总DNA提取、扩增和高通量测序
将所有样品送至上海生物工程有限公司基于Illumina Miseq平台进行高通量测序,细菌对16S rRNA基因V3～V4区扩增测序,采用通用引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC);真菌对ITS3～ITS4区扩增测序,采用通用引物ITS3(GCATCGATGAAGAACGCAGC)和引物ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)[18]。PCR扩增条件为:95 ℃预变性3 min;94 ℃变性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,25次循环,72 ℃终延伸5 min降至4 ℃。PCR反应体系为:2×Hieff®Robust PCR Master Mix15 μL,正向及反向引物各1 μL,DNA模板20～30 ng,使用ddH2O补齐体系至30 μL。
1.4 数据分析
微生物分类注释基于UNITE和Silva数据库,Chao1和Shannon指数等α-多样性分析利用QIIME软件进行分析。利用Origin2020软件对微生物相对丰度进行绘图,使用联川生物平台(https://www.omicshare.com/tools)进行微生物多样性、线性判别差异分析(linear ediscriminant analysis fffect size,LEfSe)、主成分分析(principal component analysis,PCA)、非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling,NMDS)、火山图(volcano plot)的绘制,使用R语言(v.4.5.0)进行冗余分析(redundancy analysis,RDA),使用simca(v.14.1)进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)以考察挥发性化合物的显著性差异,采用SPSS 24.0计算斯皮尔曼相关性系数,并用Gephi(v.0.10.1)绘制共现网络图,使用Cytoscape(v.3.8.0)可视化微生物群与挥发性物质之间的相关系数。
2 结果与分析
2.1 α-多样性指数分析
为揭示堆积发酵过程中的微生物动态演替规律,基于Illumina Miseq平台对堆积过程中的酒醅进行的多样性分析。经高通量测序和质量控制,共获得5 740 539有效细菌序列和2 225 691有效真菌序列。采用Chao1和Shannon指数计算了不同样品的α-多样性指数。Chao1指数用于衡量对象的物种丰富度,Shannon指数同时表征群落内物种分布的多样性和均匀度。如附图3所示,造沙堆积阶段酒醅细菌的Chao1指数低于1轮次,而Shannon指数高于1轮次,表明造沙轮次细菌多样性低于1轮次,而细菌群落分布均匀度高于1轮次。同理,造沙轮次真菌Chao1和Shannon指数均大幅高于1轮次,这表明造沙轮次真菌群落多样性与分布均匀度都高于1轮次。
A-造沙轮次;B-一轮次
图3 造沙及1轮次堆积过程微生物共现网络分析
Fig.3 Microbial co-occurrence network analysis during the stacking process of ZS and the first fermentation cycle
注:红色代表正相关,绿色代表负相关;蓝点代表细菌,黄点代表真菌;点越大代表其连线越多,越小则连线越少;连线越粗代表相关性越大,越细则代表相关性越小。
2.2 堆积发酵过程中微生物多样性及动态变化
经分类学注释后,选取相对丰度大于1%的微生物进行丰度分析,在门水平上共检测到主要微生物包括6个门,其中细菌3个门,真菌3个门。芽孢杆菌门(Bacillota)在造沙和1轮次都为主要优势菌门(图1-A)。对于真菌,造沙不同堆积阶段样品子囊菌门(Ascomycota)的丰度为98.01%、99.53%、99.15%、99.82%,1轮次堆积酒醅样品中主要优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)和毛霉菌门(Mucoromycota),其不同堆积阶段酒醅样品Mucoromycota丰度依次为80.77%、27.78%、40.28%、55.26%。
进一步分析微生物在属水平上相对丰度,筛选优势微生物(1%～10%)和绝对优势属(>10%)。克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)是绝对优势细菌属,在两个轮次的堆积阶段丰度都超过10%,已有研究报道Kroppenstedtia属于嗜热菌属,在其他菌无法正常生长的高温下仍保持高水平的活性[19]。在造沙完堆酒醅中,醋酸菌属(Acetobacter)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)相对丰度分别为21.80%和27.95%,而至下窖时,其相对丰度下降为3.91%和0.11%,这是因为随着堆积时间延长酒醅的温度升高,使得不耐高温菌属死亡。1轮次堆积过程中细菌演替变化较少,Kroppenstedtia、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)的优势地位从完堆持续到堆积结束(图1-B),这和课题组前期分析结果相似[20],表明核心细菌组成在时序上具有一定的稳定性。在真菌属水平上,造沙绝对优势菌为德尔布有孢圆酵母属(Torulaspora)和Pichia,前者相对丰度从37.82%下降至24.33%,而Pichia则从46.13%上升为73.88%。1轮次堆积过程中绝对优势菌为Torulaspora和分枝横梗霉属(Lichtheimia),相对丰度总和超过了90%,Lichtheimia是白酒发酵初期淀粉糖化的关键功能菌株之一,能够产生丰富的糖化酶。至堆积结束时,Torulaspora相对丰度为44.02%,Lichtheimia为54.31%。可见,Kroppenstedtia作为耐热菌属在两个轮次中丰度均较高,Virgibacillus在1轮次占据绝对优势,而在造沙中丰度极低,这表明其可能与1轮次中重要的代谢产物相关。Torulaspora是两个轮次共同存在的优势真菌属,Pichia是造沙堆积酒醅中占比最高的真菌,是酱香型白酒中主要优势菌属,而在1轮次中却未检测出,1轮次中绝对优势真菌演替为Lichtheimia,Pichia相比Lichtheimia对环境条件要求更加严苛,1轮次酒醅中温度、酸度与乙醇等理化因素可能更加有利于Lichtheimia的生长和繁殖,使其能够迅速占据生态位,称为绝对优势真菌。
2.3 造沙和一轮次堆积过程酒醅差异菌属分析
为了进一步分析造沙及1轮次在堆积过程中的差异微生物,根据Bray-Curtis对两个轮次堆积微生物进行了NMDS分析(图2-A、图2-D),结果表明两个轮次细菌和真菌群落距离较远,微生物差异较大,1轮次堆积过程真菌群落演替变化大于造沙,同一个堆积阶段过程中不同位点的微生物差异较小。结合Lefse分析对两个轮次的特征微生物进行分析(图2-B、图2-C、图2-E、图2-F),根据线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)值大于4.0,属水平共筛选出17种微生物。造沙差异微生物为醋酸杆菌属(Acetobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Pichia、植物乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、Kroppenstedtia、拟青霉属(Paecilomyces)、嗜热真菌属(Thermomyces)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、红曲霉属(Monascus)和嗜热子囊菌属(Thermoascus)。而Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、乳杆菌属(Lactobacillus)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、Lichtheimia和Torulaspora为1轮次差异微生物。结合图3可知,造沙及1轮次不同堆积阶段微生物存在较大差异。其中Wickerhamomyces具有较高的产乙醇以及产酯的能力,能够在较高乙醇和酸度环境下存活。Oceanobacillus和Zygosaccharomyces为1轮次堆积酒醅中主要差异菌,其中Zygosaccharomyces具有耐乙醇和高耐酸的能力,能够产生酸类物质[21],可能是导致造沙和1轮次酒醅中挥发性代谢产物存在差异的原因。
2.4 微生物相互作用分析
在造沙轮次(图3-A)发现62种微生物属共210对强相关,其中细菌占比59.68%,真菌占比为40.32%,微生物属的相互作用以正相关为主,占比90.95%,负相关仅有9.05%。1轮次中(图3-B)微生物菌属之间的显著关系少于造沙轮次,仅发现有24个菌属间32对显著相关,这表明造沙堆积过程中酒醅微生物存在强生态互作,结构更加稳定,其中细菌占比为87.5%,真菌占比为12.5%,正相关占比为53.12%,负相关为46.88%。并且,在造沙轮次中,连接度最高的节点数量为20个,在1轮次中,则为8个。定义连接度大于等于最高连接度一半的节点为共生微生物,即造沙轮次连接度≥10,1轮次连接度≥4。根据此标准,造沙轮次共有20个共生微生物,1轮次共有6个共生微生物,其可能在微生物群落演替中起重要作用,相互作用强烈。进一步分析可知,Lichtheimia、高温放放线菌属(Thermoactinomyces)、Oceanobacillus属于两个轮次共有的微生物,具有重要的作用。对于造沙轮次,Lichtheimia与Aspergillus、Thermomyces、Bacillus、Kroppenstedtia等耐高温菌呈现正相关,与Pichia呈现负相关;Virgibacillus与主要优势微生物都呈现正相关。而对于1轮次,Lichtheimia与Oceanobacillus、Scopulibacillus强正相关,与Thermoactinomyces、Acetobacter、Companilactobacillus呈现负相关;Zygosaccharomyces与Oceanobacillus表现出负相关关系,与Thermoactinomyces正相关。
2.5 不同轮次核心微生物
将普遍存在的微生物(即在堆积过程中每个阶段都存在的微生物)、绝对优势微生物以及相互作用强烈的共生微生物进行组合,确定了共4种标志微生物(附图4)。造沙为Bacillus和Kroppenstedtia,1轮次为Lichtehimia以及Oceanobacillus,将这4种微生物与差异微生物结合,分别得到两个轮次的核心微生物,造沙轮次共11种分别为Bacillus、Kroppenstedtia、Acetobacter、Sphingomonas、Lactiplantibacillus、Pichia、Thermoascus、Thermomyces、Paecilomyces、Wickerhamomyces、Monascus,1轮次为7种分别为Lichtehimia、Oceanobacillus、Bacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Zygosaccharomyces、Torulaspora。这些菌属在两个轮次微生物演替、酒醅挥发性物质以及基酒风味形成都起着重要的作用。
A-细菌群落与理化因子RDA;B-真菌群落与理化因子RDA
图4 两个轮次微生物群落与理化因子RDA
Fig.4 RDA analysis of microbial communities in two fermentation cycles with respect to physicochemical factors
2.6 微生物群落与理化因子相关性分析
为了揭示驱动微生物演替的主要理化因素,利用RDA分析了优势细菌属和真菌属与6个环境因子之间的关系,包括水分、还原糖、淀粉、酸度、乙醇含量和温度。理化因子对两个轮次的微生物群落影响差异显著。由图4可以看出,群落分布在两个轮次间存在较大的分离,再次表明造沙、1轮次堆积酒醅细菌群落和真菌群落存在差异。在细菌方面,造沙堆积酒醅与淀粉呈正相关,与水分、酸度呈负相关,1轮次堆积酒醅与水分和酸度含量呈正相关,与淀粉含量呈负相关。在真菌方面,造沙堆积酒醅与淀粉存在极大正相关性,1轮次与酸度、水分和还原糖含量呈正相关,这与环境因子对细菌群落的影响是一致的。
通过斯皮尔曼相关分析发现,堆积过程中,两个轮次理化因子与主要微生物(丰度前18)之间的相关性存在显著差异(P<0.05)。在造沙中,共识别出73对存在显著相关性,在1轮次中,共鉴定出77对相关性显著(附图5)。在细菌方面,乙醇含量与大部分菌群存在相关性,在两个轮次中,与Oceanobacillus、Scopulibacillus、Thermoactinomyces存在显著负相关(P<0.01),而这3种菌属与还原糖含量呈现显著正相关(P<0.05),这是因为随着堆积发酵的进行,酒醅中乙醇含量升高,导致微生物生长受到抑制,但是因为堆积发酵前期乙醇含量低,能高效利用还原糖的菌群快速占据生态位点。Thermoactinomyces在1轮次与乙醇呈显著正相关(P<0.01)。温度与1轮次堆积酒醅中Fructilactobacillus、Thermoactinomyces、Companilactobacillus呈极显著正相关(P<0.001),而造沙细菌与其相关性较低(P≥0.05)。Scopulibacillus在两个轮次与酸度都呈现显著正相关(P<0.05)。在真菌方面,造沙除温度外的理化因子与大部分菌群存在显著相关性(P<0.05),而在1轮次中仅有乙醇含量、温度和酸度与主要菌群相关性显著(P<0.05),水分与淀粉含量与菌群相关性较低(P≥0.05)。Pichia与两个轮次堆积酒醅的乙醇含量存在极显著正相关性(P<0.001),有研究报道毕赤酵母具有较高的产乙醇能力。生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、根毛霉属(Rhizomucor)、Monascus、Aspergillus、Themoascus、Paecilomyces、Thermomyces与乙醇含量呈显著负相关(P<0.01),表明这些菌中在高乙醇环境下生长会收到抑制。Rhizomucor、Monascus、Thermoascus、Paecilomyces、Thermomyces在两个轮次中与酒醅酸度呈显著正相关(P<0.05),Pichia与酸度都呈现出显著负相关(P<0.01),这与YANG等[22]研究结果一致。淀粉是造沙堆积过程中主要驱动因素,1轮次堆积酒醅中微生物驱动因素为水分和酸度,乙醇和还原糖是部分堆积阶段的影响因素,由于高粱中淀粉含量较高,进一步反映了造沙由于混入高粱原料对群落结构影响较大。
A-主成分分析;B-挥发性物质环形热图;C-挥发性物质总量变化;D-酸类总量变化;E-酯类总量变化;F-醇类总量变化
图5 酒醅挥发性物质含量分析
Fig.5 Analysis of volatile substance content in Jiupei
A-基酒挥发性成分PLS-DA;B-模型置换验证;C-VIP>1的核心挥发性风味物质;D-两个轮次基酒的差异代谢物火山图
图6 基酒挥发性物质成分分析
Fig.6 Analysis of volatile components in base liquor
注:A图中1、2、3分别代表上层、中层、下层基酒。
2.7 不同轮次堆积过程酒醅中挥发性成分对比
为描述堆积过程中酒醅挥发性物质的变化规律,采用气相色谱对造沙及1轮次堆积样品挥发性物质进行了分析,结果如图5所示。主成分分析表明两个轮次堆积过程酒醅的挥发性风味特征差异较大,两个坐标轴对挥发性物质的解释率分别为97.71%和1.46%,这意味着可以模型较为可靠。共检测出29种挥发性物质,乙酸含量占比最大,在造沙轮次中3-羟基-2-丁酮含量远高于1轮次酒醅,醛类物质主要为乙醛,在两个轮次含量相差较少。两个轮次酒醅中挥发性物质总量均呈现出下降的趋势,1轮次整体含量高于造沙,完堆时为1 271.56 mg/L,至下窖降为611.80 mg/L。酯类物质含量最少,堆积结束时两个轮次酒醅中酯类物质均低于50 mg/L。值得注意的是,酸类和醇类物质作为酯类的前体物质,在堆积过程中整体也呈现出下降的状态,1轮次酒醅中醇类物质高于造沙。表明酱香型白酒堆积过程并不是积累挥发性物质的过程,甚至出现了含量下降的状态。
结合火山图(附图6)分析可知[P<0.05,变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1,FC(fold change)阈值为1.4,造沙酒醅中特征挥发性物质有4种,分别是乙酸异戊酯、3-羟基-2-丁酮、油酸乙酯及棕榈酸乙酯;1轮次为丁酸、1,2-丙二醇、戊酸、苯乙酸乙酯和异戊醛。
2.8 不同轮次基酒中挥发性成分差异性分析
对造沙及1轮次酒醅进行蒸馏分别得到1轮次和2轮次基酒,采用GC-MS技术对两个轮次基酒中挥发性成分进行分析。共检测出97种挥发性物质,包括酯类33种、醇类15种、酸类8种、醛酮类14种、吡嗪类9种、其他类物质18种。两个轮次代谢产物存在差异,组间差异相对较小。R2X、R2Y、Q2分别为0.773、0.999、0.991,R2和Q2均大于0.5,表明模型预测的结果可用。经过200次排列验证,Q2的截距小于0,这表明模型不是过度拟合的。图6-D显示了两个轮次之间共有25种差异代谢物(P<0.05,VIP>1,FC阈值为1.4)。上调的1轮次基酒代谢产物有10种,包括2-戊醇、2-戊酮、1-辛烯-3-醇、甲醇、丙醛、丙醇、丁酸乙酯、己酸丁酯、3-辛醇和丙酸。2轮次基酒中上调代谢产物有15种,其中包括5种吡嗪类物质、糠醛、5甲基-2-糠醛和1种2-乙酰基呋喃,其中吡嗪是酱香型白酒中重要的呈香呈味物质,被认为是酱香的特征物质。
2.9 核心微生物与酒醅、基酒中差异代谢物之间相关性分析
进一步对核心微生物与酒醅和基酒的挥发性物质进行斯皮尔曼相关性分析(|R|>0.50且P<0.05)。在造沙轮次,酒醅中丙酸、戊酸、异戊醛和苯乙酸乙酯与核心微生物关联度最高,其中丙酸与Lactiplantibacillus和Pichia负相关(P<0.05),而与Thermoascus、Monascus、Thermomyces、Paecilomyces、Kroppenstedtia、Bacillus显著正相关(P<0.05),差异代谢物3-羟基-2-丁酮与Monascus、Thermoascus、Thermomyces呈现负相关(P<0.05),与Acetobacter显著正相关(P<0.05)。在基酒中丙酸也占据着重要作用,其与Thermomyces显著负相关(P<0.05),与Pichia显著正相关(P<0.05),这与酒醅相关性相反,这可能是因为高温堆积阶段嗜热真菌能够产生丙酸等物质,而进入窖池厌氧发酵后,Thermomyces生长受到抑制[23]。酒醅与基酒中1,2-丙二醇与Thermomyces呈现显著正相关(P<0.05),与Pichia呈现负相关(P<0.05),这也体现了高温堆积阶段对窖池发酵和基酒风味物质生成的重要性。Pichia和Thermomyces与基酒中挥发性成分关联程度最大,其中Pichia与基酒中2-戊醇呈现负相关(P<0.05),与丙醇呈现正相关性(P<0.05),而在2轮次基酒中丙醇与Zygosaccharomyces呈现负相关性(P<0.05),1轮次基酒中正丙醇含量一般为7个轮次之最,这与WANG等[24]研究结果一致,较高的高级醇含量会对人体造成不利影响;Kroppenstedtia与酒醅中戊酸呈现正相关(P<0.05)(图7-A)。在1轮次中,Zygosaccharomyces和Torulaspora与代谢物联系度最高,前者与基酒中meso-2,3-丁二醇、苯乙酸乙酯呈现出显著正相关(P<0.05),与酒醅中异丁醛正相关(P<0.05);酒醅和基酒中苯乙酸乙酯与Torulaspora均呈现负相关(P<0.05),堆积阶段与窖池阶段相关性相同。
A-标志微生物与造沙轮次堆积酒醅及1轮次基酒相关性分析;B-标志微生物与1轮次堆积酒醅及2轮次基酒相关性分析
图7 标志微生物与挥发性物质斯皮尔曼相关性分析
Fig.7 Spearman correlation analysis between indicator microorganisms and volatile compounds
注:连线的颜色表示正(红色)或者负(蓝色)显著相关,连线越粗代表相关性越大,越细则代表相关性越小;节点越大表明其连线越多,越小则表明连线越少;蓝色点代表标志微生物,黄色点代表基酒中挥发性物质,绿色点表示酒醅中挥发性物质;三角形代表显著差异挥发性物质,圆形代表非显著差异挥发性物质。
酒醅和基酒中辛酸与Zygosaccharomyces均呈现出显著负相关(P<0.05)。Bacillus与基酒中2-戊酮和丙酸均呈现出负相关(P<0.05);Virgibacillus与基酒中2-乙基吡嗪呈现出显著负相关(P<0.05),与酒醅中异戊醛也存在负相关性(P<0.05);Oceanobacillus作为1轮次堆积酒醅中的核心微生物,与酒醅中3-羟基-2-丁酮、乙醛和乙酸异戊酯呈现显著负相关(P<0.05),与辛酸和乙酸正相关(P<0.05)(图7-B)。
3 结论
本研究通过对造沙和1轮次堆积不同阶段酒醅的微生物组成、理化性质、酒醅及基酒风味的相关分析,系统解析了两个轮次高温堆积发酵过程中微生物群落构成差异及其驱动力。1轮次基酒共检测出11种显著差异挥发性物质,2轮次检测出15种,属水平上造沙轮次共鉴定出核心微生物11种,1轮次7种。1轮次基酒中正丙醇、2-戊酮、丙醛、丁酸乙酯和己酸丁酯与Pichia正相关(P<0.05),与Thermomyces呈负相关(P<0.05),2-戊醇显著相关性则相反。在2轮次基酒中,异丁醇与Torulaspora显著正相关(P<0.05),和Zygosaccharomyces呈现显著负相关(P<0.05),乙酸己酯和5-甲基-2-乙酰基呋喃与Lichtheimia呈现显著负相关(P<0.05),其中5-甲基-2-乙酰基呋喃阈值极低,具有协同增效作用,与吡嗪类共同构成酱香型白酒的“烘烤香”和“焦糊香”特征[25],苯乙酸乙酯与Torulaspora呈显著负相关(P<0.05),和Zygosaccharomyces呈显著正相关(P<0.05),3-羟基-2-丁酮与Bacillus呈现显著负相关性(P<0.05),其也被称为乙偶姻,是2,3-丁二酮(双乙酰)的直接前体物质,能够增加白酒的陈香感。内消旋-2,3-丁二醇与Zygosaccharomyces显著正相关(P<0.05),能够中和白酒的辛辣刺激感,赋予酒体“绵甜”“醇厚”的感官特征。本研究为理解造沙及1轮次堆积过程中酒醅微生物、酒醅挥发性代谢化合物、基酒风味物质三者之间的关系提供了理论依据,并进一步分析了造成两个轮次堆积酒醅中微生物及其基酒挥发性物质差异的原因和影响因素,有助于阐明酱香型白酒的高温堆积工艺对基酒风味物质的生成机制。
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